Summary
Demonstrasjon av sentrale metoder for høy gjennomstrømming blad målinger. Disse metodene kan brukes til å akselerere blad fenotyping når studere mange plante mutanter eller ellers screening planter etter blad fenotype.
Abstract
Høy gjennomstrømning fenotyping (phenomics) er et kraftig verktøy for å knytte gener til deres funksjoner (se gjennomgang 1 og nyere eksempler 2-4). Bladene er primær fotosyntetiske orgel, og deres størrelse og form varierer developmentally og miljømessig innenfor en plante. For disse grunner studier på blad morfologi krever måling av flere parametre fra mange blader, som er best gjort av semi-automatiske phenomics verktøy 5,6. Baldakin skyggen er en viktig miljømessig cue som påvirker plante arkitektur og livshistorie, suiten av svarene er kollektivt kalt skyggen unngå syndrom (SAS) 7. Blant SAS responser, skygge indusert blad petiole tøyelighet og endringer i bladområde er spesielt anvendbare som indekser 8. Oppdatert, kan blad form programmer (f.eks SHAPE 9, LAMINA 10, 11 LeafAnalyzer, LEAFPROCESSOR 12) måle blad skisserer og kategorisere blad figurer, Men kan ikke sende petiole lengde. Mangel på store målesystemer av blad petioles har hemmet phenomics tilnærminger til SAS forskning. I denne artikkelen beskriver vi en nyutviklet ImageJ plugin, kalt LeafJ, som raskt kan måle petiole lengde og blad blad parametere av modellen anlegget Arabidopsis thaliana. For sporadisk blad som krevde manuell korrigering av petiole / blad blad grense vi brukte en touch-screen tablet. Videre blad cellen form og blad celle tall er viktige determinanter for blad størrelse 13. Atskilt fra LeafJ vi også presentere en protokoll for å bruke en touch-screen tablet for måling cellen form, område og størrelse. Vår blad egenskap målesystem er ikke begrenset til skygge-unngåelse forskning og vil akselerere blad fenotyping mange mutanter og screeningmetoder planter ved blad fenotyping.
Protocol
1. Plantematerialer
Vær oppmerksom på at dette plantevekst protokollen er rettet for å oppdage skyggen unngå respons. Du kan dyrke planter under din favoritt tilstand.
- Dryss Arabidopsis thaliana frø på vann gjennomvåt papirfiltre i 9 cm petriskåler og lagre (stratify) dem ved 4 ° C i fire dager i mørket.
- Overføre disse petriskåler til simulerte solforhold: 80-100 μE photosynthetically aktiv stråling (PAR) og langt rødt supplement for å bringe R: FR forhold til 1.86. Bruk lang dag forhold (16 timer lys / 8 timers mørk) og konstant temperatur på 22 ° C. Inkuber i denne tilstanden i tre dager for å la frøene til å spire.
- Overfør spirer frø til jord og holde plantene under solen tilstand. For store eksperimenter, anbefaler vi forbereder små tagger for merking hver planter ved hjelp av data Flett Manager i Microsoft Word 2004 (eller senere) for å lage etiketter.
- Elleve dager etter transfer til jord, flytte halvparten av plantene til skygge tilstand: samme som solen, men med supplerende langt rødt lys for å bringe R / FR forholdet til 0,52.
- Etter ytterligere tolv dager, plantene er klare for blad imaging. På dette stadiet de eldre bladene har fullt modnet mens yngre bladene er fortsatt voksende, slik at du fange et øyeblikksbilde av utviklingen. Det kan være lurt å velge en annen utviklingsforstyrrelse tid, avhengig av dine behov.
2. Fange dissekert Leaf Images
- Forbered transparenter merket med anlegget genotype og vekst tilstand med fem rektangulære rammer. Ett bilde tilsvarer blader fra en plante. Microsoft Excel kan brukes til å skrive ut en konsekvent rutenett med etiketter.
- Dissekere blader av tjueseks dag gamle planter.
