Summary
Vi beskriver en verdifull diagnostisk analyse som potensielt kan brukes til å bestemme uttak av immunsuppresjon etter transplantasjon uten forhøyet risiko for pode avvisning. Analysen bruker prinsippene om Forsinket hypersensitivitet og gir nøyaktig vurdering av både donor spesifikke effektor og regulatoriske immunresponser montert mottakere.
Abstract
Forsinket hypersensitivitet respons (DTH) er en rask in vivo manifestasjon av T-celle-avhengige immunrespons til et fremmed antigen (Ag) at verten immunsystem har opplevd i den siste tiden. DTH reaksjoner er ofte delt i en sensibilisering fase, med henvisning til den initielle antigen erfaring, og en utfordring fase, som vanligvis følger flere dager etter sensibilisering. Mangelen på en forsinket hypersensitivitet respons til en tilbakekalling Ag demonstrert av huden testing er ofte sett på som et bevis på anergy. Den tradisjonelle DTH analysen har vært effektivt brukt i diagnostisering mange mikrobielle infeksjoner.
Til tross for å dele lignende immun funksjoner som lymfocyttinfiltrasjon, ødem, og vevsnekrose, er den direkte DTH ikke et mulig diagnostisk teknikk hos transplanterte pasienter på grunn av muligheten for direkte innsprøytning som resulterer i overfølsomhet mot donor antigener og pode tap. For å unngå dette problemet, summingenen-to-mus "trans-vivo" DTH analysen ble utviklet 1,2. Denne testen er i hovedsak en overføring DTH assay, hvori humane perifere blodmononukleære celler (PBMC) og spesifikke antigener ble injisert subkutant inn i pinnae eller fotpute av et naivt mus og DTH-liknende hevelse måles etter 18-24 timers 3.. Antigen presentasjon av menneskelige antigenpresenterende celler som makrofager eller DCS-til T-celler i svært vaskulære mus vev utløser inflammatorisk kaskade og tiltrekker seg mus immunceller som resulterer i hevelse svar. Responsen er antigen-spesifikk og krever forutgående antigen sensibilisering. En positiv donor-reaktivt DTH respons i Tv-DTH analysen reflekterer at transplantasjon pasienten har utviklet en pro-inflammatorisk immune disposisjon mot pode alloantigener.
Det viktigste trekk ved denne analyse er at den også kan brukes til å detektere regulatoriske T-celler, som forårsaker bystander suppresjon. Tilskuer undertrykkelse av enDTH tilbakekalling respons i nærvær av donor antigen er karakteristisk for resipienter med aksepterte allografts 2,4-14. Overvåkingen av resipienter for alloreactivity og regulering av Tv-DTH kan identifisere en undergruppe av pasienter som kan ha nytte av reduksjon av immunsuppresjon uten forhøyet risiko for avvisning eller forverret nyrefunksjon.
En lovende området er anvendelsen av Tv-DTH analysen i overvåking av autoimmunitet 15,16 og også i tumor immunologi 17.
Protocol
En. Utarbeidelse av lymfocytter
- Samle blod inn ACD (syresitratdekstrose) rør.
- Isoler PBMC fra friskt humant perifert blod ved hjelp Lymfocytt Separation Medium i henhold til standard metoder.
- Vask PBMC tre ganger med PBS for å fjerne kontaminerende blodplater. Blodplater ble funnet å påvirke trans-vivo DTH analysen. Maximal tillatte blodplater kontaminering av PBMC forberedelse er ≤ 1x10 7 / injeksjon.
- Hvis det er en merkbar røde blodlegemer forurensning, utføre lyse av røde blodlegemer med ACK lysis buffer etter første vask. Fjern ACK buffer ved vasking to ganger med PBS.
2. Utarbeidelse av alloantigen
- Isoler PBMC fra donor perifert blod ved hjelp av fremgangsmåten vist ovenfor.
- Resuspender donor PBMC i PBS ved en konsentrasjon på 120x10 6 celler / ml (4x10 6 celler / 30 pl).
- Tilsett 1 mM PMSF til blandingen for å forhindre proteinetdegradering.
- Sonicate cellesuspensjonen ved hjelp av en syv-sekunders pulser med en 2 mm sonde-sonikator. (Merk: Hold stoffet kaldt og unngå overdreven bobler Hvis skumming skjer, la cellen suspensjon sitte på is for en 2-3 min.).
- Kontroller avbrudd av> 90% av cellene ved hjelp av et hemocytometer.
