Summary
我々は潜在的に移植片拒絶反応のリスク上昇せずに移植後免疫抑制の撤退を決定するために使用することができる貴重な診断アッセイを記述します。アッセイは、遅延型過敏の原則を使用し、受信者によってマウントされたドナーの特定のエフェクターと規制免疫応答の両方の正確な評価を提供します。
Abstract
遅延型過敏反応（DTH）は、宿主の免疫系は、最近、過去に経験した外来抗原銀（Ag）に対するT細胞依存性免疫応答のインビボ発現で迅速である。 DTH反応は、多くの場合、通常、感作した後、数日に続く最初の抗原の経験、およびチャレンジ相を参照して、感作段階に分かれています。皮膚試験により実証リコール銀に対する遅延型過敏反応の欠如は、しばしばアネルギーの証拠としてみなされている。従来のDTHアッセイを効果的に多くの微生物感染症の診断に使用されている。
このようなリンパ球浸潤、浮腫、および組織壊死と同様の免疫機能を共有することにもかかわらず、直接のDTHがあるため、ドナー抗原および移植片喪失感をもたらし直接噴射の可能性の移植患者における実現可能な診断技術ではありません。この問題を回避するには、ハムツーマウス"トランス生体" DTHアッセイは1,2を開発しました。この試験は、本質的にヒト末梢血単核球（PBMC）と特異的抗原がナイーブマウスの耳介又は足蹠に皮下注射し、DTH状の膨潤が18-24時間で3後に測定される転送DTHアッセイである。このような高度に血管マウス組織におけるT細胞にマクロファージや樹状細胞などのヒト抗原提示細胞による抗原提示は、炎症カスケードをトリガし、腫脹応答の結果、マウスの免疫細胞を魅了しています。応答は、抗原特異的であり、事前の抗原感作を必要とします。 TV-DTHアッセイで陽性ドナー反応性DTH応答は移植患者が移植アロ抗原に向かって前炎症性免疫処分を開発したことを反映している。
このアッセイの最も重要な特徴は、それはまた、バイスタンダー抑制を引き起こす調節性T細胞を検出するために使用することができることである。のバイスタンダー抑制ドナー抗原の存在下でDTHリコール応答が認められた同種移植2,4-14で移植レシピエントの特徴である。 TV-DTHによって同種反応性と規制のための移植のモニタリングは、拒絶反応のリスク上昇や腎機能が悪化することなく、免疫抑制の減少から利益を得ることができる患者のサブセットを識別することができる。
有望なエリアは、自己免疫15,16のモニタリングと、腫瘍免疫学17でTV-DTHアッセイのアプリケーションです。
Protocol
1。リンパ球の調製
- ACD（クエン酸デキストロース）のチューブに血液を集める。
- 標準的な方法に従ってリンパ球分離媒体を使用して新鮮なヒト末梢血からPBMCを分離します。
- 汚染血小板を除去するためにPBSでPBMC 3回洗浄する。血小板は、トランスの体内DTHアッセイを妨害することが見出された。 PBMC準備の最大許容血小板汚染は≤1×10 7 /注射です。
- 顕著な赤血球の混入がある場合は、最初の洗浄後にACK溶解緩衝液を用いた赤血球の溶解を行う。 PBSで2回洗浄することによりACKバッファを削除します。
2。アロ抗原の調製
- 上に示した手順を使用して、ドナー末梢血からPBMCを分離します。
- 120x10 6細胞/ ml（4×10 6細胞/ 30μL）の濃度でPBSに再懸ドナーPBMC。
- タンパク質を防ぐために、混合物に1μMPMSFを追加劣化。
- 2mmのプローブ音波処理器で7 1秒パルスを用いた細胞懸濁液を超音波処理。 （注：材料の寒さを維持し、過度の泡を避ける発泡が発生した場合は、細胞懸濁液は、2〜3分間氷上で座らせて。）
- 血球計算板を用いて細胞の> 90％の崩壊を確認してください。
- 冷蔵微量で20分間4℃で14,000 rpmで混合物を遠心分離します。
- 新しい2.0ミリリットル安全ロックチューブに上清を移し、タンパク質濃度を決定する。
3。注射用の細胞調製
- 2.0ミリリットルのセーフロックチューブにそれぞれ注射アリコート7×10 6 PBMCのため。
- 微量で分間6,000 rpmで遠心し、上清を除去します。
