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Summary

टैगिंग द्वारा superecliptic pHluorin साथ झिल्ली रिसेप्टर्स की कोशिकी डोमेन, और सभ्य माउस न्यूरॉन्स में इमेजिंग द्वारा इन संलयन रिसेप्टर्स, हम सीधे व्यक्ति vesicular प्रविष्टि घटनाओं प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर्स की कल्पना कर सकते हैं. इस तकनीक के elucidating आणविक प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर प्रविष्टि संचालन तंत्र में सहायक होगा.

Abstract

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution^1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions ^7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin ¹⁸, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH < 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

Protocol

1. Neuronal संस्कृति कंडीशनिंग के लिए माउस Glia संस्कृति की तैयारी T75 बोतल कोलेजन समाधान (DDH 2 हे में 01:03) Purecol के कमजोर पड़ने के साथ लेपित हैं. बोतल सीधे सेट कर रहे हैं और एक टिशू कल्चर हुड में रातोंरात सूखी छोड़ दिया. विच्छेदन (: aCSF 119 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 30 मिमी dextrose, 25 मिमी HEPES, पीएच 7.4 कैल्शियम के बिना) बफर और glia मीडिया (DMEM 10% FBS, 10 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 10 के साथ पूरक / ग्राम मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, और Glutamax) तैयार कर रहे हैं और 4 में संग्रहीत ° C उपयोग के लिए तक तैयार है. Glia संस्कृति के दिन, glia मीडिया माउस दिमाग के विच्छेदन से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कम से कम 30 मिनट के लिए गर्म है. भ्रूण या नवजात चूहों तेजी कत्ल द्वारा euthanized हैं. सेरेब्रल cortexes बाहर एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे dissected हैं. Dissected मस्तिष्क के ऊतकों papain समाधान (100 मिलीलीटर papain और 20 μl 2 मिलीलीटर विच्छेदन बफर में 1% DNase मैं) में 37 में पच जाता है डिग्री सेल्सियस के लिएr 20 मिनट. Papain पाचन के बाद, मस्तिष्क के ऊतकों को 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म glia मीडिया के साथ rinsed कर रहे हैं. ताजा glia मीडिया (2 मिलीलीटर) तो पचा मस्तिष्क के ऊतकों को जोड़ा है, और ऊतकों एक आग पॉलिश कांच पाश्चर विंदुक के साथ triturated हैं. ताजा glia मीडिया (8 मिलीग्राम) dissociated ऊतकों को जोड़ा है. एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी dissociated ऊतक निलंबन फिल्टर किया जाता है. कोशिकाओं तो T75 बोतल (आमतौर पर 2-3 भ्रूण बीज एक T75 फ्लास्क) में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और एक 37 ° C सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखा गया है. अगले दिन, T75 बोतल से मीडिया aspirated है. बोतल 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ rinsed हैं. ताजा glia मीडिया (10-15 मिलीग्राम) तो प्रत्येक कुप्पी में जोड़ा जाता है. 10-12 दिनों के भीतर, T75 बोतल में glia मिला हुआ होना चाहिए. Glial कोशिकाओं पीबीएस के साथ rinsed कर रहे हैं, और 0.05% trypsin के 5 मिलीलीटर प्रत्येक T75 फ्लास्क को जोड़ा जाता है. ट्रिप्सिन ऊष्मायन के बाद 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, glial कोशिकाओं प्रत्येक T75 फ्लास्क से अलग और glial कोशिकाओं को दो भागों में विभाजित कर रहे हैंअलग कोलेजन लेपित T75 बोतल. संस्कृति आवेषण (PICM03050 Millipore) उन्हें 6 अच्छी तरह प्लेटें, कोलेजन के साथ उन्हें कोटिंग, और रात में हवा सुखाने में रखकर तैयार कर रहे हैं. Glia मीडिया (2 मिलीलीटर प्रत्येक) प्रत्येक संस्कृति डालने के नीचे रखा गया है. संगामी T75 बोतल से Glia trypsinized और संस्कृति आवेषण पर वरीयता प्राप्त (6 अच्छी तरह से थाली प्रति एक T75 फ्लास्क, 2 मिलीलीटर प्रत्येक डालने). इन glia संस्कृति आवेषण neuronal संस्कृतियों हालत के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. 2. Neuronal संस्कृति neuronal संस्कृति के लिए कांच coverslips 70% में कम से कम 3 रातोंरात HNO भिगोने से साफ कर रहे हैं. DDH 2 हे कम से कम 3 बार के साथ Coverslips तो धो रहे हैं, और एक Isotemp ओवन में सूख (> 200 डिग्री सेल्सियस) रातोंरात. साफ coverslips 6 अच्छी तरह से एक थाली, एक अच्छी तरह से प्रति coverslip में रखा जाता है. पाली – एल Lysine (2 मिलीग्राम, 100 मिमी बोरिक एसिड में 0.1%, 8.5 पीएच =) एक ° इनक्यूबेटर सी 37 में रातोंरात समाधान के साथ Coverslips लेपित हैं. पाली एल Lysine समाधान coverslips से निकाल दिया जाता है और coverslips autoclaved DDH 2 ओ के साथ 3 बार धोया जाता है तो Coverslips एक 37 में incubated डिग्री सेल्सियस चढ़ाना मीडिया में रातोंरात (5% गर्मी