在文化序列富集的精原干细胞和祖细胞（SSCS）推导长期成年小鼠SSC线

Summary

这里介绍一个简单的方法来获得和保持从成年小鼠精原干细胞和祖细胞株。该方法利用从体细胞室的成年小鼠睾丸的饲养层细胞。这种技术适用于常见的小鼠品系，包括转基因，基因敲除，基因敲除的小鼠。

Abstract

精原干细胞和祖细胞（精原干细胞）的睾丸一个典型的例子成年哺乳动物干细胞，保留生育功能接近的动物的寿命。虽然确切的管理机制，自我更新和分化的体内具有挑战性的研究，已开发各种系统以前传播小鼠精原干细胞在体外结合使用专门的培养基和饲养层细胞^1-3。

大多数体外先遣部队到SSC的生物学中衍生的细胞系，从新生儿，可能是由于在获得成人细胞系⁴的难度。但是，睾丸的不断成熟，直到〜5周龄在大多数小鼠品系中。早在产后期间，戏剧性的变化发生在睾丸的结构和在生物的体细胞和生精细胞，包括大量的干细胞相关的表达水平的改变基因。因此，出生衍生的SSC线可能无法完全概括成人精原干细胞的生物学特性，坚持成年后的睾丸已经达到了稳定状态。

有几个因素阻碍了成人SSC线的生产历史。首先，功能干细胞的比例可能会降低成年时期，无论是由于内在或外在因素^5,6。此外，与其他成体干细胞，它一直难以丰富精原干细胞，占成人睾丸细胞，而无需使用相结合的免疫选择或其他排序策略的^7。通常采用的策略包括隐睾小鼠作为供体细胞的来源，由于到一个更高的干细胞比其它类型的细胞⁸使用。基于的假设，即从最初的文化破坏去除体细胞相互作用的干细胞小生境为SSC生存所必需的，我们以前开发的方法，以获得成人的升国际核事件分级不需要免疫选择或隐睾捐助者，但而采用串行富集的精原干细胞的培养，以下简称为SESC ^2,3。

下面描述的方法需要一个简单的程序，用于导出成人SSC通过分离成年供体，接着通过电镀睾丸基质细胞系^（JK1）3组成的供料器上的细胞的生精小管的线。通过串口从文化，同时富集的精原干细胞传代，牢固地粘附被耗尽，污染非生殖细胞。以这种方式生产的文化包含在不同分化阶段的精原细胞的混合物，其中包含SSC的，基于长期的自我更新能力。关键的SESC方法是，它使精原干细胞在体内长期在体外的自我更新一个完全不同的微环境，使艰难的过渡，从自我更新，产生的污染长期的SSC线，免费体细胞，从而使随后的实验操作SSC的。

Protocol

1。饲养细胞的制备

请注意，下面描述的所有试剂应在无菌的方式（请参阅表1和表2）。此协议采用JK1细胞系（了解Cell Biolabs公司，目录＃CBA-315），这是成年小鼠睾丸体细胞的转化的衍生物和其它地方已经描述了³作为馈线。还要注意的是，所有的动物程序应按照机构的指导方针和法规进行。

1. JK1细胞可以维持在培养，并成功地用来作为馈线通路39。文化JK1细胞在100毫米的细胞培养皿（BD隼，目录＃353003）用10毫升过滤灭菌馈线生长培养基（DMEM培养基补充有10％牛胎儿血清[胎牛血清，2mM的L-谷氨酰胺和抗生素）。当培养达到95％汇合，分裂的细胞1:6 -1:10比。
2. 删除介质融合的JK1饲养细胞单层。
3. 一次，用PBS洗细胞层，无钙和镁。
4. 加入预热的胰蛋白酶/ EDTA，1×（0.05％trypsin/0.53 mM的EDTA，康宁Cellgro，产品编号25-051-CI），并于37°C为5-10分钟。
5. 失活胰蛋白酶与馈线等体积的生长培养基中。离心收集细胞，并在300×g离心5分钟。重新悬浮细胞在馈线生长培养基。
6. 预涂多孔细胞培养板中，加入足够的0.4％明胶溶液覆盖，并在室温下5分钟后，移除。
7. 板〜250个细胞每mm ²在明胶包被的细胞培养板（ 例如，48孔或6孔的格式）。为16至24小时，在37°C孵育文化。
8. 将培养基井。注意：要灭活细胞的生长，添加新鲜的溶液中于10微克/毫升丝裂霉素C的DMEM中稀释到各孔中（ 例如，200μl/孔的48孔板）。丝裂霉素-C是有毒的。小心处理和处置的。孵育37℃下4小时。
9. 从细胞中移除丝裂霉素-C溶液。用DMEM洗涤3次之前电镀干细胞。
10. 删除的DMEM从饲养细胞井，并添加足够的干细胞的培养基（100μl/孔的48孔板; 见表3），以防止干燥，将进料器中的传代。添加精原干细胞在同一天，如下面的第3.1或3.4，使用指定大小的孔中馈线。

