Summary
Демонстрация основных методов для измерения высокой пропускной лист. Эти методы могут быть использованы для ускорения лист фенотипирование при изучении многих мутантов растений или иного растения экранирование листьев фенотип.
Abstract
Высокая пропускная способность фенотипирование (phenomics) является мощным инструментом для связи генов с их функциями (см. обзор 1 и недавние примеры 2-4). Листья главный орган фотосинтеза, и их размер и форма зависят развитием и экологически внутри завода. По этим причинам исследования по морфологии листьев требуется измерение нескольких параметров из многочисленных листьев, которые лучше всего сделать, полуавтоматические phenomics инструментов 5,6. Canopy тени является важной экологической реплика, что влияет на архитектуру растений и истории жизни; набор ответов общим названием синдрома тени избежании (SAS) 7. Среди ответов SAS, тени индуцированных черешок листа удлинения и изменения в области лезвия особенно полезны в качестве показателей 8. На сегодняшний день форма листа программ (например, форма 9, LAMINA 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) можно измерить очертания листьев и классифицировать лист формы, Но не может выводить черешок длиной. Отсутствие крупномасштабных систем измерения черешки листьев сдерживает phenomics подходы к SAS исследований. В этой статье мы опишем недавно разработанный ImageJ плагин, называется LeafJ, который может быстро измерять длины черешка и параметров листовой пластинки растения арабидопсис модели. Для случайного листа, которые требуют коррекции по эксплуатации черешка / листовой пластинки границы мы использовали сенсорный экран планшета. Кроме того, форма листа ячейки, а числа клеток листа являются важными факторами, определяющими размер листа 13. Отдельно от LeafJ мы также представляем протокол для использования с сенсорным экраном планшет для измерения формы клеток, площадь и размеры. Наш лист черта измерительной системы не ограничивается тени уклонения от уплаты налогов исследований и ускорит лист фенотипирование много мутантов и отбора растений листья фенотипирования.
Protocol
1. Растительных материалов
Обратите внимание, что этот протокол роста растений предназначена для обнаружения ответа тени избегания. Вы можете выращивать растения в вашей любимой состоянии.
- Посыпать семена арабидопсиса THALIANA на воде пропитанной фильтровальной бумаги в 9 см чашки Петри и магазина (стратифицировать) их при 4 ° С в течение четырех дней в темноте.
- Передача этих чашках Петри в моделируемых условиях солнца: 80-100 мкЕ фотосинтетически активной радиации (ФАР) и дальнего красного дополнение довести R: FR отношение к 1,86. Используйте длинные условиями день (16 часов света / 8 часов темного) и постоянной температуре 22 ° C. Выдержите в этом состоянии в течение трех дней, чтобы семена прорастают.
- Передача проросших семян с почвой и держать растения при условии ВС Для крупномасштабных экспериментов, мы рекомендуем подготовки небольших метки для маркировки каждого растения с помощью Объединение данных менеджера в Microsoft Word 2004 (или более поздней версии) для изготовления этикеток.
- Одиннадцать дней после TRansfer почвы, перемещение половины растений в тень состоянии: так же, как солнце, но с дополнительным дальним красным светом довести R / FR отношение к 0,52.
- После дополнительного двенадцать дней, растения готовы к лист изображений. На этом этапе старые листья полностью созрела в то время как молодые листья по-прежнему расширяется, так что вы моментальный снимок развития. Вы можете выбрать другое время развития в зависимости от ваших потребностей.
2. Захват изображения расчлененный лист
- Подготовка прозрачности листы помечены генотипа растения и условием роста с пяти прямоугольных рамах. Один кадр соответствует листья с одного растения. Microsoft Excel может быть использована для печати последовательной сетки с этикетками.
- Проанализируйте листья из двадцати шести дневных растений.
- Сканирование оставляет на 600 точек на дюйм на планшетный сканер. Обратите внимание, что уходит от одного растения должны быть размещены по вертикали в черное окно в сэндвич прозрачных листов. Старайтесь не прикасаться листьяв черной рамке окна и перекрытия листья, которые дадут ошибки в следующих процедур.
