Summary
Tagging door de extracellulaire domeinen van membraanreceptoren met superecliptic pHluorin, en imaging deze fusie-receptoren in gekweekte muis neuronen, kunnen we direct visualiseren individuele vesiculaire inbrengen gebeurtenissen van de receptoren aan het plasmamembraan. Deze techniek zal instrumenteel ophelderen van de moleculaire mechanismen voor insertie receptor naar de plasmamembraan.
Abstract
Een beter begrip van de mechanismen die receptor handel tussen de plasmamembraan (PM) en intracellulaire compartimenten vereist een experimentele benadering met een uitstekende ruimtelijke en temporele resoluties. Bovendien moeten deze benadering ook de mogelijkheid aan receptoren gelokaliseerd op de PM dan in intracellulaire compartimenten onderscheiden. Vooral detecteren receptoren in een vesicle heeft uitstekende detectiegevoeligheid, aangezien elke vesicle draagt slechts een klein aantal receptoren. Standaardbenaderingen voor de behandeling receptor handel zijn oppervlak biotinylering gevolgd door biochemische detectie, die zowel de vereiste ruimtelijke en temporele resolutie mist en fluorescentiemicroscopie onderzoek immunolabeled oppervlakte receptoren, die chemische fixatie van cellen vereist en daardoor ontbreekt voldoende tijdsresolutie 1-6. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben wij en anderen ontwikkeld en gebruikt een nieuwe stragie waarmee visualisatie van de dynamische invoeging van receptoren in de PM met uitstekende ruimtelijke en temporele resolutie 7-17. De aanpak omvat tagging van een pH-gevoelige GFP, de superecliptic pHluorin 18, de N-terminale extracellulaire domein van de receptoren. Superecliptic pHluorin heeft de unieke eigenschap dat bij neutrale pH fluorescerende en niet-fluorescerende bij zure pH (pH <6,0). Dus de gelabelde receptoren niet fluorescerende wanneer binnen de zure lumen van intracellulair verkeer blaasjes of endosomale compartimenten en zij gemakkelijk zichtbaar wanneer blootgesteld aan de extracellulaire neutrale pH omgeving op het buitenoppervlak van de PM. Onze strategie laat hiermee ons PM oppervlakte receptoren onderscheiden van die in intracellulair verkeer blaasjes. Om voldoende ruimtelijke en temporele resolutie, en de gevoeligheid vereist om dynamische handel receotiren bereiken gebruikten we totale interne weerspiegelenion fluorescentiemicroscopie (TIRFM), waardoor we de optimale ruimtelijke resolutie van optische beeldvorming (~ 170 nm) bereiken, tijdsresolutie van de video-rate microscopie (30 frames / sec), en de gevoeligheid te detecteren fluorescentie van een GFP molecule. Door beeldvorming pHluorin-gelabeld receptoren onder TIRFM, waren we in staat om direct te visualiseren individuele receptor inbrengen gebeurtenissen in de PM in gekweekte neuronen. Deze imaging benadering kan mogelijk worden toegepast op elk membraan proteïne met een extracellulair domein dat kan worden gelabeld met superecliptic pHluorin, en dissectie van de belangrijkste gedetailleerde mechanismen voor het inbrengen van verschillende membraaneiwitten (receptoren, ionenkanalen, transporters, enz.), zodat de PM.
Protocol
1. Het voorbereiden van de Muis van Glia Cultuur voor Neuronale Cultuur Conditioning
- T75 flessen zijn bedekt met collageen oplossing (1:3 verdunning van Purecol in DDH 2 O). De kolven zijn verticale stand geplaatst en te drogen 's nachts in een weefselkweek kap.
- Dissectie buffer (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 30 mM dextrose, 25 mM HEPES, pH 7,4, zonder calcium) en glia media (DMEM aangevuld met 10% FBS, 10 eenheden / ml penicilline, 10 ug / ml streptomycine en Glutamax) bereid en bewaard bij 4 ° C tot aan gebruik.