- Sentrifuger blandingen ved 14000 rpm ved 4 ° C i 20 min i nedkjølt mikrofuge.
- Overfør supernatanten til et nytt 2,0 ml safe-lock rør og bestemme protein konsentrasjon.
3. Cell Forberedelse til injeksjoner
- For hver injeksjon delmengde 7x10 6 PBMC inn 2,0 ml safe-lock rør.
- Sentrifuger ved 6000 rpm i et minutt i microfuge og fjern supernatanten.
- Suspender celler i PBS med eller uten antigener. Juster Injeksjonsvolumet til 35 pl med PBS. Det følgende reaksjonsskjema til injeksjoner:
Negativ kontroll: PBMC + PBS
Positiv kontroll: PBMC + TT / DT (25 & muG / injeksjon)
Eksperimentell antigenspesifikk Response: PBMC + test Ag (4-8 mg / injeksjon)
Eksperimentell antigenspesifikk Regulering: PBMC + test Ag + TT / DT
4. Pre-måling, Injection, og Post-måling
- Anesthetize CB17 SCID mus med isofluran. Mål bak footpad tykkelse ved hjelp av en fjærbelastet målepunktet. Put målepunktet ved midten av fotpute, med en kant berøre siste vandre pute av foten, for å gi en målestokk for å holde målestedet konsekvent. Footpad tykkelse er spilt når måleravlesningen har stabilisert seg.
- Sakte injisere cellesuspensjoner subkutant i footpads til musene med ½ cc insulin sprøyter med 28-gauge nål. Utfør injeksjon med nålen pekende mot tærne, og skråkant vendt opp. (Merk: Pass på at det ikke er noen lekkasje).
- 18-24 time etter injeksjon, anesthetize mus med isofluran og gjenta måling av footpad hevelse.
- Subtropptre tykkelsen av hvert fotpute før injeksjon fra stillingen injeksjon verdi, for å fotpute svellende verdi uttrykker data i enheter på 10 -4 inches. Beregn antigenspesifikk netto hevelse ved å trekke kontroll footpad hevelse (PBMC + PBS) fra footpad hevelse verdier hentet fra de behandlinger (PBMC + donor alloantigen, TT / DT, eller donor alloantigen + TT / DT). En positiv kontroll respons å huske antigen TT / DT på ≥ 25x10 -4 inches enn bakgrunnen svar på PBS er nødvendig for at testen skal være gyldig.
- Bestem inhibering av recall responser i nærvær av donor-antigener ved å sammenligne den netto svellingen av hver injeksjon ved hjelp av følgende formel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En. Evaluering av nyretransplanterte for donor antigen-spesifikk respons ved hjelp av Tv-DTH analysen
For å teste donor-reaktivt cellulær immunitet hos nyretransplanterte vi injisert PBMC fra disse pasientene med donor antigener alene eller sammen med en tilbakekalling antigen tetanustoksoid (TT). Som en positiv kontroll-celler ble injisert med TT alene. Vi observerer tre mønstre av forsinket hypersensitivitet i resipienter (figur 1). Alle pasienter reagert sterkt til Recall Ag (TT). Pasient nr. 62 viser den regulatoriske mønster, karakterisert ved en svak respons på antigen donor og en markert koblet undertrykkelse (67%) for å gjenkalle antigen reaksjon i nærvær av donor-antigen. Dette er mønsteret som har blitt funnet å være assosiert med organ allograft toleranse. Pasient # 48 viser en nonregulatory mønster, som har funksjonen av en svak respons på donor, men ingen knyttet undertrykkelse (eller koblet undertrykkelse <50%). DetteMønsteret har vært hyppig observert hos pasienter som bruker immundempende medisiner. Imidlertid kan noen pasienter fortsatt får etter transplantasjon immundempende legemiddel vise donor antigen-linked undertrykkelse av deres DTH respons. Pasient nr. 8 utstillinger donor-sensibilisert mønster, preget av en høy respons på donor antigen og ingen knyttet undertrykkelse. Dette svaret er forbundet med pode avvisning i kliniske casestudier åtte.
