Summary
Nous décrivons un test de diagnostic précieux qui pourrait être utilisé pour décider du retrait de l'immunosuppression après transplantation sans risque élevé de rejet du greffon. Le test utilise les principes de type hypersensibilité retardée et fournit une évaluation précise de ces deux réponses immunitaires effectrices et réglementaires spécifiques donneur supporté par les bénéficiaires.
Abstract
Réponse d'hypersensibilité de type retardé (DTH) est une rapide manifestation vivo de la réponse immunitaire des cellules T dépendantes à un antigène étranger (Ag) que le système immunitaire de l'hôte a connu dans un passé récent. Réactions SRD sont souvent divisés en une phase de sensibilisation, se référant à l'expérience initiale de l'antigène, et une phase de défi, qui suit généralement plusieurs jours après la sensibilisation. L'absence d'une réaction d'hypersensibilité de type retardé à un Ag rappel démontré par des tests cutanés est souvent considéré comme une preuve d'anergie. Le test de SRD traditionnel a été effectivement utilisé dans le diagnostic de nombreuses infections microbiennes.
Bien qu'ils partagent des caractéristiques immunitaires similaires tels que l'infiltration lymphocytaire, l'œdème et une nécrose des tissus, le DTH directe n'est pas une technique de diagnostic possible chez les patients transplantés en raison de la possibilité d'une injection directe entraîne une sensibilisation à des antigènes du donneur et la perte du greffon. Pour éviter ce problème, le bourdonnementun-à-souris de test DTH "trans-vivo" a été développé 1,2. Ce test est essentiellement un test de DTH de transfert, dans lequel les cellules humaines mononucléées du sang périphérique (CMSP) et les antigènes spécifiques ont été injectés par voie sous cutanée dans le coussinet plantaire pennes ou d'une souris naïve et gonflement DTH-like est mesurée après 18-24 h 3. La présentation de l'antigène par les cellules présentatrices d'antigènes humains telles que les macrophages ou DCS pour les cellules T dans un tissu très vasculaire de la souris déclenche la cascade inflammatoire et attire les cellules du système immunitaire de la souris dans les réponses résultant de gonflement. La réaction est spécifique de l'antigène et nécessite une sensibilisation préalable de l'antigène. Une réponse DTH donateurs réactive positive dans le dosage Tv-SRD reflète le fait que le patient transplanté a développé une disposition pro-inflammatoire immunitaire vers alloantigènes greffe.
La caractéristique la plus importante de ce test est qu'il peut également être utilisé pour détecter les cellules T régulatrices, qui provoquent la suppression du spectateur. suppression du spectateur d'unRéponse de rappel DTH en présence de l'antigène de donneur est caractéristique des greffés avec des allogreffes acceptées 2,4-14. Le suivi des patients transplantés pour alloréactivité et la régulation par la télévision DTH peut identifier un sous-ensemble de patients qui pourraient bénéficier de la réduction de l'immunosuppression sans risque élevé de rejet ou de détérioration de la fonction rénale.
Un domaine prometteur est l'application du test Tv-DTH dans le suivi de l'auto-immunité 15,16 et également en immunologie tumorale 17.
Protocol
1. Préparation des lymphocytes
- Recueillir le sang dans des tubes ACD (acide citrate dextrose).
- Isoler PBMC du sang périphérique humain frais en utilisant des lymphocytes milieu de séparation selon les méthodes classiques.
- Laver les CMSP trois fois avec PBS pour éliminer les plaquettes contaminantes. Les plaquettes ont été trouvés pour interférer avec dosage de SRD trans-vivo. Maximal admissible de contamination plaquettaire préparation des CMSP est ≤ 1x10 7 / injection.
- S'il ya une contamination des globules rouges visibles, effectuer la lyse des globules rouges en utilisant un tampon de lyse ACK après le premier lavage. Retirer tampon ACK par lavage 2 fois avec PBS.
