Summary
Demonstration af de vigtigste metoder til high throughput blad målinger. Disse metoder kan anvendes til at accelerere blad fænotypebestemmelse når man studerer mange plante mutanter eller på anden måde screening planter ved blad fænotype.
Abstract
High throughput fænotypebestemmelse (phenomics) er et effektivt værktøj til at forbinde gener til deres funktioner (se anmeldelse 1 og nylige eksempler 2-4). Bladene er den primære fotosyntetiske organ, og deres størrelse og form varierer developmentally og miljømæssigt i en plante. Af disse grunde undersøgelser af blad morfologi kræver måling af flere parametre fra mange blade, som gøres bedst ved halvautomatiske phenomics værktøjer 5,6. Canopy skygge er et vigtigt miljømæssigt cue, der påvirker plante arkitektur og livshistorie, den suite af svarene er samlet kaldes skygge unddragelse syndrom (SAS) 7. Blandt SAS responser, er skygge induceret Bladstilken forlængelse og ændringer i bladet område særligt anvendelige som indeks 8. Til dato, kan bladform programmer (f.eks SHAPE 9, LAMINA 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) måle blad konturer og kategorisere bladformer, Men kan ikke udsende bladstilk længde. Mangel på store målesystemer af blade bladstilke har hæmmet phenomics tilgange til SAS forskning. I denne artikel beskriver vi et nyudviklet ImageJ plugin, kaldet LeafJ, der hurtigt kan måle bladstilk længde og bladplade parametre i modellen planten Arabidopsis thaliana. For den lejlighedsvise blad, der krævede manuel korrektion af stilk / bladpladen grænse brugte vi en touch-screen tablet. Endvidere blad celleform og blade celleantal er vigtige determinanter for blad størrelse 13. Adskilt fra LeafJ vi også præsentere en protokol for at bruge en touch-screen tablet til måling af celleform, område og størrelse. Vores blad træk målesystem er ikke begrænset til skygge-unddragelse forskning og vil accelerere blad fænotypebestemmelse af mange mutanter og screening planter ved blad fænotypebestemmelse.
Protocol
1. Plantematerialer
Bemærk, at denne plante vækst Protokollen skal til detektering skygge avoidance response. Du kan dyrke planter under din favorit tilstand.
- Drys Arabidopsis thaliana frø på vand gennemvædet filtrerpapirarkene i 9 cm petriskåle og gemme (stratificere) dem ved 4 ° C i fire dage i mørke.
- Overføre disse petriskåle til simulerede solforhold: 80-100 μE fotosyntetisk aktiv stråling (PAR) og langt-rød supplement til bringe R: FR-forholdet til 1,86. Anvende lange dages betingelser (16 timers lys / 8 timers mørke) og konstant temperatur på 22 ° C. Inkuber i denne tilstand i tre dage for at tillade frøene at spire.
- Overfør spiret frø til jorden og holde planter under sol. For storskalaforsøg, anbefaler vi forbereder små tags til mærkning hver planter ved at bruge Data Merge Manager i Microsoft Word 2004 (eller nyere) til fremstilling af etiketter.
- Elleve dage efter transfer til jord, flytte halvdelen af de planter til skygge betingelse: samme som solen, men med supplerende langt rødt lys for at bringe R / FR-forholdet til 0,52.
- Efter yderligere tolv dage, er planterne klar til blade billeddannelse. På dette stadium de ældre blade er fuldt modnet hvorimod yngre blade stadig ekspanderer, så du fange et øjebliksbillede af udviklingen. Du ønsker måske at vælge en anden udviklingsmæssig tid afhængigt af dine behov.
2. Optagelse dissekeret Leaf Images
- Forbered transparenter mærket med plante genotype og vækst tilstand med fem rektangulære rammer. Én ramme svarer til blade fra en plante. Microsoft Excel kan bruges til at udskrive en konsekvent gitter med etiketter.
- Dissekere blade på 26 dage gamle planter.