- Op de dag van glia cultuur, de glia media verwarmd gedurende ten minste 30 minuten in een 37 ° C waterbad voor dissectie van muizenhersenen. Embryonale of neonatale muizen worden gedood door snelle onthoofding. Cerebrale cortex worden ontleed onder een dissectie microscoop.
- Ontleed Hersenweefsel verteerd papaïne oplossing (100 ml papaïne en 20 pi 1% DNase I in 2 ml dissectie buffer) bij 37 ° C for 20 min.
- Na papaïnedigestie zijn hersenweefsel gespoeld met 10 ml voorverwarmde glia media. Verse media glia (2 ml) wordt vervolgens toegevoegd aan de geknipte hersenweefsel en de weefsels worden gewreven met een vuur gepolijste glazen Pasteur pipet.
- Verse media glia (8 ml) wordt toegevoegd aan het gedissocieerde weefsel. Een 70 urn cel-zeef wordt gebruikt om de gedissocieerde weefselsuspensie filteren. Cellen worden vervolgens gezaaid in T75 kolven (meestal 2-3 embryo kan zaad een T75 kolf) en geplaatst in een 37 ° C celkweek incubator.
- De volgende dag, wordt het papier uit de T75 kolven opgezogen. De kolven worden gespoeld met 10 ml PBS. Verse media glia (10-15 ml) wordt vervolgens toegevoegd aan elke kolf.
- Binnen 10-12 dagen, moet glia in de T75 flessen worden confluent. Gliale cellen gespoeld met PBS en 5 ml 0,05% trypsine toegevoegd aan elke T75 fles.
- Na trypsine incubatie bij 37 ° C gedurende 5 min, gliale cellen gedissocieerd en gliacellen van elkaar T75 kolf in tweeverschillende collageen gecoate T75 kolven.
- Cultuur inserts (Millipore PICM03050) worden bereid door ze in 6-well platen, coaten met collageen en luchtdrogende overnight. Glia media (2 ml per stuk) te plaatsen onder elke cultuur insert.
- Glia van confluente T75 kolven worden getrypsiniseerd en geënt op de cultuur inserts (een T75 kolf per 6-well plaat, elke 2 ml insert). Deze inserts glia cultuur wordt gebruikt wordt om het neuronale kweken.
2. Neuronale Cultuur
- Het glas dekglaasjes voor neuronale cultuur zijn gereinigd door ze in 70% HNO 3 ten minste girale. Dekglaasjes worden vervolgens gewassen met 2 O ddH ten minste 3 keer, en gedroogd in een oven Isotemp (> 200 ° C) geroerd.
- Schoongemaakt dekglaasjes worden in een 6-well plaat, een dekglaasje per putje. Dekglaasjes worden bekleed met poly-L-lysine (2 ml, 0,1% in 100 mM boorzuur, pH = 8,5) gedurende de nacht in een 37 ° C incubator.
- Depoly-L-lysine oplossing uit de dekglaasjes en dekglaasjes worden 3 keer gewassen met geautoclaveerd ddH 2 O. Dekglaasjes worden dan geïncubeerd in een 37 ° C incubator overnacht in uitplaatmedia (Neurobasal aangevuld met 5% hitte-geïnactiveerd paardenserum, 10 eenheden / ml penicilline, 10 ug / ml streptomycine, Glutamax, 2% B27 supplement wordt toegevoegd aan het medium plating op de dag wordt gebruikt).
- De volgende dag, de uitplaatmedia verwijderd en 2 ml vers uitplaatmedia met B-27 toegevoegd aan elk putje dat een dekglaasje bedekt is.
- Zwangere muizen (E15-18) geëuthanaseerd met CO2 en embryonale muizen worden gedood door onthoofding. De hippocampus of striatum wordt geprepareerd uit het hersenweefsel en geplaatst in een 15 ml conische buis met ijskoude buffer dissectie voor cultuur van hippocampale neuronen of striatale medium spiny neuronen respectievelijk.