- Scan forlater på 600 dpi på en flat-bed scanner. Merk at går fra ett anlegg bør plasseres vertikalt i en svart vindu i en sandwich med gjennomsiktige ark. Unngå å berøre bladertil en svart vindusramme og overlappende blader, noe som vil gi feil i følgende prosedyrer.
3. Leaf Bildeanalyse av LeafJ
- Last ned ImageJ Dra LeafJ.jar filen til plugins mappen ImageJ.
- Åpne en bildefil i ImageJ 1.45s eller senere 14.
- Delt inn bildet i tre fargekanalene (rød, grønn og blå) ved "Image> Color> Split Channels" og gjelder terskelen til bildet i den blå kanalen.
- Velg alle bladene fra en plante av et rektangel verktøy (Figur 1A).
- Velg "LeafJ" fra plugin menyen.
- Velg merknad for denne planten fra dialogboksen som vises. Du kanredigere standardverdiene som vises her ved å klikke på "redigere disse alternativene".
- Etter å ha kjørt LeafJ plugin og før du klikker "OK"-knappen, redigere spores linjer fra regionen av interesse (ROI) leder vinduet (hvis nødvendig, figur 1b). En touch-screen tablet (for eksempel en iPad) er nyttig for denne prosedyren. iPads kan kobles til en datamaskin som en ekstern skjerm med Air Display-programvare.
- Eksportere måleresultater og tilknyttet informasjon (filnavn, blomstringstid, dissekert av, målt ved, osv.) til Microsoft Excel eller tilsvarende programvare.
4. Leaf Cell Bildeanalyse i ImageJ
- Fix dissekert blader som beskrevet i referanse 15 etter skanning (trinn 2). FAA faste blader kan holdes i 4 ° C i minst 6 måneder.
- Fjerne bladene ved å endre FAA fiksativ til kloralhydrat løsning og inkuberes blader for 1 ~ 2 time før mikroskopisk observasjon 15.
- Mount blader på microscope glir med trichomes vendt opp. Bruke 40x forstørrelse på en sammensatt mikroskop, bildet den mesophyll laget av sentrum av hvert blad på hver side av den viktigste venen, unngå celler nær trichomes eller årer.
- Trace blad celle skisserer av ImageJ ROI manager verktøyet med hjelp av touch-skjermen tablett og en pekepenn (som beskrevet i trinn 3). Cell bildeanalyse bruker de innebygde funksjonene i ImageJ men krever ikke LeafJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Leaf Images Viser Anslag over petiole og Leaf Blade Boundary, og deres målevinduet
En av de mest nyttige funksjonene i LeafJ er automatisert deteksjon av bladet bladet / petiole grensen (figur 1). Den LeafJ algoritmen fungerer som følger: den innebygde ImageJ ParticleAnalyzer funksjonaliteten brukes til å finne og bestemme retningen av bladene innsiden av brukerens valg. For hvert blad bredden av bladet bestemmes langs bladets hele akse. Deretter endringen i bredde ved hver posisjon langs aksen bestemmes ved hjelp av en kjører vindu (middelverdien bredde for de syv stillinger proksimalt til fokal posisjon trekkes fra midlere bredde for de syv stillinger distalt til fokal posisjon). Petiole / bladet grensen er definert som den første stilling utenfor blad base der endringen i bredde er større enn 90% av alle beregnede bredde forskjeller. LeafJ gjør flere kontroller for å øke pålitelighetheten av denne samtalen, spesielt LeafJ krever også at 1) bredden overskrider den smaleste 5% av posisjoner i lengde (dette hindrer avvikende samtaler på petiole base), 2) regionen proksimalt for det sentrale posisjon ikke har en stor endring i bredde, og 3) bredden av bladet 20% distalt til fokal posisjon er minst 150% større enn ved fokal posisjon (sant hvis fokal posisjon er grensen fordi 20% proksimalt til grensen bør bladet og derfor mye bredere).