3. Лист анализа изображения по LeafJ
- Скачать ImageJ Перетащите LeafJ.jar файл в папку плагинов из ImageJ.
- Откройте файл изображения в ImageJ 1.45s или более поздней версии 14.
- Разбить изображение на три цветовых каналов (красного, зеленого и синего) на "Color Image>> Split Channels" и применить порог изображения в синем канале.
- Выберите все листья с одного растения на инструмент прямоугольник (рис. 1А).
- Выберите "LeafJ" из меню плагинов.
- Выберите аннотации информации для этого растения в диалоговом окне, которое появляется. Вы можетеизменить значения по умолчанию, которые появляются здесь, нажав кнопку "редактировать эти параметры".
- После запуска LeafJ плагина и, прежде чем нажать кнопку "ОК", редактировать прослеживаются линии от области интереса (ROI) оконный менеджер (если это необходимо; рис. 1b). Сенсорного экрана планшета (например, Ipad) полезно для этой процедуры. Ipads может быть подключен к компьютеру в качестве внешнего монитора с помощью Air Display программного обеспечения.
- Экспорт результатов измерений и связанные с ними информацию (имена файлов, время цветения, расчлененные, измеряемый и т.д.) для Microsoft Excel или эквивалент программного обеспечения.
4. Лист сотового анализа изображения в ImageJ
- Исправить рассеченными листьями, как описано в ссылке 15 после сканирования (шаг 2). FAA фиксированной листья можно хранить при 4 ° С в течение не менее 6 месяцев.
- Снимите листья, изменив FAA фиксатором для хлоралгидрат решения и инкубировать листьев на 1 ~ 2 часа до микроскопических наблюдений 15.
- Гора выходит на милимикроскопа скользит с трихомы вверх. Использование 40-кратном увеличении на сложный микроскоп, изображение мезофилла слой в центре каждого листа по обе стороны от главной жилки, избегая клетки рядом волосков или вены.
- Трассировка клеток листа описывается по ImageJ ROI менеджер инструмент, с помощью сенсорного экрана планшета и пера (как описано в шаге 3). Анализ сотового изображения использует встроенный в особенности ImageJ, но не требует LeafJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Лист изображения показаны оценки Черешок и краевые листовой пластинки, и их измерение Window
Одной из наиболее полезных функций LeafJ является автоматическое обнаружение листовой пластинки / черешка границы (рис. 1). Алгоритм LeafJ работает следующим образом: встроенные функциональные возможности ImageJ ParticleAnalyzer используется, чтобы найти и определить ориентацию листа внутри выбору пользователя. Для каждого листа по ширине листа определяется вдоль всей оси листа. Тогда изменение ширины в каждой позиции вдоль оси определяется с помощью скользящего окна (средняя ширина семь позиций проксимального до фокальной позиции вычитается из средней ширины на семь позиций дистальнее координационного положения). Черешка / лезвие граница определяется как первую позицию после основания листа, где изменение в ширину больше чем 90% всех расчетных различия ширины. LeafJ делает дополнительные проверки, чтобы увеличить reliability этого вызова, а именно LeafJ также требует, чтобы 1) ширина превышает узкой 5% позиций в длину (это предотвращает аберрантных вызовов на базе черешка), 2) области проксимального до фокальной позиции не имеют существенных изменений в ширину и 3) ширина листа 20% дистальнее координационного позиция по меньшей мере 150% больше, чем в фокальной позиции (правда, если положение фокуса является границей, потому что 20% проксимальных к границе должно быть лезвие и, следовательно, гораздо шире).
После LeafJ определил черешка / лезвия границей, встроенный в ImageJ классов и методов, которые используются для определения лезвие площадь, периметр, и округлости. Встроенные методы ImageJ также используются, чтобы соответствовать эллипс с лезвием и рассчитать большая и малая оси этого эллипса (используется в качестве длины лезвия и ширина). Черешки длиной определяется линия, которая прослеживается по центру черешок области.