- Scan blade ved 600 dpi på en flad-bed scanner. Bemærk at blade fra en plante skal placeres lodret i en sort vindue i en sandwich af gennemsigtige plader. Undgå at berøre bladetil en sort vinduesrammen og overlappende blade, der vil give fejl i følgende procedurer.
3. Leaf Image Analysis ved LeafJ
- Hent ImageJ Træk LeafJ.jar fil ind i plugins mappen ImageJ.
- Åbn en billedfil i ImageJ 1.45s eller senere 14.
- Opdel billedet i tre farvekanaler (rød, grøn og blå) med "Image> Farve> Split Channels" og anvende tærsklen til billedet i den blå kanal.
- Vælg alle bladene fra en plante af en rektangelværktøjet (figur 1A).
- Vælg "LeafJ" fra plugin menu.
- Vælg annotation information for dette anlæg fra den dialogboks, der vises. Duredigere standardværdier, der vises her ved at klikke på "Rediger disse indstillinger".
- Efter at have kørt LeafJ plugin og før du klikker på "OK" knappen, redigere spores linjer fra området af interesse (ROI) bestyrer vinduet (hvis det er nødvendigt, figur 1B). En touch-screen tablet (såsom en iPad) er nyttig til denne procedure. iPads kan tilsluttes til en computer som en ekstern skærm ved hjælp af Air Display software.
- Eksport måleresultater og tilknyttede oplysninger (filnavne, blomstrende tid, dissekeret af, målt ved osv.) til Microsoft Excel eller tilsvarende software.
4. Leaf Cell Image Analysis i ImageJ
- Fix dissekeret blade som beskrevet i reference 15 efter scanning (trin 2). FAA faste blade kan holdes i 4 ° C i mindst 6 måneder.
- Ryd bladene ved at ændre FAA fiksativ til chloralhydrat opløsning og inkuber blade for 1 ~ 2 timer før mikroskopisk observation 15.
- Mount blade på mistativet glider med trichomes opad. Anvendelse af 40x forstørrelse på en sammensat mikroskop, afbilde mesophyll lag af midten af hvert blad på hver side af den primære vene, undgår celler nær trichomes eller vener.
- Trace blad celle skitserer ved ImageJ ROI manager værktøj med hjælp af touch-screen tablet og en stylus (som beskrevet i trin 3). Cell billedanalyse bruger de indbyggede funktioner i ImageJ men kræver ikke LeafJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Leaf Images Viser Skøn af Bladstilk og Leaf Blade Boundary, og deres Måling Vindue
En af de mest nyttige funktioner i LeafJ er automatiseret detektering af bladpladen / bladstilken grænse (Figur 1). The LeafJ algoritme fungerer på følgende måde: den indbyggede ImageJ ParticleAnalyzer funktionalitet anvendes til at finde og bestemme orienteringen af bladene inde i brugerens valg. For hvert blad bredden af bladet bestemmes langs bladet samlede akse. Derefter ændringen i bredden ved hver position langs aksen bestemmes ved anvendelse af en løbende vindue (den gennemsnitlige bredde af de syv positioner proksimalt for fokusposition subtraheres fra den gennemsnitlige bredde af de syv positioner distalt for den fokusposition). Bladstilken / klingen grænse er defineret som den første stilling ud over den bladfoden hvor ændringen i bredde er større end 90% af alle beregnede bredde forskelle. LeafJ gør yderligere kontrol for at øge reliabiheden af denne indkaldelse, specifikt LeafJ kræver også, at 1) bredden overstiger den smalleste 5% af positioner i længden (dette forhindrer afvigende opkald på stilk base), 2) i regionen proksimalt for fokusposition ikke har en større ændring i bredden og 3) bredden af bladet 20% distalt for fokusposition er mindst 150% større end ved den fokusposition (sandt, hvis fokusposition ligger grænsen fordi 20% proximalt til grænsen bør være blad og derfor meget større).
Når LeafJ har defineret bladstilken / klingen grænse, indbygget ImageJ klasser og metoder anvendes til at bestemme klinge areal, omkreds, og cirkularitet. Indbygget ImageJ anvendes også til at passe en ellipse til kniven og til beregning af storaksen og lilleaksen for at ellipse (herefter anvendes som blad længde og bredde). Bladstilken længden bestemmes af en linie, som strækker langs midten af stilk-området.