2. Rollen som donor regulering i klinisk oppfølging i nyretransplantasjon
PBMC fra fagene innrullert i ITN507ST observasjonelle studie ble ("Identifisering og Mekanistiske Undersøkelser av Tolerant Nyretransplantasjon Pasienter") testet for donor-spesifikke indirekte sti T effektor og T regulatoriske tiltak ved hjelp av Tv-DTH-analysen og donor (eller donor HLA- matchet surrogat) antigen. Som vist i figur 2A, avslører indirekte sti T effektor svar på donor antigeneren distinkt spektrum over innmelding grupper; footpad hevelse øker etter hvert som pasientens kliniske status spenner fra de som er tolerante overfor de som er kronisk avvisning. PBMCs fra tolerante mottakere indusert redusert eller ingen DTH respons mens PBMCs fra avvise enkeltpersoner utløst sterke hevelsesreaksjoner.
Målingen av anti-donor indirekte vei T regulatoriske reaksjon av den koblede undertrykkelse analysen viste at immunregulering var en viktig mekanisme for renal allograft aksept. Figur 2b viser en nedgang i regulerende responser over området av de fleste (Tol) via mellomprodukt (mono-og SI) til minst tolerante (CR) hos pasienter 14.
3. Overvåking av autoimmunitet bruker Tv-DTH analysen
En lovende området er anvendelsen av Tv-DTH analysen i overvåking av autoimmunitet. BOS, en prosess med fibro-oblitererende okklusjon av små luftveiene itransplantert lungen, er den vanligste årsaken til lunge transplantasjon svikt.
Ved å teste rollen som celle-mediert immunitet mot kollagen type V i denne prosessen, fant vi at den høyeste relative risikoen for bronkiolitt obliterans syndrom (BOS) utvikling ble observert hos pasienter som har utviklet en positiv Tv-DTH respons på kollagen type V i sin perifert blod.
Figur 3 viser at PBMCs fra lungetransplantasjon mottakere, men ikke fra friske kontroller eller kollagen IV-reaktivt Goodpastures syndrom pasienter etter nyretransplantasjon, var ofte kollagen V reaktiv 15.
4. Søknad i tumor immunologi
Trans-vivo DTH åpner nye muligheter innen kreftforskning å prioritere pasienter med prostatakreft for vaksinasjon terapi. Siden regulatoriske T-celler spiller viktige roller i kreftutvikling og progresjon, brukte vi Tv-DTH å teste reaktivitet av PBMCs fra kreftpasienter behandlet med en DNA-vaksine koding prostata syre fosfatase (PAP). Vi brukte tilskuer undertrykkelse av respons å huske antigen for å avgjøre om antigen spesifikke regulatoriske aktiviteter blir fremkalte respons på vaksinasjon. Vi fant at PAP-spesifikke regulatoriske T-celler oppstår spontant hos noen pasienter med prostatakreft, vedvarer under immunisering og hindre påvisning av PAP-spesifikke effektor svar etter immunisering. Hos noen pasienter identifiserte vi PAP-spesifikke regulert T-celle responser før immunisering. Allerede eksisterende regulatoriske T-celler spesifikke for PAP kan være forbundet med den manglende evne til å utvikle antigenspesifikk Th1-type immunresponser etter vaksinasjon. Alternativt pre-eksisterende regulatoriske T-celle responser til PAP vil identifisere pasienter sannsynlighet for å utvikle effektor svar etter flere immunisering. Uansett gir denne analysen en viktig observasjon, som det kan foreslå et middel til å prioritere eller utelukke individual pasienter fra antigen-spesifikk vaksine evaluering 17.
Figur 1. Eksempler på de tre viktigste mønstre av forsinket hypersensitivitet (DTH) funnet i nyretransplanterte pasienter. Pasient PBMCs ble injisert i footpads av CB17 SCID mus med enten tilbakekalling antigen (TT), donor antigener eller med både donor + tilbakekalling antigen. Show er netto hevelse respons over bakgrunnen.
Figur 2. . Indirekte sti T-celle analyse Emner innmeldt i fem grupper: enegget tvilling, klinisk tolerant (Tol), steroid monoterapi(Mono), standard immunsuppresjon (SI) og kronisk avvisning (CR) ble undersøkt for T effektor svar (A) og T regulatoriske tiltak (B) ved Tv-DTH analysen. Alle paneler: Individuelle resultater fra hvert fag (enkelte symboler) og gruppe median (horisontal linje) med kvartiler vises. Signifikante forskjeller mellom gruppene er vist, * p <0,05, ** p <0,01 og *** p <0,001; # p = 0,04, # # p = 0,03, # # # p = 0,008.