2. Обнаружение Shade-индуцированной удлинение Черешок </ P>
Чтобы спросить, есть ли LeafJ измерения были полезны в тени анализом избегания, мы использовали смешанную модель эффектов лечения и количество листьев в качестве основных эффектов и повторных как случайный эффект. Мы обнаружили, что черешок длиной лезвия области, длина лезвия, ширина лезвия, и черешок длиной / длина лезвия соотношения были существенно затронуты тени лечения, в то время как округлость лезвия и лезвия длина / ширина лезвия отношение не было (р <0,05). Наши данные показали, что LeafJ плагин полезен для исследования на листе тени избежания ответов (рис. 2).
3. Точность и скорость работы плагина LeafJ
Для определения производительности плагина LeafJ в больших наборах данных мы сравнили время работы и точности между ручным и плагин измерений. Для ручных измерений мы определили черешка / лезвия границей как место, где ширина створки появились быстро увеличиваться. Он принял опытного исследователя в среднем на 1 9 мин 3 сек для измерения одного прозрачности пять заводов (около 50 листов) на ручное измерение, в то время как с LeafJ потребовалось всего 3 мин 20 сек. Усредненные на 5 прозрачных пленках, измерения с помощью плагина была в 5,7 раза быстрее, чем ручное измерение. Ручное измерение было сделано исследователем, имеющим опыт в создании многих измерений по эксплуатации; начинающий будет значительно медленнее при ручном измерении, в результате чего еще больше преимуществ LeafJ. Мы оценивали точность путем сравнения данных из двух методов; данные были тесно связаны для всех листьев параметров (рис. 3). Из 3532 точек данных было 172 (4,9%), который показал значительные различия между методами (о чем свидетельствует, будучи выбросы от соотношения участков). Мы проанализировали причины этих отклонений. Выбросы из 172, 29 были из-за ошибок при измерении плагин LeafJ и 143 были связаны с ошибками в руководстве измерений. Эта ошибка анализ также показал, точность измерения плагин.
jove_step "> 4. Размер ячейки и измерительной ячейке номерНезависимо от LeafJ мы также разработали эффективный поток работ для измерения количества клеток и размера. Теоретически количество клеток и размер могут быть использованы для классификации мутантных растений на девять категорий по сравнению с диким типом; (1) меньше размеров клеток с уменьшением количества клеток, (2) более мелкие клетки с нормальным числа клеток, (3) мелкие клетки с повышенной клетки номера, (4) нормальный размер ячейки со снижением числа клеток, (5) нормальный размер ячейки с нормальными номерами ячейки, (6) нормальный размер ячейки со снижением числа клеток, (7) больших размеров клеток с уменьшением количества клеток, (8) больше Размер ячейки с нормальными номерами ячейки, (9) большего размера ячейки с увеличением числа клеток 15,16. Мы измерили параметры клеток листа в 67 генотипов арабидопсис используя наш планшет на основе размеров клеток и их количество метода измерения. Мы измерили размер ячейки 8629 клеток по 877 из 224 листьев растений. Умножив б плотность клетокУ листовой поверхности (измеряется LeafJ), мы оценили общий лист номер ячейки данных из 438 листьев от 219 растений. Наш анализ этих генотипов размещены в шести из девяти возможных категорий (F рис. 4). Самая большая категория была (5): нормальный размер ячейки и номер; вторым по величине был (8): больший размер ячейки с нормальным числом клеток. Хотя последующей работы необходимо, это говорит о том, что наш планшет на основе метода может быть использована для классификации мутантов, основанный на листе размером ячейки и номер.