2. Préparation de alloantigène
- Isoler PBMC du sang périphérique des bailleurs de fonds en utilisant la procédure ci-dessus.
- Remettre en suspension donateurs PBMC dans PBS à une concentration de 120x10 6 cellules / ml (4x10 6 cellules / 30 pi).
- Ajouter 1 uM PMSF au mélange pour empêcher la protéinedégradation.
- Soniquer la suspension de cellules à l'aide de sept impulsions de 1 seconde avec un sonicateur 2 mm-sonde. (Remarque: Conservez le froid de matériel et éviter les bulles excessives Si de la mousse se produit, laissez la suspension cellulaire assis sur la glace pour un 2-3 min.).
- Vérifier la perturbation de> 90% des cellules en utilisant un hémocytomètre.
- Centrifuger à 14000 rpm à 4 ° C pendant 20 min dans microfuge réfrigéré.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube Safe-Lock 2,0 ml et déterminer la concentration en protéines.
3. Préparation des cellules pour préparations injectables
- Pour chaque aliquote d'injection 7x10 6 PBMC en ml tubes Safe-Lock 2.0.
- Centrifuger à 6000 rpm pendant une minute à centrifuger et éliminer le surnageant.
- Reprendre les cellules dans du PBS avec ou sans antigènes. Réglez le volume d'injection à 35 pi avec PBS. Le schéma suivant est utilisé pour les injections:
Contrôle négatif: CMSP + PBS
Contrôle positif: CMSP + TT / DT (25 & mu; G / injection)
Experimental Antigène spécifique Réponse: CMSP + test Ag (4-8 mg / injection)
Règlement spécifique de l'antigène expérimental: CMSP + test Ag + TT / DT
4. Pré-mesure, Injection et Post-mesure
- Anesthésier CB17 souris SCID avec isoflurane. Mesurer l'épaisseur de la patte arrière à l'aide d'un ressort étrier. Mettez curseur au centre de la patte, avec un bord de toucher le dernier pad de marche du pied, afin de fournir un point de référence pour maintenir le site de mesure constante. Épaisseur du talon est constatée lorsque la lecture de la jauge s'est stabilisée.
- Injecter lentement suspensions cellulaires sous-cutanée dans les pattes des souris en utilisant ½ cc seringues à insuline avec aiguille de calibre 28. Effectuer injection avec pointant l'aiguille vers les orteils et le biseau vers le haut. (Note: assurez-vous qu'il n'ya pas de fuite).
- 18-24 h après l'injection, anesthésier la souris avec mesure isoflurane et répétition de patte gonflement.
- Subtragir l'épaisseur de chaque pied avant l'injection de la valeur post-injection pour obtenir la valeur de gonflement du coussinet plantaire, exprime les données en unités de 10 pouces -4. Calculer l'antigène spécifique de gonflement net en soustrayant le contrôle du coussinet plantaire gonflement (CMSP + PBS) à partir des valeurs de gonflement coussinet plantaire obtenus à partir des traitements (CMSP + donateur alloantigène, TT / DT, ou donateur alloantigène + TT / DT). Une réponse du contrôle positif de rappeler antigène TT / DT de ≥ 25x10 pouces -4 plus de réponse de fond à PBS est nécessaire pour que le test soit considéré comme valide.
