Abstract
En bättre förståelse av de mekanismer som styr receptor handel mellan plasmamembranet (PM) och intracellulära utrymmen kräver en experimentell metod med utmärkta rumsliga och tidsmässiga resolutioner. Dessutom måste en sådan strategi har också förmågan att särskilja receptorer lokaliserade på PM från dem i intracellulära utrymmen. Viktigast detektering receptorer i en enda vesikel kräver enastående detekteringskänslighet, eftersom varje vesikel uppbär endast ett litet antal receptorer. Standardmetoder för granskning receptor narkotikahandel omfattar ytan biotinylering följt av biokemisk detektion, som saknar både nödvändiga rumsliga och tidsmässiga resolutioner samt fluorescensmikroskopi granskning av immunolabeled ytreceptorer, vilket kräver kemisk fixering av celler och saknar därför tillräckligt tidsupplösning 1-6. För att övervinna dessa begränsningar har vi och andra utvecklat och anställt en ny strategi som möjliggör visualisering av dynamiska införandet av receptorer i PM med utmärkta geografiska och tidsmässiga resolutioner 7-17. Den metod innefattar märkning av en pH-känslig GFP, den superecliptic pHluorin 18, till den N-terminala extracellulära domänen av receptorema. Superecliptic pHluorin har den unika egenskapen att vara fluorescerande vid neutralt pH och icke-fluorescerande vid surt pH (pH <6,0). Därför, de märkta receptorerna är icke-fluorescerande när inom den sura lumen intracellulära människohandel vesiklar eller endosomala fack, och de blir lätt visualiseras endast när de exponeras för den extracellulära neutrala pH-miljö, på den yttre ytan av PM. Vår strategi ger därför vi skilja receptorer PM yta från de inom intracellulära människohandel blåsor. För att uppnå tillräcklig rumsliga och tidsmässiga resolutioner samt känslighet som krävs för att studera dynamiska handel med receptorer, anställd vi total inre speglarjon fluorescensmikroskopi (TIRFM), som gjorde det möjligt för oss att uppnå optimal rumsliga upplösningen i optisk avbildning (~ 170 nm), till den temporala upplösningen av video-rate mikroskopi (30 bilder / sek), och känsligheten upptäcka fluorescens av en enda GFP molekyl. Genom avbildning pHluorin-märkta receptorer enligt TIRFM, kunde vi direkt visualisera enskilda händelser receptor insättning i PM i odlade nervceller. Denna avbildningsteknik kan potentiellt tillämpas på alla membranprotein med en extracellulär domän som kunde märkas med superecliptic pHluorin, och kommer att tillåta dissekering av de viktigaste detaljerade mekanismer som styr införandet av olika membranproteiner (receptorer, jonkanaler, transportörer, etc) till PM.
Protocol
1. Förbereda Kultur Mus Glia för neuronal kultur Conditioning
- T75-kolvar är belagda med kollagen-lösning (1:3 utspädning av Purecol i DDH 2 O). Kolvarna ställs upprätt och lämnades att torka över natten i en vävnadsodling huva.
- Dissektion buffert (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgClj 2, 30 mM dextros, 25 mM HEPES, pH 7,4, utan kalcium) och media glia (DMEM kompletterat med 10% FBS, 10 enheter / ml penicillin, 10 ig / ml streptomycin och Glutamax) framställes och förvaras vid 4 ° C tills redo för användning.
- På dagen för glia kultur är glia mediet värmas minst 30 minuter i en 37 ° C vattenbad före dissekering av mus hjärnor. Embryonala eller neonatala möss avlivades genom snabb dekapitation. Cerebral cortexes dissekeras ut under en dissektion mikroskop.
- Dissekerade hjärnvävnader digereras i papain-lösning (100 ml papain och 20 pl 1% DNas I i 2 ml buffert dissektion) vid 37 ° C för 20 minuter.
- Efter papaindigerering, är hjärnvävnad sköljdes med 10 ml förvärmda glia medier. Färska medier glia (2 ml) tillsätts därefter till de spjälkade hjärnvävnader, och vävnaderna finfördelades med en brand-polerad glas pasteurpipett.
- Färska medier glia (8 ml) sättes till de dissocierade vävnaderna. En 70 ^ m-cell-sil används för att filtrera den dissocierade vävnaden suspensionen. Celler ympas sedan i T75-kolvar (vanligtvis 2-3 embryon kan utsäde en T75 kolv) och placerades i en 37 ° C cellkultur inkubator.
- Nästa dag är medierna från de T75 kolvar aspireras. Kolvarna sköljs med 10 ml PBS. Färska medier glia (10-15 ml) tillsätts sedan till varje kolv.
- Inom 10-12 dagar skall Glia i T75-kolvar vara sammanhängande. Gliaceller sköljs med PBS, och 5 ml av 0,05% trypsin sättes till varje T75-kolv.