- 抗原の有無にかかわらずPBSで細胞を再懸濁します。 PBSで35μlに注入量を調整します。以下のスキームは、注射のために使用されます。
ネガティブコントロール：PBMC + PBS
ポジティブコントロール：PBMC + TT / DT（25＆ムー; G /注射）
実験的な抗原特異的応答：PBMC +テストのAg（4-8μgの/注射）
実験的な抗原特異的レギュレーション：PBMC +テストのAg + TT / DT
4。事前測定、注射、とポストの測定
- イソフルランとCB17 SCIDマウスを麻酔。バネ式キャリパーを使用してリア足蹠の厚さを測定します。測定部位の一貫性を保つためのベンチマークを提供するために、一方の端が足の最後の歩行パッドに触れて、足蹠の中心にキャリパーを配置します。ゲージの読みが安定したときに足蹠の厚さが記録されます。
- ゆっくりと28ゲージの針で½ccのインスリン注射器を使用してマウスの足蹠に皮下細胞懸濁液を注入する。針がつま先の方向を向いて、ベベルを上に向けて注射を行います。 （注：漏れがないことを確認してください）。
- 注入後18-24時間は、足蹠の腫脹のイソフルラン及び繰り返し測定にマウスを麻酔。
- Subtr足蹠の腫れ値を取得するためにポスト噴射値から注入前に各足蹠の厚さを作用、10 -4インチの単位でデータを表す。治療（PBMC +ドナーアロ抗原、TT / DT、またはドナーアロ+ TT / DT）から得蹠腫脹値からコントロール足蹠腫脹（PBMC + PBS）を差し引くことにより、抗原特異的純腫れを計算します。 PBSの背景応答上≥25×10 -4インチの抗原TT / DTをリコールする陽性対照応答が有効であると考えられるためにテストするために必要です。
- 次の式を使用して、各注入の純腫れを比較することにより、ドナー抗原の存在下でリコール反応の阻害を決定する：
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Representative Results
1。テレビ-DTHアッセイを用いてドナー抗原特異的応答のための腎臓移植レシピエントの評価
腎移植におけるドナー反応性の細胞性免疫をテストするには、我々は、ドナー抗原単独またはリコール抗原破傷風トキソイド（TT）と、これらの患者からPBMCを注入した。陽性対照として、細胞を、TT単独を注射した。私たちは、移植レシピエントにおける遅延型過敏症（ 図1）の3つの主要なパターンを観察します。すべての患者は、Agの（TT）をリコールすることを強く答えた。患者＃62は、ドナー抗原の存在下で抗原応答をリコールするドナー抗原と顕著リンク抑制（67％）に弱い応答によって特徴付け規制パターンを示しています。これは、臓器同種移植片の許容差に関連することが見出されているパターンである。患者＃48は展示ドナーに弱い応答の特徴が、無連動抑制（またはリンク抑制<50％）を持ってnonregulatoryパターンを。このパターンは、しばしば免疫抑制薬を服用している患者において観察されている。しかし、まだポスト移植免疫抑制剤を受けた一部の患者は彼らのDTH応答のドナー抗原連動抑制が表示される場合があります。患者＃8が展示ドナー抗原に対する高い応答性、無連動抑制によって特徴付けドナー感パターンを。この応答は、臨床事例研究における移植片拒絶8に関連付けられています。
2。腎移植における臨床モニタリングにおけるドナー特異的な規制の役割
PBMCはITN507ST観察試験に登録被験者から、（ "識別とトレラント腎臓移植患者の機械論的調査"）TV-DTHアッセイおよびドナー（またはドナー使用ドナー固有間接経路TエフェクターとT調節応答について試験したHLA-マッチ代理）抗原。 図2Aに示すように、ドナー抗原に対する間接経路エフェクターT反応は明らか登録グループ間で異なるスペクトル;慢性的に拒否されているものへの耐性があるものから、患者の臨床状態の範囲として、足蹠腫脹増加。寛容な受信者からのPBMCを減少または拒否個人からのPBMCに対し全くDTH応答が強い腫脹反応を引き起こしたん誘導した。