2。解离的小鼠睾丸组织获取供体精原细胞

1. 收获成年小鼠睾丸在无菌的时尚和暂时存放在有盖培养皿（不添加任何液体）睾丸。这道菜必须立即放置在冰上，以防止使干燥，保持细胞活力。
2. 使用无菌细的钳和罚款剪刀在细胞培养罩，作一横切口的白膜没有完全横断的睾丸（ 即切〜½ - ¾距离THRough），并用钳子挤出板;丢弃图尼卡和连接组织到一个角落里的曲细精管。查看板置于冰上整个保持组织的冷冻，从而保持其完整性和防止蒸发。
3. 快速切末管细春风似剪刀至少每3分钟睾丸，同时保持冰盘上。
4. 收集在50毫升锥形管和肾小管片段洗〜40毫升冰鲜PBS / 1％牛血清白蛋白。
5. 离心60 xg离心10分钟，分离肾小管从精子和碎片的碎片。弃去上清液。
6. 在一个15毫升锥形管中，将沉淀重悬于3毫升每睾丸预热的离解缓冲液（DMEM培养液，0.05％胰蛋白酶，0.03％胶原酶I型，80 U / ml的DNA酶I和0.5％牛血清白蛋白，请参阅表2的离解缓冲液中的更具体的细节）。
7. 水平放置的锥形管的齿条在振动机中设置到150 rpm，在37℃下进行15分钟至最大化gitation。
8. 降速在60×g离心10分钟，未解离的组块的独立的单细胞。
9. 下次含颗粒的块，直到下一个步骤。收集上清从步骤2.8，并加入3毫升DMEM/10％胎牛血清中离解缓冲液。将管上的冰是暂时的。
10. 重复步骤2.6〜2.7与保存的颗粒从2.9步重新消化块后剩余的步骤2.8。
11. 加入等体积的DMEM/10％FBS中和离解缓冲液。
12. 从步骤保存的细胞悬液从步骤2.9 2.11重组暂停。以300×g离心5分钟。
13. 在一个体积为16毫升每对睾丸干细胞培养基重悬沉淀（ 见表3）。

3。电镀睾丸细胞悬液

1. 板2毫升每孔的细胞悬浮液中的6孔板中含有饲养细胞的有丝分裂，丝裂霉素-C和地点在细胞培养箱灭活在37＆度，C在5％CO _2。
2. 48小时后，吸出培养基，添加2毫升的新鲜培养基中，并返回到培养箱。
3. 48小时后，向每孔加入0.5毫升新鲜干细胞培养基，并返回到培养箱。
4. 48小时后，随后喂细胞每周三次，此后如下，直到大，谨慎的殖民地（> 50个细胞）出现（7至21天之内）。对于第一和第二供给每星期（ 例如星期一和星期三）删除〜50％的培养基中，并添加50％（体积）的新鲜培养基。对于第三喂养（ 例如星期五），吸出所有的中型和2毫升新鲜培养基更换。这种方法是基于上的理由，避免完全培养基变化浓度的旁分泌信号被分泌到培养基中⁹波动最小化。

4。殖民地采摘的第一通道

1. 删除介质的井，传代的殖民地，并添加新鲜的干细胞培养基。
2. 使用10倍的目标识别殖民地。稍微聚焦显微镜，SSC菌落在井沿将显示为均匀的明亮的团块，包括许多11-12微米直径的细胞，其中它是困难或不可能辨别个别单元格边框，由于细胞出现熔合在一起（ 图1A）。可能会出现非SSC菌落较暗，粒状，或不太均匀，可辨别的边界（ 图1A，插图）。
3. 用200μl移液管尖，与设置到50μlpipetteman，首先占用介质从阱和驱逐润湿小费。然后，轻轻地用刀尖轻移殖民地之前迅速取出50μl的培养基撞出到的前端（ 图1B）通过吸菌落。
4. 驱逐到一个孔的含有灭活的饲养细胞用100μl的干细胞培养基中（ 图1C）的48孔板的培养基中的菌落。
5. 重复步骤4.3和8殖民地同井，每口井不超过500微升。
6. 重复步骤4.3至4.5的48孔板准备新井，通过一个SSC殖民地。
7. 井将在7-14天，分裂后的大团块高达500个细胞出现（ 图1D）。

