Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen
Summary
Tagging door de extracellulaire domeinen van membraanreceptoren met superecliptic pHluorin, en imaging deze fusie-receptoren in gekweekte muis neuronen, kunnen we direct visualiseren individuele vesiculaire inbrengen gebeurtenissen van de receptoren aan het plasmamembraan. Deze techniek zal instrumenteel ophelderen van de moleculaire mechanismen voor insertie receptor naar de plasmamembraan.
Abstract
Een beter begrip van de mechanismen die receptor handel tussen de plasmamembraan (PM) en intracellulaire compartimenten vereist een experimentele benadering met een uitstekende ruimtelijke en temporele resoluties. Bovendien moeten deze benadering ook de mogelijkheid aan receptoren gelokaliseerd op de PM dan in intracellulaire compartimenten onderscheiden. Vooral detecteren receptoren in een vesicle heeft uitstekende detectiegevoeligheid, aangezien elke vesicle draagt slechts een klein aantal receptoren. Standaardbenaderingen voor de behandeling receptor handel zijn oppervlak biotinylering gevolgd door biochemische detectie, die zowel de vereiste ruimtelijke en temporele resolutie mist en fluorescentiemicroscopie onderzoek immunolabeled oppervlakte receptoren, die chemische fixatie van cellen vereist en daardoor ontbreekt voldoende tijdsresolutie 1-6. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben wij en anderen ontwikkeld en gebruikt een nieuwe stragie waarmee visualisatie van de dynamische invoeging van receptoren in de PM met uitstekende ruimtelijke en temporele resolutie 7-17. De aanpak omvat tagging van een pH-gevoelige GFP, de superecliptic pHluorin 18, de N-terminale extracellulaire domein van de receptoren. Superecliptic pHluorin heeft de unieke eigenschap dat bij neutrale pH fluorescerende en niet-fluorescerende bij zure pH (pH <6,0). Dus de gelabelde receptoren niet fluorescerende wanneer binnen de zure lumen van intracellulair verkeer blaasjes of endosomale compartimenten en zij gemakkelijk zichtbaar wanneer blootgesteld aan de extracellulaire neutrale pH omgeving op het buitenoppervlak van de PM. Onze strategie laat hiermee ons PM oppervlakte receptoren onderscheiden van die in intracellulair verkeer blaasjes. Om voldoende ruimtelijke en temporele resolutie, en de gevoeligheid vereist om dynamische handel receotiren bereiken gebruikten we totale interne weerspiegelenion fluorescentiemicroscopie (TIRFM), waardoor we de optimale ruimtelijke resolutie van optische beeldvorming (~ 170 nm) bereiken, tijdsresolutie van de video-rate microscopie (30 frames / sec), en de gevoeligheid te detecteren fluorescentie van een GFP molecule. Door beeldvorming pHluorin-gelabeld receptoren onder TIRFM, waren we in staat om direct te visualiseren individuele receptor inbrengen gebeurtenissen in de PM in gekweekte neuronen. Deze imaging benadering kan mogelijk worden toegepast op elk membraan proteïne met een extracellulair domein dat kan worden gelabeld met superecliptic pHluorin, en dissectie van de belangrijkste gedetailleerde mechanismen voor het inbrengen van verschillende membraaneiwitten (receptoren, ionenkanalen, transporters, enz.), zodat de PM.
Protocol
Discussion
Om onbekende redenen, de muis neuronen zijn altijd moeilijker te cultuur dan rat neuronen. In onze ervaring, een mengcultuur van neuronen en glia werkt goed voor primaire gekweekte muis neuronen. Een dergelijke mengcultuur is niet geschikt voor TIRF imaging experimenten, zoals in type cultuur neuronen en hun processen trendmatig bovenop gliacellen, situeren de neuronale somata en dendritische processen buiten het bereik van TIRF microscopie. Derhalve een lagere dichtheid neuronale cultuur met weinig glia op het dekglaas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door het opstarten van fondsen van The Jackson Laboratory.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| purified bovine collagen solution (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| penicillin-streptomycin (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| sodium pyruvate | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO | 10313-021 | |
| fetal bovine serum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| papain | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) | SIGMA | DN25-10MG | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-144 | |
| 0.05% trypsin | GIBCO | 25300-054 | |
| poly-l-lysine hydrobromide | SIGMA | P2636-1G | |
| boric acid | Fisher-Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO | 17504-044 | |
| heat inactive horse serum | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher-Scientific | BP310-500 | |
| Culture Insert | Millipore | PICM03050 |
References
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
- Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
- Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
- Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
- Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
- Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
- Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
- Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
- Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
- Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
- Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