- Ontleed hersenweefsel kunnen worden gescheiden in papaïne zoals beschreven in stap 1.4) en 1.5).
- Fadat dissociatie wordt het aantal cellen in elke neuronale suspensie geteld met een hemocytometer. Neuronen worden vervolgens gezaaid op elke dekglaasje bij een dichtheid van 0,4 x 10 6 cellen per putje van een 6-well plaat en gekweekt in een 37 ° C incubator overnacht (neuronen DIV 0).
- Om glia cultuur inzetstukken voor te bereiden voor het conditioneren van de neuronale culturen, wordt de glia media verwijderd van de glia cultuur inzetstukken en vers plating medium wordt toegevoegd (2 ml in de invoeg-en 2 ml onder de insert).
- De volgende dag (DIV 1), zijn dekglaasjes met neuronen geplaatst onder de glia cultuur inserts, een dekglaasje in elk putje.
- Neuronen worden gevoed met het halve volume verse voorverwarmde voeding media (met B-27) elke 3-4 dagen tot ze klaar voor transfectie en imaging experimenten.
3. Transfectie
- Neuronale transfectie wordt uitgevoerd met Lipofectamine 2000. Voor elke neuronale cultuur (de ene cultuur per dekglaasje), 2 piLipofectamine 2000 en 1 ug DNA gebruikt. Verse Neurobasal medium zonder supplement wordt gebruikt om Lipofectamine en DNA te verdunnen.
- DNA en Lipofectamine geïncubeerd gedurende 20 min bij kamertemperatuur na het mengen.
- Sla 1 ml van de media van onder elke glia cultuur insert, en 1 ml van binnen elke insert, en breng de media om een conische buis. Voeg hetzelfde volume van het voeden van de media + B27 om de opgeslagen medium en incubeer bij 37 ° C. Dit medium wordt gebruikt voor neuronale cultuur na transfectie.
- Na de 20-min Lipofectamine / DNA incubatie worden glia cultuur inserts tijdelijk verwijderd uit de 6-well platen. De 200 pi Lipofectamine / DNA mengsel toegevoegd aan elke dekglaasje met neuronen. De glia cultuur inserts worden vervolgens teruggestuurd naar elk putje boven de neuronen. Opwekken van luchtbellen onder het membraan van de cultuur inserts worden vermeden. Neuronen worden geïncubeerd met de Lipofectamine / DNA mengsel bij 37 ° C gedurende 2-4 uur.
- Na ee 2-4 uur incubatieperiode worden glia inserts weer verwijderd. Het kweekmedium met de Lipofectamine / DNA mengsel wordt uit elk putje verwijderd. De media opgeslagen in stap 3.3) wordt toegevoegd aan neuronen (2 ml per well). Glia cultuur inserts worden geretourneerd aan elk putje en glia medium van elk inzetstuk is verwijderd, en 2 ml van de media uit stap 3.3) wordt toegevoegd aan elk insert.
- Neuronen gekweekt voor een extra 24-72 uur om expressie van cDNA getransfecteerd voordat TIRF beeldvorming wordt uitgevoerd op deze neuronen.
4. TIRF Imaging
- Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM glucose, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH = 7,4) wordt gebruikt voor live-imaging experimenten. Ons TIRF imaging-systeem is op maat set-up met een 100-mW cyaan laser voor excitatie, en een Electron vermenigvuldigen Charge Coupled Device (EMCCD) camera voor een detector.
- Voorafgaand aan beeldvorming experimenten wordt de aCSF gewaarschuwd in een 37 & deg; C waterbad gedurende ten minste 30 minuten. De verwarming insert voor levende beeldvorming op de microscooptafel en de verwarming insert, laser en camera worden verwarmd gedurende ten minste 30 minuten voor aanvang van de imaging experimenten.
- Een dekglaasje met getransfecteerde neuronen wordt geassembleerd in de live-imaging kamer. De voorverwarmde aCSF geplaatst in de kamer nadat de kamer is gemonteerd, deze stap worden zo snel als mogelijk.