Når LeafJ har definert petiole / bladet grensen, innebygd ImageJ klasser og metoder benyttes for å bestemme blad areal, omkrets, og sirkularitet. Innebygd ImageJ metoder er også brukt til å tilpasse en ellipse på bladet og å beregne de store og små aksene av at ellipsen (deretter brukt som bladet lengde og bredde). Petiole lengde bestemmes av en linje som sporer langs midten av bladstilken området.
2. Påvisning av Shade-indusert petiole Forlengelse </ P>
Å spørre om LeafJ målinger var nyttig i å analysere skyggen unngå, brukte vi en blandet effekt-modell med behandling og blad nummer som faste effekter og replikerer som en tilfeldig effekt. Vi fant ut at petiole lengde, blad området, bladlengde, bladbredde og petiole lengde / bladlengde forholdet ble betydelig påvirket av skygge behandling, mens bladet sirkularitet og bladet lengde / blad bredde forholdet ikke var (p <0,05). Våre data viser at LeafJ plugin er nyttig for studier på blad skygge unngåelse svar (figur 2).
3. Nøyaktighet og hastighet på LeafJ Plugin
Å bestemme ytelsen til LeafJ plugin i større datasett vi sammenlignet driftstid og nøyaktighet mellom manuell og plugin målinger. For manuelle målinger definert vi petiole / bladet grensen som stedet hvor bladet bredde syntes å raskt øke. Det tok en erfaren forsker i gjennomsnitt 1 9 min 3 sek for å måle én transparent med fem planter (ca 50 blader) med manuell måling, mens med LeafJ det tok bare 3 min 20 sek. Gjennomsnitt over 5 transparenter, måling med plugin var 5,7 ganger raskere enn manuell måling. Den manuelle målingen ble gjort av en forsker med erfaring i å lage mange manuelle målinger, en nybegynner ville være betydelig tregere ved manuell måling, noe som resulterer i en enda større fordel av LeafJ. Vi vurderte nøyaktigheten ved å sammenligne data fra de to metodene, dataene ble høyt korrelert for alle blad parametre (Figur 3). Av de 3532 datapunkter var 172 (4,9%) som viste sterke forskjeller mellom metodene (dokumentert ved å være uteliggere på korrelasjonsmatrisen plott). Vi analyserte årsaken til disse rammene. Av 172 uteliggere, var 29 på grunn av feil under LeafJ plugin måling og 143 var på grunn av feil i manuell måling. Denne feilen Analysen viste også nøyaktigheten av plugin måling.
jove_step "> 4. Cell Størrelse og Cell Antall MålingUavhengig av LeafJ vi også utviklet en effektiv arbeidsflyt for målecelle antall og størrelse. Teoretisk celle antall og størrelse kan brukes til å klassifisere mutant planter inn ni kategorier sammenlignet med villtype, (1) mindre celler størrelse med redusert celle tall, (2) mindre celler med normale celle tall, (3) mindre celler med økt celle tall, (4) normale cellestørrelse med reduserte celle tall, (5) normal cellestørrelse med normale celle tall, (6) normalt cellestørrelse med reduserte celle tall, (7) større cellestørrelse med reduserte celle tall, (8) større celle størrelse med normal celle tall, (9) større celle størrelse med økt celle tall 15,16. Vi målte blad celleparametere i 67 genotyper av Arabidopsis thaliana ved hjelp av vår tablet-baserte celle størrelse og celle nummer målemetode. Vi målte celle størrelse på 8629 celler fra 877 blader av 224 planter. Multiplisere celletetthet by bladareal (målt ved LeafJ), beregnet vi total blad celle nummer data 438 blader fra 219 planter. Vår analyse plassert disse genotyper i seks av de mulige ni kategorier (F ig. 4). Den største kategori var (5): normal celle størrelse og antall; nest største var (8): større cellestørrelse med normal celle nummer. Selv etterarbeid trengs, tyder dette på at våre tablett-baserte metode kan brukes til å kategorisere mutanter basert på blad cellestørrelse og nummer.
Figur 1. Et eksempel på petiole / blad blad grensen deteksjon og brukergrensesnitt. Vær oppmerksom på at LeafJ er i stand til å definere petiole / bladet bladet grensen automatisk (figur 1B). Klikk her for å se større Figure.