निष्क्रिय घोड़े सीरम, 10 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 10 / ग्राम मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, Glutamax साथ पूरक Neurobasal इनक्यूबेटर, 2% B27 पूरक चढ़ाना मध्यम करने के लिए जोड़ा है दिन पर यह प्रयोग किया जाता है). अगले दिन, चढ़ाना मीडिया हटा दिया है और B-27 के साथ ताजा चढ़ाना मीडिया के 2 मिलीलीटर प्रत्येक अच्छी तरह से है कि एक गिलास coverslip जोड़ा जाता है. सीओ 2 के साथ गर्भवती चूहों (E15-18) euthanized हैं, और भ्रूण चूहों शिरच्छेद द्वारा euthanized हैं. हिप्पोकैम्पस या स्ट्रिएटम मस्तिष्क के ऊतकों से dissected है और बर्फ ठंड hippocampal न्यूरॉन्स या striatal मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स की संस्कृति के लिए विच्छेदन बफर, क्रमशः के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रखा. Dissected मस्तिष्क के ऊतकों papain साथ अलग कर रहे हैं, के रूप में 1.4 कदम) और 1.5) में वर्णित है. एफहदबंदी ollowing, प्रत्येक neuronal निलंबन में कोशिकाओं के संख्या एक hemocytometer के साथ गिना जाता है. न्यूरॉन्स तो 0.4 x 10 6 कोशिकाओं के एक एक 6-अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह घनत्व प्रत्येक coverslip पर वरीयता दी गई, और एक रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संवर्धित (न्यूरॉन्स DIV 0) कर रहे हैं. Glia संस्कृति आवेषण neuronal संस्कृतियों कंडीशनिंग के लिए तैयार करते हैं, glia मीडिया glia संस्कृति आवेषण से निकाल दिया जाता है और ताजा चढ़ाना मध्यम जोड़ा जाता है (और डालने के नीचे डालने और 2 मिलीलीटर में 2 मिलीलीटर). अगले दिन (1 DIV), न्यूरॉन्स के साथ coverslips glia संस्कृति आवेषण, प्रत्येक कुएं में एक coverslip के नीचे रखा जाता है. न्यूरॉन्स ताजा पूर्व गर्म खिला मीडिया (B-27 के साथ) हर 3-4 दिनों की आधी मात्रा के साथ खिलाया जाता है, जब तक वे अभिकर्मक और इमेजिंग प्रयोगों के लिए तैयार कर रहे हैं. 3. अभिकर्मक Neuronal अभिकर्मक Lipofectamine 2000 का उपयोग किया जाता है. प्रत्येक neuronal संस्कृति के लिए (coverslip प्रति एक संस्कृति), 2 μlLipofectamine 2000 और डीएनए की 1 ग्राम का उपयोग किया जाता है. कोई पूरक के साथ ताजा Neurobasal मध्यम लिए Lipofectamine और डीएनए जलमिश्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. डीएनए और Lipofectamine कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मिश्रण के बाद incubated हैं. प्रत्येक डालने के अंदर से मीडिया के प्रत्येक glia संस्कृति डालने के नीचे से 1 मिलीग्राम और 1 मिलीग्राम सहेजें, और एक शंक्वाकार ट्यूब के लिए मीडिया स्थानांतरण. बचाया मध्यम और 37 पर सेते ° सी. खिला मीडिया का एक ही मात्रा + B27 जोड़ें इस माध्यम neuronal संस्कृति के लिए अभिकर्मक के बाद किया जाता है. 20 मिनट ऊष्मायन / Lipofectamine डीएनए के बाद, glia संस्कृति आवेषण क्षण भर के छह अच्छी तरह प्लेटें से हटा रहे हैं. 200 μl मिश्रण / Lipofectamine डीएनए न्यूरॉन्स के साथ प्रत्येक coverslip जोड़ा जाता है. glia संस्कृति आवेषण तो एक अच्छी तरह से करने के लिए लौट रहे हैं, न्यूरॉन्स ऊपर. संस्कृति आवेषण की झिल्ली के तहत बुलबुले के सृजन से बचा जाना चाहिए. न्यूरॉन्स मिश्रण / Lipofectamine डीएनए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस में 2-4 घंटे के लिए incubated रहे हैं. वीं के बादई 2-4 घंटा ऊष्मायन अवधि, glia आवेषण फिर से हटा रहे हैं. मिश्रण / Lipofectamine डीएनए के साथ संस्कृति मीडिया प्रत्येक अच्छी तरह से हटा दिया जाता है. 3.3 कदम) में बचाया मीडिया न्यूरॉन्स (2 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से) करने के लिए जोड़ा है. Glia संस्कृति आवेषण एक अच्छी तरह से वापस आ रहे हैं, और प्रत्येक डालने से glia मीडिया निकाल दिया जाता है, और 3.3 कदम) से मीडिया के 2 मिलीलीटर प्रत्येक डालने में जोड़ा जाता है. न्यूरॉन्स TIRF इमेजिंग पहले ट्रांसफ़ेक्ट सीडीएनए की अभिव्यक्ति इन न्यूरॉन्स पर किया जाता है की अनुमति के लिए एक अतिरिक्त 24-72 घंटे के लिए संवर्धित कर रहे हैं. 4. TIRF इमेजिंग कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF: 119 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 30 मिमी ग्लूकोज, 2 मिमी CACL 2, 1 मिमी 2 MgCl, 25 मिमी HEPES, पीएच = 7.4) रहते इमेजिंग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. हमारे TIRF इमेजिंग प्रणाली उत्तेजना के लिए एक 100 मेगावाट सियान लेजर के साथ कस्टम सेट अप है, और एक इलेक्ट्रॉन को गुणा प्रभार एक डिटेक्टर के लिए डिवाइस कैमरा (EMCCD) युग्मित. इमेजिंग प्रयोगों से पहले aCSF एक 37 और घ में चेतावनी दी हैसी कम से कम 30 मिनट के लिए पानी का स्नान, उदा. रहते इमेजिंग के लिए हीटिंग डालने खुर्दबीन मंच पर रखा गया है, और हीटिंग डालने, लेजर, कैमरा और इमेजिंग प्रयोगों के शुरू होने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए गरम कर रहे हैं. ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स के साथ एक coverslip रहते इमेजिंग कक्ष में इकट्ठा किया है. aCSF पूर्व गर्म कक्ष में रखा है चैम्बर के बाद इकट्ठा किया जाता है, इस कदम के रूप में संभव के रूप में तेजी से पूरा किया जाना चाहिए. एक बार चैम्बर खुर्दबीन मंच पर हीटिंग डालने पर रखा गया है, ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स महामारी फ्लोरोसेंट इमेजिंग मोड के तहत नेत्रहीन की पहचान कर रहे हैं. बाद स्वस्थ ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स (आंकड़े 1 और 2 के लिए देखें) की पहचान कर रहे हैं, हम आम तौर पर तस्वीर ब्लीच के 1 मिनट प्रदर्शन प्लाज्मा झिल्ली पर पूर्व मौजूदा pHluorin प्रतिदीप्ति खत्म करने, के रूप में प्लाज्मा झिल्ली पर pHluorin रिसेप्टर्स बहुत उच्च प्रतिदीप्ति जब स्तर TIRF इमेजिंग पहली बार शुरू किया जा रहा है, जो व्यक्ति भारतीय नौसेना पोत के दृश्य के साथ हस्तक्षेपertion घटनाओं. बाद photobleach EMCCD कैमरे पर इलेक्ट्रॉन गुणक का लाभ सेटिंग को अधिकतम करने के लिए सेट कर दिया जाता है, और रिकॉर्डिंग 10 हर्ट्ज पर 1 मिनट के लिए किया जाता है. प्रत्येक रिकॉर्डिंग 600 चित्र शामिल होंगे. व्यक्तिगत प्रविष्टि घटनाओं रिकॉर्डिंग ImageJ का उपयोग कर वापस खेल के द्वारा की पहचान कर रहे हैं. व्यक्तिगत प्रविष्टि घटनाओं मैन्युअल ImageJ का विश्लेषण का उपयोग कर रहे हैं. 5. प्रतिनिधि परिणाम अनुरूप neuronal संस्कृति सफल रहते इमेजिंग प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण चित्रा 1 है. पता चलता है कि माउस hippocampal न्यूरॉन्स DIV 11 से हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए 18 div सुसंस्कृत. यह स्पष्ट है कि न्यूरॉन्स व्यापक प्रक्रियाओं को विकसित किया है और कहा कि छवियों से वृक्ष के समान प्रक्रियाओं घनी वृक्ष के समान spines, संकेत मिले हैं कि इन न्यूरॉन्स संस्कृति में स्वस्थ हैं के साथ आते हैं. हमारी संस्कृति प्रोटोकॉल भी दिमाग में न्यूरॉन्स की अन्य प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम हाल ही में इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया संस्कृति कोstriatal एक अध्ययन में मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स सभ्य माउस striatal मध्यम काँटेदार 9 न्यूरॉन्स में डोपामाइन D2 रिसेप्टर (DRD2) प्रविष्टि की जांच चित्रा 2 से पता चलता है कि माउस striatal मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स 8 DIV में हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर सुसंस्कृत. हम भी सफलतापूर्वक न्यूरॉन के इस प्रकार में superecliptic pHluorin टैग DRD2s TIRF इमेजिंग चित्रा 3 प्रदर्शन की अभिव्यक्ति से पता चलता है pHluorin टैग एक मध्यम काँटेदार और पीएच DRD2 इस न्यूरॉन में प्रविष्टि के न्यूरॉन दृश्य में DRD2 (पीएच DRD2). चित्रा 1. माउस hippocampal संस्कृति इंटरफ़ेस संस्कृति विधि का उपयोग. DIV: इन विट्रो दिनों में, संस्कृति का दिन 0 DIV के रूप में माना जाता है. छवियों से, यह स्पष्ट है कि 11 DIV और 15 DIV के बीच संस्कृति के इस प्रकार में परिपक्व hippocampal न्यूरॉन्स. DIV 11 और 13, neuronal dendrites filipodia और अपरिपक्व कांटा के साथ आते हैं. 15 DIV और18, neuronal dendrites बड़े spines के साथ कवर किया जाता है, और अधिक परिपक्व न्यूरॉन्स की एक संकेत है. माउस hippocampal न्यूरॉन्स के अलग अलग उम्र में कम बढ़ाई छवियों वाम पैनल:. सही पैनल: उच्च बढ़ाई (बाएं पैनल के neuronal dendrites पर ज़ूम) छवियों को अलग अलग उम्र में वृक्ष के समान spines के साथ neuronal वृक्ष के समान प्रक्रियाओं के. चित्रा 2 माउस striatal मध्यम काँटेदार न्यूरॉन इंटरफ़ेस संस्कृति विधि का उपयोग संस्कृति. छवियों में न्यूरॉन्स 8 DIV पर हैं. चित्रा 3 एक माउस striatal मध्यम काँटेदार न्यूरॉन सुपर क्रांतिवृत्त pHluorin टैग dopamine D2 रिसेप्टर (पीएच DRD2) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट. बाईं तरफ छवि रिकॉर्डिंग समय चूक की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (600 छवियों, छवि प्रति 100 मिसे) है. व्हाइट arrowheads पीएच – डी की व्यक्तिगत vesicular प्रविष्टि का संकेत मिलता हैRD2. इस छवि को xy आयाम में प्रविष्टि जानकारी बरकरार रखती है, लेकिन समय की जानकारी खो देता है. सही पर छवि yt अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण से पता चलता है, जो में xyt ढेर y-अक्ष के चारों ओर घुमाया 90 डिग्री है, और प्रत्येक पंक्ति x-अक्ष पर अधिकतम पिक्सेल एक एकल पिक्सेल y-अक्ष पर पेश किया है. इस छवि को yt अक्ष के साथ सम्मिलन जानकारी बरकरार रखती है, लेकिन जानकारी x-अक्ष खो देता है.