- Déterminer l'inhibition des réponses de rappel en présence d'antigènes de donneur en comparant le gonflement net de chaque injection à l'aide de la formule suivante:
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Representative Results
1. Évaluation des receveurs de transplantation rénale pour une réponse spécifique de l'antigène donneur en utilisant un dosage Tv-DTH
Pour tester le donneur réactif immunité cellulaire chez les transplantés rénaux nous avons injecté PBMC de ces patients avec des antigènes du donneur seul ou avec un rappel antigène anatoxine tétanique (TT). En tant que cellules de contrôle positif ont été injectés avec TT seul. Nous observons trois grandes tendances de l'hypersensibilité de type retardé chez les receveurs de greffe (Figure 1). Tous les patients ont réagi fortement à la fonction Recall Ag (TT). Le patient n ° 62 montre le schéma réglementaire, caractérisé par une faible réponse à l'antigène du donneur et une suppression liée marquée (67%) pour rappeler la réponse de l'antigène en présence de l'antigène de donneur. C'est le modèle qui a été trouvé à être associée à la tolérance aux allogreffes d'organes. Le patient n ° 48 présente un motif non réglementaire, qui a la particularité d'une faible réponse au donateur mais pas de suppression lié (ou suppression lié <50%). Cettemodèle a été fréquemment observées chez les patients prenant des médicaments immunosuppresseurs. Cependant, certains patients recevant encore après la greffe médicament immunosuppresseur peuvent afficher donateurs suppression antigène lié de leur réponse DTH. Le patient n ° 8 expositions le motif donateurs sensibilisés, caractérisé par une réponse forte à l'antigène du donneur et aucune suppression liés. Cette réponse est associée à un rejet de greffe dans les études de cas cliniques 8.
2. Rôle de la réglementation spécifique du donneur dans le suivi clinique en transplantation rénale
PBMC de sujets inclus dans l'étude observationnelle ITN507ST, («Identification and Investigations mécaniste de la tolérance de transplantation rénale Les patients") ont été testés pour des mesures réglementaires spécifiques du donneur voie indirecte T effecteurs et T en utilisant le test Tv-DTH et donneur (ou donneur HLA substitut apparié) antigène. Comme le montre la figure 2A, la voie T effectrices réponses indirectes à des antigènes du donneur révèleun spectre distinct entre les groupes de scolarisation; enflure augmente coussinet plantaire que les chaînes de l'état clinique des patients de ceux qui sont tolérants à ceux qui sont chroniquement rejettent. CMSP des bénéficiaires tolérantes induite réduit ou nul réponses DTH alors PBMC d'individus rejetant déclenché des réactions de gonflement forts.
La mesure de l'anti-donneur voie indirecte T réponse réglementaire par le test de suppression lié démontré que la régulation immunitaire est un mécanisme important pour l'acceptation de l'allogreffe rénale. Montre 2B Figure une diminution des réponses réglementaires sur la gamme de plus (Tol) à intermédiaire (Mono et SI) pour tolérantes (CR) patients moins 14.
3. Surveillance de l'auto-immunité en utilisant un dosage Tv-DTH
Un domaine prometteur est l'application du test Tv-DTH dans le suivi de l'auto-immunité. BOS, un processus de fibro-oblitérante occlusion des petites voies aériennes dans l'transplantés pulmonaires, est la cause la plus fréquente de l'échec de transplantation pulmonaire.
En testant le rôle de l'immunité à médiation cellulaire du collagène de type V dans ce processus, nous avons constaté que le risque relatif le plus élevé du syndrome de bronchiolite oblitérante (BOS) de développement a été observée chez les patients qui ont développé une réponse Tv-DTH positive au collagène de type V dans leur le sang périphérique.
La figure 3 montre que PBMC issues de patients transplantés pulmonaires, mais pas de témoins sains ou les patients atteints du syndrome de collagène IV-réactive Goodpasture après une transplantation rénale, ont été fréquemment collagène V réactif 15.