Figur 2. LeafJ plugin kunne oppdage skyggen unngåelse svar i ulike blad parametere. Leaf 3 til blad 6 fra syv villtype planter (Arabidopsis thaliana Columbia ecotype) under hver tilstand (sol og skygge) ble undersøkt. Fra øverst til venstre til nederst høyre, y-aksen enheter er mm, mm, mm, mm 2, forholdet mellom petiole lengde til bladlengde, og forholdet mellom bladlengde til bladbredde. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. LeafJ plugin er svært nøyaktig. Correlation av data fra manuell måling og LeafJ plugin måling fra 3532 datapunkter. Hver prikk representerer ett blad. Grønne prikker indikerer 170 uteliggere i denne grafen. Akser bladareal er mm 2 alle andre er mm. Tall i foran hver parameter representerer blad stillingen (dvs. "3" er det tredje blad).
Figur 4. Spredningsdiagram av blad celle området og blad celle antall blant 67 genotyper av Arabidopsis thaliana. Hvert punkt representerer fenotyper av hver genotype dyrket under skyggen tilstand. Planter ble klassifisert i ni kategorier basert på deres forskjell fra villtype (Col) som bestemt ved en lineær blandede effekter modell og multippel-testing korrigert p-verdier: (1) mindre cellestørrelse med reduserte celle tall, (2) mindre celle størrelse med normenal cellenummer, (3) mindre cellestørrelse med økt cellenummer, (4) normale cellestørrelse med redusert cellenummer, (5) normal celle størrelse med normal celle nummer, (6) normalt cellestørrelse med redusert cellenummer, (7 ) større cellestørrelsen med redusert cellenummer, (8) større cellestørrelse med normal celle nummer, (9) større cellestørrelse med økt celle nummer. "*" Viser fenotypen av vill type (Col).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår "LeafJ" plugin gjør måling av petiole lengde semi-automatisk, øke gjennomstrømning nesten 6 ganger over manuell måling. Petiole lengde er en viktig indeks av SAS, og er også et landemerke for andre fenomener, som for eksempel drukningsdatoen motstand og hyponastic vekst 17. Derfor denne plugin kan være nyttig for et bredt utvalg av plante forskere.
Vår plugin er implementert i et veletablert java-baserte fri programvare, ImageJ. Dette muliggjør enkel cross-platform installasjon. Enkel modifisering av programmet er også en fordel av LeafJ plugin fordi ImageJ allerede har et stort bibliotek av plugins som ble skrevet av Java og ImageJ makro språk ( http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : start ). For tiden er vi bare testet Arabidopsis blader, men vår algoritme av petiole / blad blad grensen deteksjon kan gjelde to andre dicotyledonous forlater etter noen endring av plugin.
Under testing LeafJ plugin, fant vi de fleste av de 14 feilene kom fra menneskelige feil som misplacing kopierte resultater på datablad og / eller feilsetting av plante genotyper. I sjeldne tilfeller petiole / blad blad grensen ble kalt feil, nødvendiggjør manuell korreksjon og skape ytterligere risiko for kopier og lim feil. Vi kunne oppdage slike feil etter å se på data (a) ved thresholding verdier (f.eks petioles lengre enn blad lengde) og (b) ved å finne duplisert prøve tilstand (f.eks "sol" eller "skygge"), genotype, eller plasseringen av bladene.
Vår touch-screen tablet metoden tilrettelagt nøyaktighet og hastighet måling. Begrensning av vår metode er at kommunikasjon mellom hoved datamaskin og berøringsskjermen tabletten er avhengig av hastigheten på det trådløse lokalnett (LAN).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
LeafJ ble skrevet av JNM mens han var på sabbatsår i Dr. Katherine Pollards lab på Gladstone Institutes.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Science Foundation (prosjekt nummer IOS-0923752).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
- Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
- Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
- Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
- Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570 (2012).
- Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
- Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157 (2012).
- Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
- Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
- Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82 (2008).
- Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
- Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
- Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
- Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
- Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).