Discussion

अज्ञात कारणों के लिए, माउस न्यूरॉन्स हमेशा चूहा न्यूरॉन्स से अधिक संस्कृति के लिए मुश्किल है. हमारे अनुभव में, न्यूरॉन्स और glia की एक मिश्रित संस्कृति प्राथमिक सभ्य माउस न्यूरॉन्स के लिए अच्छी तरह से का…

Materials

purified bovine collagen solution (Purecol)	Advanced Biomatrix	5005-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO, by Life Technologies	14185-045
penicillin-streptomycin (Pen Strep)	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
sodium pyruvate	GIBCO, by Life Technologies	11360-070
DMEM High Glucose	GIBCO, by Life Technologies	10313-021
fetal bovine serum (FBS)
GlutaMAX	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
papain	Worthington Biochemical Corp.	LS003126
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I)	Sigma-Aldrich	DN25-10MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
0.05% trypsin	GIBCO, by Life Technologies	25300-054
poly-l-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636-1G
boric acid	Fisher Scientific	BP 168-500
Neurobasal Medium	GIBCO, by Life Technologies	21103-049
B-27 Serum-Free Supplement	GIBCO, by Life Technologies	17504-044
heat inactive horse serum	GIBCO, by Life Technologies	26050-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668 019
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Culture Insert	EMD Millipore	PICM03050