4. Demande en immunologie tumorale
Trans-vivo DTH ouvre de nouvelles possibilités dans la recherche sur le cancer de prioriser les patients atteints de cancer de la prostate pour la thérapie de vaccination. Comme les cellules T régulatrices jouent un rôle important dans le développement du cancer et de la progression, nous avons utilisé Tv-DTH pour tester la réactivité des PBMCs à partir de patients cancéreux traités par un vaccin codant la phosphatase acide prostatique de l'ADN (PAP). Nous avons utilisé la suppression du spectateur de réponse à rappeler antigène à déterminer si les activités réglementaires spécifiques de l'antigène sont provoquées en réponse à la vaccination. Nous avons constaté que les cellules T spécifiques de PAP réglementaires surviennent spontanément dans certains patients atteints de cancer de la prostate, persistent lors de l'immunisation et empêchent la détection de PAP spécifiques réponses effectrices post-vaccination. Chez certains patients, nous avons identifié des réponses des lymphocytes T spécifiques de PAP réglementé avant la vaccination. Cellules T régulatrices préexistantes spécifiques pour PAP peuvent être associés à l'incapacité de développer des réponses immunitaires de type Th1 spécifiques de l'antigène après la vaccination. Sinon réponses des lymphocytes T réglementation préexistante PAP permettra d'identifier les patients susceptibles de développer des réponses effectrices après la vaccination multiple. De toute façon, ce test permet une observation importante, car elle pourrait suggérer un moyen de hiérarchiser ou exclure indivpatients iduels de l'antigène spécifique l'évaluation des vaccins 17.
Figure 1. Exemples des trois principaux motifs d'hypersensibilité de type retardé (DTH) trouvés chez les receveurs de greffe rénale. PBMC de patients ont été injectés dans les pattes de souris CB17 SCID soit avec l'antigène de rappel (TT), des antigènes du donneur ou les deux + antigène de rappel des bailleurs de fonds. Voir la réponse gonflement net sur fond.
Figure 2. . Analyse des cellules T voie indirecte sujets inscrits en cinq groupes: jumeau identique, cliniquement tolérant (Tol), en monothérapie stéroïdes(Mono), immunosuppression standard (SI) et le rejet chronique (CR) ont été étudiés pour les réponses effectrices T (A) et les réponses réglementaires T (B) par dosage Tv-SRD. Tous les panneaux: les résultats individuels de chaque sujet (symboles individuels) et le groupe médian (ligne horizontale) avec quartiles sont affichés. Des différences significatives entre les groupes sont représentés; * p <0,05, ** p <0,01 et *** p <0,001; # p = 0,04, p = # # 0,03 # # # p = 0,008.
Figure 3. Mesure du collagène de type V-auto-immunité spécifique par un test Tv-SRD. Tv-SRD réponses par les PBMC obtenus à partir des contrôles sains, les receveurs de greffe rénale avec GPS ou les receveurs de greffe de poumon. Les 3 groupes ont eu des réponses positives (≥ 25x10 pouces -4 gonflement net) pour rappeler l'antigène, le Col (II), un collagène fibrillaire spécifiques du cartilage articulaire, n'a pas suscité une réponse Tv-DTH chez des patients ou des contrôles. Les receveurs de greffe rénale avec GPS avaient élevé signifie un gonflement des réponses à Col (IV). greffés du poumon n'ont pas répondu à Col (IV), mais ne répondent à Col (V).
Figure 4. Utilisation de dosage Tv-SRD pour évaluer la immunoregulation induite par la tumeur. PBMC de patients atteints du cancer de la prostate ont été injectés avec de la phosphatase acide prostatique (PAP), seul ou avec rappel antigène TT / DT et un contrôle de l'antigène prostatique spécifique (PSA) a été injecté avec ou sans rappeler antigène TT / DT. Injection de PAP + TT / DT identifié des cellules régulatrices spécifiques de l'antigène PAP, en tant que co-administration de PSA n'était pas en mesure de supprimer une réponse DTH à l'antigène de rappel TT / DT.
Figure 5. Reproductibilité du test Tv-SRD. Cellules congelées obtenir par cytaphérèse le 1/15/2007 ont été décongelés, lavés avec du PBS, PBS ou mélangé avec EBV ou p37-TE + EBV (auto-peptide) ou p37-MA + EBV (donneur peptide) et injectée dans coussinets. Les cellules ont été testés dans les points suivants de temps: 7/29/2008, 2/23/2010, 01/09/2011, 10/11/2011, 12/15/2011.