- Efter trypsin inkubation vid 37 ° C under 5 minuter, gliaceller är dissocierade och gliaceller från varje T75 kolv är uppdelad i tvåolika kollagenbelagda T75-kolvar.
- Kultur inlägg (Millipore PICM03050) bereds genom att placera dem i 6-brunnars plattor, beläggning dem med kollagen och lufttorkande natten. Glia medier (2 ml vardera) placeras under varje kultur insats.
- Glia från konfluenta T75 kolvar trypsiniserades och såddes på de kultur skären (en T75-kolv per 6-brunnars platta, 2 ml vardera insats). Dessa glia kultur insatser kommer att användas för att konditionera neuronala kulturer.
2. Neuronal kultur
- De täckglas för neuronal odling rengörs genom blötläggning i 70% HNO 3 åtminstone över natten. Täckglasen tvättas sedan med DDH 2 O minst 3 gånger, och torkades i en ugn Isotemp (> 200 ° C) över natten.
- Rengjorda täckglas placeras i en 6-brunnars platta, en täckglas per brunn. Täckglas beläggs med poly-L-Lysin-lösning (2 ml, 0,1% i 100 mM borsyra, pH = 8,5) över natten i en 37 ° C inkubator.
- Denpoly-L-lysin lösningen avlägsnas från täckglasen och täckglasen tvättas 3 gånger med autoklaverat DDH 2 O. Täckglasen inkuberas sedan i en 37 ° C inkubator över natten i medium plätering (Neurobasal kompletterat med 5% värmeinaktiverat hästserum, 10 enheter / ml penicillin, 10 pg / ml streptomycin, Glutamax, 2% B27 tillägg sättes till pläterings mediet samma dag den används).
- På följande dag, pläteringen mediet bort och 2 ml färskt plätering medium med B-27 sätts till varje brunn som har ett täckglas.
- Dräktiga möss (E15-18) avlivas med CO 2, och embryonala möss avlivades genom dekapitering. Hippocampus eller striatum dissekeras från hjärnvävnad och placeras i en 15 ml koniskt rör med iskall dissektion buffert, för odling av hippocampus neuroner eller striatala medelstora neuroner taggiga, respektive.
- Dissekerade hjärnan vävnader dissocieras med papain som beskrivs i steg 1,4) och 1,5).
- Ffter dissociation, är antalet celler i varje neuronala suspensionen räknades med en hemocytometer. Neuroner därefter såddes på varje täckglas vid en densitet av 0,4 x 10 6 celler per brunn i en 6-brunnars platta, och odlades i en 37 ° C inkubator över natten (neuroner är DIV 0).
- Att förbereda insatser glia kultur för konditionering av neuronala kulturer är glia mediet bort från insatserna glia kultur och färskt plätering medium tillsätts (2 ml i insatsen och 2 ml under insatsen).
- Nästa dag (DIV 1), är täckglas med nervceller placerade under insatserna glia kultur, en täckglas i varje brunn.
- Nervceller matas med halva volymen färska förvärmda utfodring media (med B-27) var 3-4 dagar tills de är klara för transfektion och bildhantering experiment.
3. Transfektion
- Neuronal transfektion utförs med Lipofectamine 2000. För varje neuronala kultur (en kultur per täckglas), 2 plLipofektamin 2000 och 1 pg DNA används. Färskt Neurobasal-medium utan tillägg användes för att späda Lipofectamine och DNA.
- DNA och lipofektamin inkuberas under 20 minuter vid rumstemperatur efter blandning.
- Spara 1 ml av mediet från under varje Glia kultur insats, och 1 ml inifrån varje insats och överföra media till ett koniskt rör. Tillsätt samma volym utfodring Media + B27 till den sparade medel och inkubera vid 37 ° C. Detta medium används för neuronal odling efter transfektion.
- Efter 20-min Lipofectamine / DNA-inkubering glia kultur skär bort momentant från 6-brunnsplattor. Den 200 pl Lipofectamine / DNA-blandningen tillsätts till varje täckglas med neuroner. De glia kultur skären återföres därefter till varje brunn, över neuroner. Bubblor under membranet av kulturen insatserna bör undvikas. Neuroner inkuberas med Lipofectamine / DNA-blandningen vid 37 ° C under 2-4 timmar.
- Efter the 2-4 h inkubationsperiod glia skär bort igen. Odlingsmediet med Lipofectamine / DNA-blandningen avlägsnas från varje brunn. Medierna sparade i steg 3,3) sättes till neuroner (2 ml per brunn). Glia kultur skär återförs till varje brunn, och glia media från varje insats avlägsnas, och 2 ml av mediet från steg 3,3) tillsätts till varje insats.
- Neuroner odlas under ytterligare 24-72 timmar för att tillåta expression av transfekterade cDNA innan TIRF avbildning utförs på dessa neuroner.
4. TIRF Imaging
- Artificiell cerebrospinalvätska (aCSF: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM glukos, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCb 2, 25 mM HEPES, pH = 7,4) kommer att användas för levande-imaging experiment. Vårt TIRF avbildning system är anpassade ställa upp med en 100-mW Cyan laser för excitation och en elektron multiplicera Charge Coupled Device (EMCCD) kamera för en detektor.