- Zodra de kamer rust op de verwarming insert op de microscoop fase worden getransfecteerde neuronen geïdentificeerd visueel onder epi-fluorescentie imaging mode.
- Na gezonde getransfecteerde neuronen geïdentificeerd (zie figuren 1 en 2), we voeren gewoonlijk 1 minuut foto-bleach tot bestaande pHluorin fluorescentie regulering van de plasmamembraan, zoals pHluorin-receptoren op het plasmamembraan zeer hoge fluorescentie niveaus wanneer TIRF imaging wordt gestart, die interfereert met visualisatie van afzonderlijke insertion evenementen.
- Na photobleach wordt de versterkingsinstelling van de elektronenvermenigvuldiger de EMCCD camera op maximum en opname uitgevoerd gedurende 1 min bij 10 Hz.
- Elke opname bevat 600 beelden. Individuele inbrengen gebeurtenissen worden geïdentificeerd door het spelen van de opname terug met behulp van ImageJ. Individuele inbrengen gebeurtenissen worden geanalyseerd handmatig met ImageJ.
5. Representatieve resultaten
Consistente neuronale cultuur is de sleutel tot succesvolle live-imaging experimenten. Figuur 1 toont de muis hippocampale neuronen gekweekt met behulp van ons protocol van DIV 11 tot 18 DIV. Het is duidelijk uit de beelden die de neuronen hebben uitgebreide processen ontwikkeld en dat de dendritische processen dicht zijn bedekt met dendritische spines, aanwijzingen dat deze neuronen zijn gezond in cultuur. Onze cultuur protocol kan ook gebruikt worden voor andere types van neuronen in de hersenen. Zo hebben we onlangs gebruikt dit protocol om cultuurstriatale medium spiny neuronen in een studie om dopamine D2 receptor (DRD2) inbrengen onderzoeken in gekweekte muis striatale medium spiny neuronen 9. Figuur 2 toont de muis striatale medium spiny neuronen gekweekt met behulp van ons protocol bij DIV 8. We hebben ook met succes uitgevoerd TIRF beeldvorming van superecliptic pHluorin-gelabeld DRD2s in dit type neuron. Figuur 3 toont expressie van pHluorin-gelabeld DRD2 (pH-DRD2) in een medium doornige neuronen en visualisatie van pH-DRD2 insertie in deze neuron.
Figuur 1. Mouse hippocampus culture met behulp van de interface kweekmethode. DIV: dagen in vitro, de dag van de cultuur wordt beschouwd als DIV 0. Van de beelden, is het duidelijk dat hippocampale neuronen mature in dit type cultuur tussen 11 en DIV DIV 15. Bij DIV 11 en 13, zijn neuronale dendrieten bedekt met filipodia en onvolwassen stekels. Bij DIV 15 en18, zijn neuronale dendrieten bedekt met grote stekels, een indicatie van meer volwassen neuronen. Links panelen: laag vergroting beelden van de muis hippocampale neuronen op verschillende leeftijden. Rechts panelen: sterk vergrotende afbeeldingen (inzoomen op de neuronale dendrieten van het linkervenster) van neuronale dendritische processen met dendritische spines op verschillende leeftijden.
Figuur 2. Mouse striatale medium spiny neuron cultuur met behulp van de interface kweekmethode. Neuronen in de beelden zijn op DIV 8.