Рисунок 1. Пример черешка / листовой пластинки обнаружения границ и пользовательский интерфейс. Обратите внимание, что LeafJ в состоянии определить черешка / листовой пластинки граница автоматически (рис. 1б). Нажмите, чтобы увеличить FIGUчисло рейнольдса
Рисунок 2. LeafJ Плагин может обнаружить ответы тени избежание различных параметров листа. Лист 3 до 6 лист из семи растений дикого типа (арабидопсис экотипа Columbia) по каждому условию (солнце и тень) были рассмотрены. Из верхнего левого угла в правый нижний, ось у единиц мм, мм, мм, мм 2, соотношение длины черешка, чтобы длина лезвия, и соотношение длины лезвия, чтобы ширина лезвия. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. LeafJ плагина является очень точным. Correlation данных из ручного измерения и LeafJ плагин измерения от 3532 точек данных. Каждая точка представляет собой один лист. Зеленые точки указывают на 170 выбросы в этой графе. Топоры площади листа является мм 2 все остальные мм. Номера в передней части каждого параметра представляют собой лист позицию (т.е. "3" является третьим листом).
Рисунок 4. Точечная диаграмма листовой поверхности клеток и количество клеток листа среди 67 генотипов арабидопсис. Каждая точка представляет фенотип каждого генотипа, выращенных в тени состоянии. Растения были разделены на девять категорий в зависимости от их отличие от дикого типа (Col), как определено линейной смешанной модели эффектов и нескольких тестирования исправлены р-значения: (1) меньше размеров клеток с уменьшением количества клеток, (2) меньше ячейки Размер с нормойАль номер ячейки, (3) меньшего размера ячейки с увеличением числа клеток, (4) нормальный размер ячейки со снижением числа клеток, (5) нормальный размер клетки с нормальным номер мобильного, (6) нормальный размер ячейки со снижением числа клеток, (7 ) больше размера ячейки со снижением числа клеток, (8) большего размера ячейки с нормальным номер мобильного, (9) большего размера ячейки с увеличением числа клеток. "*" Указывает на фенотип дикого типа (Col).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наш "LeafJ" Плагин позволяет измерение длины черешка полуавтоматически, увеличивая пропускную почти в 6 раз по сравнению с ручной измерения. Черешки длиной является важным показателем SAS, а также является достопримечательностью других явлений, таких как сопротивление погружения и hyponastic роста 17. Таким образом, этот плагин может быть полезна широкому кругу исследователей завода.
Наш плагин реализован в устоявшихся Java-основе свободного программного обеспечения, ImageJ. Это позволяет легко кросс-платформенный установки. Простота модификации программы также является преимуществом плагина LeafJ ImageJ, потому что уже есть большая библиотека плагинов, которые были написаны на Java и ImageJ макро-языков ( http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : начать ). В настоящее время мы тестировали только Arabidopsis листья, но наш алгоритм черешка / лист обнаружения границы лезвие может применяться тО других двудольных оставляет после некоторой модификации плагина.
Во время тестирования LeafJ плагин, мы нашли большинство из 14 ошибок приехали из человеческой ошибки, такие как кладя скопировали результаты по спецификации и / или неправильной установки растительных генотипов. В редких случаях черешка / листовой пластинки граница была названа неправильно, что требует ручной коррекции и создания дополнительных рисков копирование и вставка ошибок. Мы могли бы обнаружить такие ошибки, посмотрев на данные (а) порог значения (например, черешки дольше, чем длина листа) и (б) нахождение дублируется образца условию (например, «солнце» или «тенью»), генотип, или положение листьев.
Наши сенсорный экран планшета метод способствовал точность и скорость измерения. Ограничение нашего метода является то, что связи между основным компьютером и планшет с сенсорным экраном полагается на скорость беспроводной локальной сети (LAN).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
LeafJ было написано JNM в то время как он был в отпуске в лаборатории доктора Кэтрин Поллард в Gladstone институтов.
Эта работа была поддержана грантом от Национального научного фонда (грант № IOS-0923752).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
- Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
- Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
- Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
- Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570 (2012).
- Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
- Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157 (2012).
- Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
- Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
- Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82 (2008).
- Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
- Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
- Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
- Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
- Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).