- Före avbildning experiment är aCSF varnade i en 37 & dt.ex., C vattenbad under minst 30 minuter. Uppvärmningen insats för levande bildåtergivning placeras på mikroskopets objektbord och uppvärmningen insatsen, laser, kamera och värms under minst 30 min före starten av experimenten imaging.
- Ett täckglas med transfekterade neuroner är monterad i den levande-imaging kammare. Den förvärmda aCSF placeras i kammaren när kammaren sammansatta; detta steg bör slutföras så snabbt som möjligt.
- När kammaren är placerad på uppvärmning insatsen på mikroskop scenen, är transfekterade nervceller identifieras visuellt under epi-fluorescerande bildåtergivningsläge.
- Efter friska transfekterade nervceller identifieras (se figur 1 och 2), utför vi vanligtvis 1 minut av foto-blekmedel för att eliminera befintlig pHluorin fluorescens på plasmamembranet, som pHluorin-receptorer på plasmamembranet har mycket höga fluorescens nivåer när TIRF avbildning först startas, stör som med visualisering av individuella programertion händelser.
- Efter photobleach är känsligheten på elektron multiplikator på EMCCD kameran inställd på max, och inspelningen sker under 1 minut vid 10 Hz.
- Varje inspelning kommer att innehålla 600 bilder. Enskilda insättning händelser identifieras genom att spela inspelningen upp med ImageJ. Enskilda införande händelser analyseras manuellt med ImageJ.
5. Representativa resultat
Konsekvent neuronal kultur är nyckeln till framgångsrika levande imaging experiment. Figur 1 visar mus hippocampus nervceller odlade med vår protokoll från DIV 11 till DIV 18. Det framgår av de bilder som nervceller har utvecklat omfattande processer och att de dendritiska processer täcks tätt med Dendritutskotten indikationer på att dessa nervceller är hälsosamma i kultur. Vår kultur protokoll kan också användas för andra typer av nervceller i hjärnan. Till exempel använde vi nyligen detta protokoll till kulturstriatala medelstora taggiga neuroner i en studie för att undersöka dopamin D2-receptorn (DRD2) införande i odlade mus striatala medelstora taggiga neuroner 9. Figur 2 visar mus striatala medel taggiga neuroner odlade med vår protokoll på DIV 8. Vi har också framgångsrikt utfört TIRF avbildning av superecliptic pHluorin-märkta DRD2s i denna typ av neuron. Figur 3 visar expression av pHluorin-märkt DRD2 (pH DRD2) i ett medium taggig neuron och visualisering av pH-DRD2 infogning i denna neuron.
Figur 1. Mus hippocampus kultur med användning av metoden gränssnittet kulturen. DIV: dagar in vitro, är dagen av kulturen anses vara DIV 0. Från bilderna, är det uppenbart att hippocampus neuroner mogna i denna typ av kultur mellan DIV 11 och DIV 15. Vid DIV 11 och 13, är neuronala dendriter täckta med filipodia och omogna ryggar. Vid DIV 15 och18, är neuronala dendriter täckta med stora taggar, en indikation på mer mogna nervceller. Vänster paneler: från lägsta förstoring bilder av mus hippocampus neuroner i olika åldrar. Höger sida: hög förstoring bilder (zooma in på neuronala dendriter av den vänstra panelen) av neuronala dendritiska processer med Dendritutskotten i olika åldrar.
Figur 2. Mus striatala medel taggig neuron kultur med metoden gränssnittet kulturen. Nervceller i bilderna är i DIV 8.
Figur 3. En mus striatal medel taggig neuron transfekterade med super ekliptikan pHluorin-märkta dopamin D2-receptorn (pH-DRD2). Bilden till vänster är maximal intensitet projektion av en time-lapse inspelning (600 bilder, 100 msek per bild). Vita pilspetsar indikerar individuell vesikulär insättning av pH-DRD2. Denna bild behåller insättning information i xy dimensionen men förlorar tidsinformationen. Bilden till höger visar YT maximal intensitet projektion, i vilken xyt stacken roteras 90 grader runt y-axeln, och den maximala pixel på varje x-axellinje projiceras på en enda Y-axeln bildpunkt. Denna bild behåller införing information längs YT axeln men förlorar x-axeln informationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| purified bovine collagen solution (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-045 | |
| penicillin-streptomycin (Pen Strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| sodium pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO, by Life Technologies | 10313-021 | |
| fetal bovine serum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| papain | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.05% trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| poly-l-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636-1G | |
| boric acid | Fisher Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| heat inactive horse serum | GIBCO, by Life Technologies | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Culture Insert | EMD Millipore | PICM03050 |
References
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
- Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
- Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
- Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
- Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
- Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
- Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
- Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
- Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
- Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
- Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
- Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
- Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Kaech, S., Banker, G.
- Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).