Figuur 3. Een muis striatale medium spiny neuron getransfecteerd met super ecliptica pHluorin-gelabeld dopamine D2 receptor (pH-DRD2). Afbeelding links is maximale intensiteit projectie van een time-lapse-opname (600 afbeeldingen, 100 msec per beeld). Witte pijlen geven individuele vesiculaire insertie van pH-DRD2. Dit beeld blijft inbrengen informatie in het xy dimensie, maar verliest de tijd informatie. Beeld aan de rechterkant toont yt maximale intensiteit projectie, waarbij de XYT stapel 90 graden gedraaid rond de y-as en de maximum pixel op elke x-as lijn geprojecteerd op een y-as pixel. Deze afbeelding behoudt inbrengen informatie langs de as yt maar verliest de x-as informatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om onbekende redenen, de muis neuronen zijn altijd moeilijker te cultuur dan rat neuronen. In onze ervaring, een mengcultuur van neuronen en glia werkt goed voor primaire gekweekte muis neuronen. Een dergelijke mengcultuur is niet geschikt voor TIRF imaging experimenten, zoals in type cultuur neuronen en hun processen trendmatig bovenop gliacellen, situeren de neuronale somata en dendritische processen buiten het bereik van TIRF microscopie. Derhalve een lagere dichtheid neuronale cultuur met weinig glia op het dekglaasje ideaal voor TIRF imaging. Eerst getest Banker methode 19, 20, waarbij de bodem van een kweekschaal wordt geënt met glia en neuronen gezaaid op een dekglaasje en omgekeerd geplaatst in de kweekschaal. De dekglaasje en de glia laag worden gescheiden door drie kleine druppels was op de dekglaasje aan. Deze methode werkt goed voor kleinere formaat dekglaasjes (zoals 15-mm of 18-mm dekglaasjes), maar toen we getest het gebruik van 25-mm coverslips neuronen in het midden van de dekglaasjes waren niet zo gezond als bij het dekglaasje randen.
Hoewel de oorzaak van dit verschil in neuron gezondheid was ons niet duidelijk, redeneerden we dat het wellicht vanwege de beperkte diffusie van voedingsstoffen naar het midden van het dekglaasje gebied. Daarom bleek de interface kweekmethode beschreven in dit geschrift, het membraan van de cultuur inzetstuk vrije diffusie van voedingsstoffen aan neuronen op de dekglaasjes. We geplaatste neuronen op 25-mm dekglaasjes, met de neuronen naar boven. We gezaaid glia op een cultuur insert, en plaatste de glia feeder inbrengen op de top van het dekglaasje. We hebben vastgesteld dat de interface kweekmethode is superieur aan andere methoden die we hebben getest, wanneer er gebruik 25-mm dekglaasjes voor low-density muis neuronale cultuur, en levert consistente resultaten voor TIRF beeldvorming. Om de eigenschappen van receptor inbrengen (frequentie, amplitude), een controlegroep kwantificeren met neuronen getransfecteerd wet wildtype pHluorin-gelabeld receptoren moet altijd worden opgenomen. Deze controlegroep dient ook als kwaliteitscontrole voor neuronale cultuur.
Ons TIRFM systeem is opgebouwd op de handmatige Zeiss AxioObserver microscoop (Carl Zeiss microimaging, Inc, Thornwood, NY). De excitatielaser een Newport 488 nm-cyaan 100mW Laser System (Newport Corporation, Irvine, CA). De laser is gekoppeld met een Zeiss TIRF slider via een KineFLEX-P-2-S-488-640-0,7-FCP-P2 glasvezel (puntbronnen, Mitchell Point, Hamble, UK). Een Z488RDC dichroïsche spiegel (Chroma Technology Corporation, Bellows Falls, VT) werd gebruikt om de binnenkomende laser tijdens op een Zeiss α-plan 100X objectieflens (NA = 1,46, Carl Zeiss). Een ET525/50 emissiefilter (Chroma Technology Corporation) werd gebruikt voor GFP fluorescentie detectie. Een Evolve EMCCD camera (Photometrics, Tucson, AZ) werd gebruikt als detector. Een 2,5 x relais lens werd ingevoegd tussen de microscoop camera-poort en de noktijdperk om een optimale ruimtelijke resolutie (0,064 micrometer per pixel bij gebruik van de 100X NA = 1,46 doelstelling). De camera werd op -80 ° C gedurende imaging experimenten. Een Uniblitz LS6 sluiter gecontroleerd door een VMM-D3 controller (Vincent Associates, Rochester, NY) werd geïntegreerd tussen de laserkop en vezels launcher. De gegevens werden verkregen met behulp van μManager software ( http://www.micro manager.org / ).