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Discussion
Le test DTH trans-vivo est un test diagnostique roman avec une application clinique potentielle dans l'évaluation des réponses à médiation cellulaire en transplantation, le cancer et les patients auto-immunes. Il est précieux car il n'est pas seulement utile dans le suivi rappel réponses effectrices T, mais il peut aussi détecter des réponses T régulatrices. Un moyen fiable de détecter la réglementation DTH humain peut prédire la sécurité du retrait de l'immunosuppression chez les patients qui sont des candidats pour la monothérapie ou la tolérance des essais.
La Tv-DTH est très sensible pour détecter la voie indirecte de alloreconnaissance de MHC. Toutefois télévision DTH peut être modifié pour détecter alloresponse directe contre des molécules du CMH de donateurs intactes. Pour détecter les donateurs suppression antigène lié de SRD, les cellules EBV-LCL exprimant donateur HLA de classe I ou de classe II peuvent être co-injectée avec CMSP patient. Lorsque l'EBV LCL ont été utilisés comme source d'antigène dans le test DTH, les cellules ont été irradiés par rayons gamma avec 10.000 rad, et 200.000 cellules ont été coinjectée avec CMSP dans le coussinet plantaire de souris SCID.
Au cours du développement de la télévision DTH, nous constatons que plusieurs conditions peuvent influer sur ce test. Le plus important est une exigence pour la détection de la suppression de spectateur. Nous avons apporté la preuve que, afin de détecter l'inhibition d'une DTH de rappel en réponse à un antigène du donneur co-localisée, à la fois sur le site de défi et la compétence immunitaire de l'hôte adoptive de la souris sont des facteurs essentiels qui limitent la sensibilité du test Tv-SRD. PBMC issues de patients transplantés tolérantes médiation suppression du spectateur que lorsque CMSP ont été injectés dans les pattes, et non les oreilles, et seulement dans immunodéficientes, les souris ne immunocompétents 3.
Comme toutes les épreuves du test Tv-DTH a la force et ses faiblesses. Les énormes avantages de l'analyse Tv-DTH sont les suivants: 1) est très sensible et peut détecter de manière fiable les cellules T régulatrices humaines, 2) il détecte les cellules T régulatrices par leur fonction non par tphénotype héritier, 3), il détecte à la fois Th-1 et les réponses effectrices Th-17 4) lysats cellulaires bruts peuvent être utilisés pour détecter la réglementation sans la sensibilisation des patients pour l'antigène de donneur 5) ce test présente une grande reproductibilité / stabilité (Figure 5). Les inconvénients sont les suivants: 1) il faut un nombre relativement important de PBMC par injection, 2) la technique nécessite une formation approfondie, en particulier dans le test de suppression de spectateur.
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Disclosures
Les auteurs de ce manuscrit n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à souligner la contribution de AM VanBuskirk au développement de notre compréhension de la réponse DTH réglementé chez les greffés. Ce travail a été soutenu subventions des NIH PO1AI084853 et R01AI066219-06, et par l'UE parrainé une étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
- Carrodeguas, L., et al. Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity. Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).
- VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).
- Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay. Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).
- Burlingham, W. J., et al. Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis. Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).
- Geissler, F., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression. Transplantation. 72, 571-580 (2001).
- Jankowska-Gan, E., et al. Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH. Hum. Immunol. 63, 862 (2002).
- Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance. J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).
- Rodriguez, D. S., et al. Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching. Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).
- Xu, Q., et al. Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance. J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).
- Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1. J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).
- Jankowska-Gan, E., et al. Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation. Transplantation. 88, 533-541 (2009).
- Jankowska-Gan, E., et al. Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs. Transplantation. 93, 283-290 (2012).
- Knechtle, S. J., et al. Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring. Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).
- Haynes, L. D., et al. Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients. Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).
- Burlingham, W. J., et al. IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants. J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).
- Bobadilla, J. L., et al. TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).
- Olson, B. M., et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).