2. Påvisning af Shade-induceret Bladstilk Brudforlængelse </ P>
At spørge, om LeafJ målinger var nyttige i at analysere skygge unddragelse, brugte vi en blandet effekt model med behandling og blade nummer som faste effekter og replikere som en tilfældig effekt. Vi fandt, at stilken længde, blad areal, bladlængde, klinge bredde, og stilk længde / bladlængde forholdet var signifikant påvirket af skygge behandling, mens klingen cirkularitet og vingens længde / klinge bredde ikke var (p <0,05). Vore data viser, at LeafJ plugin er anvendelige til undersøgelser på blad skygge undgåelse reaktioner (figur 2).
3. Nøjagtighed og hastighed af LeafJ Plugin
At bestemme ydeevnen af LeafJ plugin i større datasæt vi sammenlignet driftstid og nøjagtighed mellem manuel og plugin målinger. For manuelle målinger vi definerede bladstilken / klingen grænsen som det sted, hvor fløjbredde syntes hurtigt at stige. Det tog en erfaren forsker i gennemsnit 1 9 min 3 sek at måle en gennemsigtighed med fem planter (omkring 50 blade) ved manuel måling, mens med LeafJ det tog kun 3 min 20 sek. Gennemsnit over 5 transparenter, måling med plugin var 5,7 gange hurtigere end manuel måling. Den manuelle måling blev udført af en forsker med erfaring i at gøre mange manuelle målinger en nybegynder ville være betydeligt langsommere ved manuel måling, hvilket resulterer i en endnu større fordel af LeafJ. Vi vurderede nøjagtighed ved at sammenligne data fra de to metoder, dataene blev stærkt korreleret til alle blade parametre (Figur 3). Af de 3.532 datapunkter var der 172 (4,9%), der viste store forskelle mellem de metoder (påvist ved at være afvigende på korrelation plots). Vi analyserede årsagen til disse outliers. Af 172 outliers var 29 på grund af fejl i løbet af LeafJ plugin måling og 143 skyldtes fejl i manuel måling. Denne fejl Analysen viste også nøjagtighed plugin måling.
jove_step "> 4. Cellestørrelse og Cell Antal MålingUafhængigt af LeafJ vi også udviklet et effektivt workflow til måling af celletal og størrelse. Teoretisk celletal og størrelse kan anvendes til at klassificere mutantplanter af ni kategorier i sammenligning med vildtype, (1) mindre celler størrelse med nedsat celletal, (2) mindre celler med normale celleantal, (3) mindre celler med forøget celle tal, (4) normal cellestørrelse med nedsat celletal, (5) normal cellestørrelse med normale celleantal, (6) normal cellestørrelse med nedsat celletal, (7) større cellestørrelse med nedsat celletal, (8) større cellestørrelse med normale celleantal, (9) større cellestørrelse med forøgede celleantal 15,16. Vi målte blad celleparametre i 67 genotyper af Arabidopsis thaliana ved hjælp af vores tablet-baserede cellestørrelse og celle nummer målemetode. Vi målte cellestørrelse på 8.629 celler fra 877 blade 224 planter. Multiplikation af celledensitet by bladareal (målt ved LeafJ), vi anslog blad celleantal data fra 438 blade fra 219 planter. Vores analyse placeres disse genotyper i seks af de mulige ni kategorier (F ig. 4). Den største kategori var (5): normal cellestørrelse og nummer næststørste var (8): større cellestørrelse med normal celleantal. Selv om opfølgende arbejde er nødvendigt, dette tyder på, at vores tablet-baserede metode kan bruges til at kategorisere mutanter baseret på blad celle størrelse og antal.
Fig. 1. Et eksempel på bladstilk / bladplade grænsen detektering og brugergrænseflade. Bemærk, at LeafJ er i stand til at definere bladstilk / bladpladen grænse automatisk (figur 1B). Klik her for at se større figure.