5。随后的扩大和传代SSC的研制

1. 到新鲜的馈线，第一代的细胞传代培养后至14天的第3代和分流比为1:2 1:4 1:6（每7天），此后如下。通过跨细胞洗涤介质与1毫升移液管尖轻轻捣碎菌落关闭半汇合井（ 如 〜300,000精原干细胞/孔的6孔板）。菌落可以看出分离。液体流用力过猛，会造成不必要的饲养层细胞来过。
2. 在锥形管和离心收集捣碎细胞在300×g离心5分钟。注：可以安全地在这里添加一个胰蛋白酶消化步骤，如果需要的话，研究者。
3. 吸液上清液，并重新悬浮于新鲜的干细胞培养基彻底上下吹打扰乱菌落。
4. 板精原干细胞对丝裂霉素-C的新鲜制备的饲养层细胞失活，如第1节所述。
5. 饲料细胞3次，每周如下。对于第一和第二馈电（ 例如，星期一和星期三）中添加50％（体积）的新鲜培养基。对于第三喂养（ 例如星期五），吸出所有的中型和2毫升新鲜培养基更换。板将成为在7-10天内汇合。文化应该由98％的生殖细胞（ 即 <1％的污染体细胞）5-7通道后，根据免疫组化（ 例如 ，使用小鼠生殖细胞标记GCNA）来区分生殖细胞，体细胞^10。注：这些方法是在符合规定和要求，提出由该机构。人动物管理和使用委员会在威尔康乃尔医学院。

Representative Results

通路零野生型的外观，成人SSC菌落后7天是在图1中所示。三维菌落由连接的馈线或由喂料器具有多个层的生长在上面的SSC的下属的细胞外基质沉积的层的扁平细胞。虽然健康的SSC的是明亮的折射和均匀地11-12微米直径，单元格边框是难以区分的菌落的大小可能是高度可变的，在井之间以及从不同的小鼠制备的孔。是由计算机辅助可视化的菌落相显微镜，数字显示和稍微为重点的的焦平面，从而提高高度同质化的SSC的殖民地，污染这是目前早日获得通过（0-2）文化和体细胞之间的对比不能形成致密的菌落（参见图1A中的插图）。请注意，饲养细胞的形态，将逐渐改变，自动对焦之三从DMEM/10％切换到干细胞培养基中与丝裂霉素C.It灭活后是也重要的是要注意，在最初的细胞悬浮液没有被过滤或紧张，因为残余的体细胞团块被认为能够增强SSC的生存的时间的初始电镀和不应该被删除建立直到SSC菌落。串行传代（>的5-7倍）的所需的纯化的生殖细胞到接近均匀性（> 98％），消耗剩余的体细胞。如果随后的实验中，将特别需要丰富的文化从总人口的生殖细胞的干细胞，然后细胞选择使用免疫磁珠或流式细胞仪可用于进一步净化，例如，干细胞富集，可以使用抗Thy1系，CD9，α6整合素和其他^11。使用免疫分型，基因表达，并通过移植精原干细胞的身份随后证实，因为transplantat离子的分析是准确地估计出的数量正宗的，功能的干细胞^12,13的唯一途径。

图1。 SSC殖民地早期，睾丸间质细胞和馈线的形态。A，外观新生SSC殖民地〜5天，才开始电镀。插图显示污染的通路零培养的单核细胞等体细胞，B，用于第一通道的单个菌落（约14天）到48孔板的选择和采摘。黑色结构的吸头。C，外观灭活JK1饲养层细胞。 D，大殖民地之前，常规传代培养。箭头表示SSC殖民地。在A中的比例尺为100微米（插图，为50μm），并在BD中是200微米。

Discussion

这种方法获得成人精原干细胞，成人睾丸源性饲养层细胞是强大的，并已成功常见的遗传背景（ 例如，FVB，C57BL6和129SV/C57Bl/6混合）以及不同的突变株时，采用^2,3,7,14。事实上，所创造的文化系统中的微环境，是足以克服一些对维持精原干细胞在成人体内 （ 例如，在的情况下，PLZF ^{- / -}动物）的基因屏障。虽然我们采用JK1细胞作为供料器，非转化成人睾丸体细胞也可以使用具有相同的疗效，JK1细胞^2,3。

SESC的目的是要有效地获得长期的成人SSC线。不幸的是，高效率的实现由于以下原因，与一个权衡。的过程中的一个显着的限制是，在初始电镀的时间的步骤的滤波或束紧的遗漏和操纵，再修改的Ë涉及，这可能会影响细胞的存活，可能会造成很大的变异性，以及镀细胞数，这就排除了有效的定量集落形成的初始阶段。然而，可以进行定量分析，在哪一个时间，可以容易地制备单细胞悬浮液通过标准的胰蛋白酶消化（>通道5-7）稍微购买的通路文化。

由于文化的精原干细胞在成人可以几乎无限的扩充和维护，该协议使高效率的生产，可用于随后以类似的方式，建立了原代培养或细胞系（ 即基因和蛋白表达的分析或异位表达的细胞株基因利息）。然而，它是必不可少的金标准或其他有效的替代试验，如SSC集群形成实验^12,15移植分析，最终确认结果。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	-
Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercapt–thanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
Table 3. Stem cell medium
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.