Alle beeldvormende experimenten werden uitgevoerd bij 37 ° C in aCSF oplossing die 2 mM CaCl2. Deze aCSF oplossing wordt op pH = 7,4 bij kamertemperatuur. Wanneer verwarmd tot 37 ° C, de pH van deze aCSF wordt 7,2, die optimaal is voor neuronen in cultuur. Tijdens overname wordt laservermogen ingesteld op het maximum, zowel voor foto-bleekmiddel en voor data-acquisitie. Belichting is ingesteld op 100 msec, en acquisitie bedroeg 10 beelden per seconde (10 Hz). EMCCD winst werd eent maximum. Opnamen werden geanalyseerd met behulp van ImageJ software (Rasband, WS, NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/ , 1997-2012), en het inbrengen evenementen werden geregistreerd en handmatig geanalyseerd. Total events per minuut per oppervlakte-eenheid dienden als frequentie van insertie en werden genormaliseerd op de controlegroep als 100%. Yt weergegeven beelden werden gegenereerd in ImageJ door aan de oorspronkelijke XYT stapel 90 ° langs de y-as en de maximum intensiteit van elke x lijn is geprojecteerd op een pixel van de y-as met de maximale intensiteit projectie-algoritme in ImageJ.
Insertion gebeurtenissen typisch waargenomen als het plotselinge verschijnen van fluorescerende punta (snel stijgende fase), gevolgd door een afnemende fase die receptor diffusie in de plasmamembraan 7 is 9. De verschijning van fluorescerende punta met een langzame stijgende fase of die zonder een schijnbare verval fase (plotselinge disappeArance) worden uitgesloten van gegevensanalyse, zoals deze gebeurtenissen vertegenwoordigen waarschijnlijk handel intracellulaire blaasjes die een minder zure lumen (zoals die van het endoplasmatisch reticulum) hebben. Photobleach van bestaande oppervlak receptor populaties ook minder de bijdrage van bestaande oppervlak receptor clustering op het plasmamembraan. Tot op heden zijn al onze gegevens handmatig geanalyseerd met behulp van ImageJ. Toekomstige ontwikkeling van computer algoritmen voor automatische detectie en event data analyse belang voor het kunnen aanpassen en toepassing van deze beeldvormingswerkwijze voor het onderzoek van receptor inbrengen naar de plasmamembraan.
Om individuele vesiculaire inbrengen gebeurtenissen pHluorin gemerkte receptoren visualiseren, diverse belangrijke parameters moeten worden gehouden. Enerzijds de laser excitatie moet sterk genoeg zijn om detectie van fluorescentie toestaat uit een vesicles. In onze speciaal ontworpen systeem, hebben we gebruik gemaakt van een 10 0-mW 488-nm laser als onze excitatie bron. Anderzijds de detector van het afbeeldingsstelsel heeft zowel de gevoeligheid en de snelheid om gegevens te verzamelen van real-time dynamische receptor inbrengen. Daarom gebruiken we een EMCCD in ons systeem. De combinatie van een sterke excitatielaser en een EMCCD detector heeft een-GFP molecuul detectievermogen in ons beeldvormingssysteem. Onze keuze voor een op maat gemaakte TIRF systeem is gebaseerd op het bereiken van maximale prestaties van beperkte beschikbare middelen. Het is vermeldenswaard dat in de handel verkrijgbaar TIRF met voldoende laserexcitatie vermogen (100-488-nm mW laser is voor ons voldoende, en is gemakkelijk beschikbaar op de meeste commerciële platforms) en een EMCCD camera ook geschikt is voor die imaging studies. Daarom wordt aanpassing van die beeldvormende studies voor neuronen niet beperkt door prestaties van het systeem TIRFM, maar de kwaliteit van neuronale cultuur en consistentie van neuronale kweken.
