Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen
Summary
Durch die Kennzeichnung die extrazellulären Domänen von Membranrezeptoren mit superecliptic pHluorin, und durch Abbilden diese Fusion Rezeptoren in kultivierten Maus Neuronen, können wir direkt visualisieren einzelnen vesikulären Insertionsereignisse der Rezeptoren in der Plasmamembran. Diese Technik wird maßgeblich bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Rezeptor-Insertion in die Plasmamembran.
Abstract
Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die Rezeptor-zwischen der Plasmamembran (PM) und intrazellulären Kompartimenten erfordert einen experimentellen Ansatz mit ausgezeichneten räumlichen und zeitlichen Auflösung. Darüber hinaus muss ein solcher Ansatz haben auch die Fähigkeit an Rezeptoren auf der PM von denen in intrazellulären Kompartimenten lokalisiert unterscheiden. Am wichtigsten ist, Erfassen Rezeptoren in einem Vesikel erfordert herausragende Nachweisempfindlichkeit, da jedes Vesikel trägt nur eine kleine Anzahl von Rezeptoren. Standard-Ansätze zur Untersuchung Rezeptortransport gehören Oberfläche Biotinylierung durch biochemische Detektion, die sowohl die erforderlichen räumlichen und zeitlichen Auflösung fehlt folgt; und Fluoreszenzmikroskopie Prüfung immunmarkierten Oberflächenrezeptoren, die chemische Fixierung von Zellen erfordert und daher keine ausreichende zeitliche Auflösung 1-6. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir und andere entwickelt und eingesetzt eine neue strategischetegie, dass ermöglicht die Visualisierung des dynamischen Einfügen von Rezeptoren in der PM mit ausgezeichneten räumlichen und zeitlichen Auflösung 7-17. Der Ansatz enthält Tagging von einem pH-sensitiven GFP, das superecliptic pHluorin 18, an den N-terminalen extrazellulären Domäne des Rezeptors. Superecliptic pHluorin hat die einzigartige Eigenschaft, Fluoreszenz bei neutralem pH-Wert und nicht fluoreszierenden bei saurem pH (pH <6,0). Daher sind die markierten Rezeptoren nicht fluoreszierenden wenn sie innerhalb des Lumens des sauren intrazellulären Transport Vesikel oder endosomalen Kompartimenten, und sie werden nur leicht sichtbar, wenn an den extrazellulären neutralen pH-Umgebung ausgesetzt ist, an der äußeren Oberfläche der Uhr. Unsere Strategie konsequent ermöglicht es uns, PM Oberflächenrezeptoren von denen in intrazellulären Vesikeln zu unterscheiden. Um eine ausreichende räumliche und zeitliche Auflösungen, sowie die Empfindlichkeit erforderlich, um dynamische Menschenhandel von Rezeptoren zu untersuchen erreichen, beschäftigten wir insgesamt internen reflektierenion Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), die uns um die optimale räumliche Auflösung der optischen Bildgebung (~ 170 nm) zu erreichen aktivieren, um die zeitliche Auflösung der Video-Rate-Mikroskopie (30 Bilder / sec), und die Empfindlichkeit zu erfassen Fluoreszenz eines einzelnen GFP Molekül. Durch die Abbildung pHluorin-markierten Rezeptoren unter TIRFM konnten wir direkt visualisieren einzelnen Rezeptor-Insertionen in die PM in kultivierten Neuronen waren. Dieser Ansatz kann potentiell Bildgebung einem Membranprotein mit einer extrazellulären Domäne, die mit superecliptic pHluorin markiert werden könnte angewendet werden, und wird Dissektion der wichtigsten Mechanismen, die detaillierte Insertion verschiedener Membranproteine (Rezeptoren, Ionenkanäle, Transporter, etc.) zu ermöglichen die Uhr.
Protocol
Discussion
Aus unbekannten Gründen sind Mäuseneuronen immer schwieriger, Kultur als Rattenneuronen. Nach unserer Erfahrung funktioniert eine Mischkultur aus Neuronen und Gliazellen auch für die primäre kultivierten Maus Neuronen. Allerdings ist eine solche Mischkultur nicht geeignet für TIRF Imaging-Experimente, wie sie in dieser Art von Kultur Neuronen und ihre Prozesse auf der Oberseite des Glia-Zellen wachsen, Situierung der neuronalen Zellkörper und dendritischen Prozesse außerhalb der Reichweite der TIRF-Mikroskopie ne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch Anschubfinanzierung von The Jackson Laboratory unterstützt.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| purified bovine collagen solution (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| penicillin-streptomycin (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| sodium pyruvate | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO | 10313-021 | |
| fetal bovine serum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| papain | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) | SIGMA | DN25-10MG | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-144 | |
| 0.05% trypsin | GIBCO | 25300-054 | |
| poly-l-lysine hydrobromide | SIGMA | P2636-1G | |
| boric acid | Fisher-Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO | 17504-044 | |
| heat inactive horse serum | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher-Scientific | BP310-500 | |
| Culture Insert | Millipore | PICM03050 |
References
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