免疫調節、腎同種移植片の受け入れのための重要なメカニズムであることを示したリンク先の抑制アッセイによる抗ドナー間接経路T調節応答の測定図2Bは、中間体（モノを通してほとんどの範囲（公差）を介して規制応答の減少を示し、 SI）少なくともトレラント（CR）の患者14。
3。テレビ-DTHアッセイを使用して自己免疫のモニタリング
有望なエリアは、自己免疫のモニタリングにおけるTV-DTHアッセイのアプリケーションです。 BOSの小さな気道の線維閉塞性閉塞の過程肺移植、肺移植障害の最も一般的な原因である。
このプロセスではV型コラーゲンに対する細胞性免疫の役割を試験することによって、我々は、閉塞性細気管支炎症候群（BOS）の開発が最も相対リスクは、その中のコラーゲンタイプVの正のテレビ-DTH反応を発症した患者で観察されたことがわかっ末梢血。
図3は、肺移植レシピエント由来のPBMCはなく、健康的なコントロールやコラーゲンIV-反応性グッドパスチャー症候群患者からの腎移植後、頻繁にコラーゲンV反応15であることを示した。
4。腫瘍免疫学の応用
トランスインビボDTHは、ワクチン接種療法のため前立腺癌患者を優先する癌研究の新たな可能性を開いている。制御性T細胞が癌の発生と進行に重要な役割を果たすので、PBMCの反応性を試験するためにテレビ-DTHを使用した前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）をコードするDNAワクチンで治療癌患者からの。私たちは、抗原特異的規制活動は、ワクチン接種に応じて、誘発されているかどうかを判断するために抗原をリコールする応答のバイスタンダー抑制を使用していました。 PAP特有の制御性T細胞は、一部の前立腺癌患者において自発的に発生することを我々は発見、予防接種の間持続し、PAP固有のエフェクター応答免疫後の検出を防止。一部の患者では、免疫化の前にPAP特異的調節T細胞応答を同定した。 PAPに特異的な既存の制御性T細胞は、ワクチン接種後の抗原特異的Th1型免疫応答を開発することができないことに関連付けることができる。あるいはPAPへの既存の制御性T細胞応答は、複数の免疫後エフェクター応答を発症する可能性が高い患者を識別する。それは個人ラージヒルを優先さまたは除外する手段を提案するかもしれないとして、いずれにせよ、このアッセイでは、重要な観察を提供しています抗原特異的ワクチン評価17からidual患者。
図1。腎移植患者で見つかった遅延型過敏症（DTH）の3つの主要なパターンの例。患者PBMCをドナー抗原、リコール抗原（TT）のいずれかでCB17 SCIDマウスの足蹠に注入またはドナー両方+リコール抗原とした。ショーは、背景の上にネット腫れ応答です。
図2。間接経路のT細胞分析 5つのグループに在籍科目：。一卵性双生児、臨床的に耐性（公差）、ステロイド単独療法（モノラル）、標準的な免疫抑制（SI）と慢性拒絶反応は、（CR）（B）TV-DTHアッセイによりTエフェクター応答（）とT調節応答を調べた。すべてのパネル：四分位と、各被験者からの個々の結果（個々のシンボル）とグループ中央値（水平線）が表示されます群間に有意差示されています* P <0.05、** P <0.01 *** P <0.001;＃P = 0.04、＃＃P = 0.03、＃＃＃P = 0.008。
図3。健常対照から得たPBMC、GPSや肺移植と腎移植によるコラーゲンタイプTV-DTHアッセイによるV特定-自己免疫。テレビDTH応答の測定 。すべての3つのグループは、私がコル（、抗原をリコールする肯定応答（≥25×10 -4インチネット腫れ）を有していたI）、関節軟骨に特有fibrilarコラーゲンは、患者やコントロールでTV-DTH応答を惹起しなかった。 GPSと腎移植レシピエントは、コル（IV）への応答を腫れ意味上昇していた。肺移植レシピエントは、コル（IV）に応答しませんでしたが、コル（V）に対応するんでした。
図4。腫瘍誘発性の免疫調節を評価するため、TV-DTHアッセイの使用。前立腺癌患者からのPBMCは、単独で、またはリコール抗原TT / DTとと制御前立腺特異抗原（PSA）の有無にかかわらず注入したとして、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）を注射した抗原TT / DTを思い出す。 PAPの注入+ PSAの同時投与は、TT / DTリコール抗原に対するDTH反応を抑制することができませんでしたようにTT / DTは、PAP抗原特異的調節細胞を同定した。