ove_content "> derde gevolg van de aanvankelijke fluorescentie van bestaande pHluorin gemerkte plasmamembraan receptoren photobleach onder TIRF toestand doorgaans nodig zijn voor detectie van fluorescentie van een vesicle. We gewoonlijk 1 minuut photobleach met de TIRF imaging op maximale voeren laservermogen eenmaal neuron visueel geïdentificeerd, waardoor verwijdering van de meeste bestaande oppervlak pHluorin fluorescentie. Het is ook belangrijk om te onthouden dat een hoge laserexcitatie vermogen ook de mogelijkheid laser schade en fototoxiciteit verhoogt. Onze ervaring , met een 100 mW-488-mW laser als excitatiebron lijkt geen waarneembare schade introduceren neuronen in de data acquisitie tijd, terwijl voldoende laservermogen voor het visualiseren receptoren in enkele blaasjes. Een bijkomende belangrijke overweging is dat verschillen in soort en aantal receptoren per vesicle zal ook de laserexcitatie eis.Zo we voorheen konden regulering van glutamaat receptor subeenheid GluA1 inbrengen onderzoeken naar de plasmamembraan via een 50 mW excitatie laser 7. We schatten dat elke vesicle onderzocht in deze studie 56 ± 6 GluA1 moleculen, vergelijkbaar met de schatting van een andere groep met vergelijkbare methoden 12 bevatte. In onze recente studie DRD2 schatten we dat elke vesicle 30 ± 1 moleculen bevatte en een 100 mW laser voldoende was voor deze studie. Vanwege de hoge achtergrondruis in levende cellen, onderzoek van een vesicle met slechts enkele receptor moleculen (bijvoorbeeld 5-10) kunnen een laservermogen groter dan 100 mW nodig om een voldoende signaal-verwezenlijken ruisverhouding voor visualisatie van receptor inbrengen van de plasmamembraan in neuronen. Het vinden van de juiste balans van gevoeligheid en excitatie energie is belangrijk voor het plannen van een succesvolle studie.Het gebruik van TIRFM tot image superecliptic pHluorin gemerkte receptoren is toegepast op verschillende soorten neuronale receptoren 7-17. Het is echter belangrijk te bedenken dat de huidige werkwijze berust op tagging receptoren met een GFP molecuul en overexpressie van receptoren gelabeld. Bevestigen van een GFP molecuul aan het extracellulaire domein van een membraaneiwit kan interfereren met de functie van het eiwit, en het is daarom cruciaal om te controleren of tagging strategie significant stoort de functie van het eiwit onderzochte 9. Bovendien is een overexpressie receptor al dan niet onderworpen zijn aan de regulerende mechanismen die de handel in endogene receptoren regeren. Onafhankelijke methoden zijn daarom nodig om resultaten van beeldvorming overexpressie pHluorin-gelabeld receptoren te valideren. Bijvoorbeeld, in onze studies van GluA1 insertie 7, oppervlakte-expressie en synaptische handel endogene GluA1 receptoren werden gevalideerd uzingen standaard immunokleuring / biochemische methoden of elektrofysiologische benaderingen. Kortom, onze imaging aanpak in combinatie met andere standaardwerkwijzen voor membraaneiwit handel, waarschijnlijk rol in ontleden gedetailleerde moleculaire en cellulaire mechanismen die plasmamembraan inbrengen van andere membraaneiwitten in neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door het opstarten van fondsen van The Jackson Laboratory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified bovine collagen solution (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-045 | |
| penicillin-streptomycin (Pen Strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| sodium pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO, by Life Technologies | 10313-021 | |
| fetal bovine serum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| papain | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.05% trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| poly-l-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636-1G | |
| boric acid | Fisher Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| heat inactive horse serum | GIBCO, by Life Technologies | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Culture Insert | EMD Millipore | PICM03050 |
References
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
- Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
- Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
- Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
- Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
- Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
- Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
- Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
- Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
- Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
- Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