Figur 3. Måling av kollagen Type V spesifikk-autoimmunitet ved Tv-DTH analysen. Tv-DTH reaksjoner etter PBMCs hentet fra friske kontroller, nyretransplanterte pasienter med GPS eller lungetransplantasjon mottakere. Alle tre gruppene hadde positive svar (≥ 25x10 -4 inches netto hevelse) å huske antigen, Col (jegI), en fibrilar kollagen bestemt til leddbrusk, ikke lokke fram en Tv-DTH respons hos pasienter eller kontroller. Nyretransplanterte pasienter med GPS hadde forhøyet bety hevelse svar på Col (IV). Lungetransplantasjon mottakere ikke svare på Col (IV), men reagerte på Col (V).
Figur 4. Bruk av Tv-DTH analyse for å vurdere tumor indusert immunregulering. PBMC fra pasienter med prostatakreft ble injisert med prostata syre fosfatase (PAP) alene eller sammen med tilbakekalling antigen TT / DT og som en kontroll prostata spesifikt antigen (PSA) ble injisert med eller uten husker antigen TT / DT. Injeksjon av PAP + TT / DT identifisert PAP antigen-spesifikke regulatoriske celler, som samtidig bruk av PSA var ikke i stand til å undertrykke en DTH respons på TT / DT tilbakekalling antigen.
Figur 5. Reproduserbarhet Tv-DTH analysen. Cryopreserved celler oppnå ved leukaferese på 1/15/2007 ble tint, vasket med PBS, blandet med PBS eller EBV eller p37-TE + EBV (egen peptid) eller p37-MA + EBV (donor peptid) og sprøytet inn footpads. Celler ble testet i følgende tidspunkter: 7/29/2008, 2/23/2010, 9/1/2011, 10.11.2011, 12/15/2011.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den trans-vivo DTH-analysen er en ny diagnostisk test med en potensiell klinisk anvendelse i vurderingen av celle-medierte responser i transplantasjon, kreft og autoimmune pasienter. Det er verdifullt fordi det er ikke bare nyttig for å overvåke tilbakekalling T effektor responser, men også den kan påvise T-regulerende responser. En sikker måte å oppdage menneskelig DTH regulering kan forutsi sikkerheten til immunsuppresjon tilbaketrekking hos pasienter som er kandidater for monoterapi eller toleranse studier.
Tv-DTH er svært følsom for å oppdage den indirekte vei av allorecognition av MHC. Men TV-DTH kan endres for å påvise direkte alloresponse mot intakte donor MHC molekyler. For å oppdage donor antigen-linked undertrykkelse av DTH, kan EBV-LCL celler uttrykker enkelt donor HLA klasse I eller klasse II skal coinjected med pasienten PBMC. Når EBV-LCL ble benyttet som en kilde for antigen i DTH-analyse ble celler gamma-bestrålt med 10.000 rad, og 200.000 celler ble koinjisert med PBMC inn i footpad av SCID mus.
I løpet av utviklingen av Tv-DTH finner vi at flere forhold kan påvirke denne analysen. Det viktigste er en forutsetning for påvisning av bystander suppresjon. Vi gitt bevis for at for å oppdage hemming av en tilbakekalling DTH respons på samlokalisert donor antigen, både utfordringen nettstedet og immunocompetence av musen adoptiv verten er kritiske faktorer som begrenser følsomheten til Tv-DTH test. PBMC fra tolerante resipienter mediert tilskuer undertrykkelse bare når PBMC ble injisert i footpads, og ikke ører, og bare i immunodeficient, ikke immunkompetente mus tre.
Som alle analyser Tv-DTH testen har styrke og svakheter. De enorme fordelene med Tv-DTH analysen omfatter følgende: 1) er veldig følsom og kan pålitelig oppdage menneskelige regulatoriske T-celler, 2) den oppdager regulatoriske T-celler ved deres funksjon ikke av tarving fenotype, 3) det registrerer både Th-1 og Th-17 effektor responser 4) rå cellelysater kan brukes til å detektere regulering uten sensibiliserende pasientene for donor antigen 5) Denne analysen viser høy reproduserbarhet / stabilitet (figur 5). Ulempene er: 1) den krever et relativt stort antall av PBMC per injeksjon, 2) den teknikken krever omfattende opplæring, særlig i bystander suppresjon analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne av dette manuskriptet har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne bidrag fra AM VanBuskirk til utviklingen av vår forståelse av det regulerte DTH respons i resipienter. Dette arbeidet ble støttet NIH tilskudd PO1AI084853 og R01AI066219-06, og av EU-sponset en studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
- Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
- Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
- Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
- Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862 (2002).
- Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
- Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
- Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
- Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
- Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
- Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
- Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
- Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
- Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
- Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
- Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).