図5。テレビ-DTHアッセイの再現性。凍結保存した細胞は、1/15/2007に白血球搬出により得るが、解凍PBSで洗浄し、PBS又はEBVまたはP37-TE + EBV（自己ペプチド）またはP37-MA + EBV（ドナーペプチド）と混合した足蹠に注入した。 2008年7月29日、2010年2月23日、2011年9月1日、2011年10月11日、2011年12月15日：細胞は、次の時点で試験した。
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Discussion
トランス生体DTHアッセイは移植、がんや自己免疫患者における細胞性免疫応答を評価する上での潜在的な臨床応用を有する新規な診断テストです。それがリコールTエフェクター応答をモニタリングに有用であるだけでなくので、それは貴重ですが、またそれはT調節応答を検出することができます。人間DTHレギュレーションを検出する信頼性の高い方法は、単剤療法または耐性試験の対象である患者における免疫抑制の撤退の安全性を予測することがあります。
TV-DTHは、MHCのallorecognitionの間接経路を検出するための非常に敏感です。しかし、TV-DTHはそのままドナーMHC分子に対して直接alloresponseを検出するように改変することができる。 DTHのドナー抗原 - 結合抑制を検出するために、単一のドナーHLAクラスIまたはクラスIIを発現するEBV-LCL細胞を患者PBMCと共に同時注入することができる。 EBV-LCLがDTHアッセイにおける抗原の供給源として用いた場合、細胞は10,000ラドでガンマ線照射し、200,000細胞が共存したSCIDマウスの足蹠にPBMCを注入。
TV-DTHの開発の過程で、私たちはいくつかの条件がこのアッセイに影響を与えることができることがわかります。最も重要なものは、バイスタンダー抑制の検出のための要件です。私たちは、順番に共局在ドナー抗原に反応してリコールDTHの阻害を検出するという証拠を提供し、両方のチャレンジサイトとマウス養子宿主の免疫能は、TV-DTHテストの感度を制限する重要な要因である。トレラント移植レシピエントからのPBMC PBMCが蹠に注入ではなく、耳、そして唯一の免疫不全、免疫ではないマウス3にされた唯一の媒介バイスタンダー抑制。
全てのアッセイと同様に、TV-DTHテストは、強さと弱さを持っています。 TV-DTHアッセイの途方もない利点は、以下のものがあります1）はtで、その関数によって制御性T細胞を検出しない）非常に敏感であり、確実に人間の制御性T細胞、2を検出することができます後継者の表現型、3）は4）粗細胞溶解物をドナー抗原5に対して患者の感作することなく、規制を検出するために使用することができるのTh-1番目の17エフェクター応答の両方を検出する）このアッセイは、高い再現性/安定性（ 図5）を提示する。欠点は次のとおりである：1）それは注射あたりPBMC比較的多数を必要とする、2）技術は、特にバイスタンダー抑制アッセイで、広範囲の訓練を必要とします。
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Disclosures
この原稿の著者は、開示する利害の衝突を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、移植レシピエントにおける規制DTH応答の我々の理解の発展にAM VanBuskirkの貢献を承諾したいと思います。この作品は、NIHの助成金PO1AI084853とR01AI066219-06を支持し、EU主催の一つの研究でされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
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