Figur 2. LeafJ plugin kunne opdage skygge undgåelse reaktioner i forskellige blade parametre. Leaf 3 til blad 6 fra syv vildtypeplanter (Arabidopsis thaliana Columbia økotypen) under hver betingelse (sol og skygge) blev undersøgt. Fra øverst til venstre til nederst til højre, er y-aksen enheder mm, mm, mm, mm 2, forholdet mellem bladstilk længde til bladlængde, og forholdet mellem bladlængde på bladet bredde. Klik her for at se større figur .
Figur 3. LeafJ plugin er meget nøjagtig. CAMMENLIGNINGSTABEL af data fra manuel måling og LeafJ plugin måling fra 3.532 datapunkter. Hvert punkt repræsenterer et blad. Grønne prikker angiver de 170 outliers i denne graf. Akserne for bladareal er mm2 alle andre er mm. Tal foran hver parameter repræsenterer blade position (dvs. "3" er den tredje blad).
Figur 4. Scatter plot af blade celleareal og blade celleantal mellem 67 genotyper af Arabidopsis thaliana. Hvert punkt repræsenterer fænotyper af hver genotype dyrket under skygge tilstand. Planter blev inddelt i ni kategorier baseret på deres forskel fra vildtype (Col) som bestemt ved en lineær blandede virkninger model og flere undersøgelser rettet p-værdier: (1) mindre cellestørrelse med nedsat celletal, (2) mindre celle størrelse med normenal celletal, (3) mindre cellestørrelse med forøget celletal, (4) normal cellestørrelse med nedsat celletal, (5) normal cellestørrelse med normal celletal, (6) normal cellestørrelse med nedsat celletal, (7 ) større cellestørrelse med nedsat celletal, (8) større cellestørrelse med normal celletal, (9) større cellestørrelse med forøget celletal. "*" Indikerer fænotypen af vildtype (Col).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores "LeafJ" plugin muliggør måling af stilk længde semi-automatisk, hvilket øger throughput næsten 6 gange over manuel måling. Bladstilken længde er en vigtig indeks i SAS og er også et vartegn for andre fænomener, såsom nedsænkning modstand og hyponastic vækst 17. Derfor dette plugin kan være nyttig til en lang række planteforskere.
Vores plugin er implementeret i et veletableret java-baseret gratis software, ImageJ. Dette gør det nemt at cross-platform installation. Nem ændring af programmet er også en fordel for LeafJ plugin fordi ImageJ allerede har et stort bibliotek af plugins, der blev skrevet af Java og ImageJ makro sprog ( http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : start ). I øjeblikket er vi kun testet Arabidopsis blade, men vores algoritme på stilk / bladpladen grænse afsløring kunne anvende to andre tokimbladede forlader virksomheden efter en vis ændring af plugin.
Under test LeafJ plugin, fandt vi de fleste af de 14 fejl kom fra menneskelige fejl såsom forlægge kopierede resultater på datablade og / eller fejlmærkning af plantebeskyttelsesmidler genotyper. I sjældne tilfælde bladstilken / bladpladen grænse blev kaldt forkert, hvilket nødvendiggør manuel korrektion og skabe yderligere risiko for kopiere og indsætte fejl. Vi kunne opdage sådanne fejl efter ser på data (A) ved tærskelværdiansættelse værdier (f.eks bladstilke længere end blad længde) og (b) ved at finde duplikerede prøve tilstand (f.eks "sol" eller "skygge"), genotype eller position af blade.
Vores touch-screen tablet metode lettet nøjagtighed og hastighed måling. Begrænsning af vores metode er, at kommunikationen mellem hovedcomputeren og touch screen tablet afhængig af hastigheden af trådløse lokalnetværk (LAN).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
LeafJ blev skrevet af JNM mens han var på orlov i Dr. Katherine Pollard laboratorium på Gladstone institutter.
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Science Foundation (tilskud nummer IOS-0.923.752).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
- Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
- Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
- Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
- Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570 (2012).
- Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
- Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157 (2012).
- Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
- Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
- Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82 (2008).
- Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
- Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
- Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
- Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
- Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).
