Summary
Demonstration der wichtigsten Methoden für hohen Durchsatz Blatt Messungen. Diese Methoden können verwendet werden, um Blatt Phänotypisierung zu beschleunigen, wenn das Studium vieler Pflanzen-Mutanten oder anderweitig Siebanlagen für Blatt Phänotyp werden.
Abstract
Hoher Durchsatz Phänotypisierung (phenomics) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Verknüpfung von Genen, ihre Funktionen (siehe Beitrag 1 und jüngsten Beispiele 2-4). Blätter sind die primären photosynthetischen Organ, und ihre Größe und Form variieren entwicklungspolitisch und ökologisch innerhalb einer Anlage. Aus diesen Gründen Studien über Blattmorphologie erfordern Messung mehrerer Parameter aus zahlreichen Blättern, die am besten durch halbautomatische phenomics Werkzeuge 5,6 durchgeführt wird. Canopy Schatten ist ein wichtiger Umweltfaktor Cue das Pflanzenwachstum Architektur und das Leben der Geschichte betrifft, die Suite der Antworten wird zusammenfassend als Vermeidung von Schatten zählen Syndrom (SAS) 7. Unter SAS Reaktionen sind Schatten induzierten Blatt Blattstiel Dehnung und Veränderungen im Blade-Bereich besonders nützlich als Indizes 8. Bis heute kann Blattform Programme (zB SHAPE 9, LAMINA 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) zu messen Blatt Konturen und kategorisieren Blattformen, Kann jedoch nicht auszugeben Blattstiel Länge. Mangel an großen Messsysteme Blattstielen gehemmt hat phenomics Ansätze zur SAS Forschung. In diesem Papier beschreiben wir eine neu entwickelte ImageJ Plugin namens LeafJ, die schnell messen können Blattstiel Länge und Blattspreite Parameter der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Für das gelegentliche Blatt, das erforderliche manuelle Korrektur der Blattstiel / Blattspreite Grenze wir eine Touchscreen-Tablet verwendet. Ferner sind Blattzelle Form und Blatt Zellzahlen wichtige Determinanten der Blattgröße 13. Getrennt von LeafJ präsentieren wir auch ein Protokoll für die Verwendung eines Touchscreen-Tablet für Messzelle Form, Fläche und Größe. Unser Blatt trait Messsystem ist nicht auf Schatten-Vermeidungs-Forschung beschränkt und wird leaf Phänotypisierung von vielen Mutanten und Siebanlagen für Blatt Phänotypisierung beschleunigen.
Protocol
Ein. Pflanzenmaterialien
Beachten Sie, dass diese Pflanze das Wachstum Protokoll zum Nachweis Vermeidung von Schatten zählen Antwort gerichtet ist. Sie können Pflanzen unter Ihrem Lieblings Zustand wachsen.
- Sprinkle Arabidopsis thaliana Samen auf Wasser eingeweicht Filterpapiere in 9 cm Petrischalen und möglich (Stratifizierung) sie bei 4 ° C für vier Tage in der Dunkelheit.
- Übertragen Sie diese Petrischalen auf simulierte Sonnenbedingungen: FR-Verhältnis auf 1,86: 80-100 uE photosynthetisch aktive Strahlung (PAR) und weit-rote Ergänzung zu den R bringen. Verwenden Langtagsbedingungen (16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit) und konstanter Temperatur von 22 ° C. Inkubieren in diesem Zustand für drei Tage, damit die Samen zu keimen.
- Übertragen gekeimten Samen in den Boden und die Pflanzen unter der Sonne Zustand. Für Großversuche, empfehlen wir Herstellung kleiner Tags zur Kennzeichnung jedes Pflanzen mit Seriendruck-Manager in Microsoft Word 2004 (oder höher) für die Herstellung von Etiketten.
- Elf Tage nach transfer den Boden, bewegen die Hälfte der Pflanzen, die Schatten Zustand: wie Sonne, aber mit zusätzlichem weit rotes Licht, um den R / FR-Verhältnis auf 0,52 zu bringen.
- Nach weiteren 12 Tage, sind die Pflanzen bereit für Blatt Bildgebung. In diesem Stadium die älteren Blätter sind voll ausgereift während jüngere Blätter noch erweitern, so dass Sie eine Momentaufnahme der Entwicklung zu erfassen. Vielleicht möchten Sie eine andere Entwicklungszeit je nach Ihren Bedürfnissen zu wählen.
2. Capturing Dissected Blatt Images
- Bereiten Sie Transparentfolien mit pflanzlichen Genotyp und Wachstumsbedingungen mit fünf rechteckigen Rahmen gekennzeichnet. Ein Frame entspricht Blätter von einer Pflanze. Microsoft Excel kann verwendet werden, um eine konsistente Gitter mit Etiketten gedruckt werden.
- Dissect Blätter 26 Tage alten Pflanzen.
- Scan lässt bei 600 dpi auf einem Flachbett-Scanner. Beachten Sie, dass von einem Werk verlässt sollten vertikal in einem schwarzen Fenster platziert werden in einem Sandwich von transparenten Folien. Berühren Blätterzu einem schwarzen Fensterrahmen und überlappenden Blättern, die Fehler in folgenden Verfahren geben wird.
3. Blatt Image Analysis by LeafJ
- Herunterladen ImageJ Ziehen Sie den LeafJ.jar Datei in den Plugin-Ordner von ImageJ.
- Öffnen Sie eine Bilddatei in ImageJ 1.45s oder später 14.
- Split das Bild in drei Farbkanäle (rot, grün und blau) von "Bild> Farbe> Split Channels" und gelten Schwelle zum Bild im blauen Kanal.
- Wählen Sie alle Blätter von einer Pflanze durch ein Rechteck-Werkzeug (Abb. 1A).
- Wählen Sie "LeafJ" aus dem Plugin-Menü.
- Wählen Anmerkungsinformationen für diese Anlage aus dem Dialogfeld, das erscheint. Sie könnenbearbeiten Sie die Standardwerte, die hier erscheinen, indem Sie auf "Bearbeiten Sie diese Optionen".
- Nach dem Ausführen LeafJ Plugin und bevor Sie auf "OK"-Taste, bearbeiten zurückverfolgt Zeilen aus der Region of Interest (ROI)-Fenster (falls erforderlich; Abbildung 1B). Ein Touchscreen-Tablet (z. B. ein iPad) ist nützlich für dieses Verfahren. iPads können an einen Computer wie einen externen Monitor mit Air Display Software angeschlossen werden.
- Exportieren von Messergebnissen und damit verbundenen Informationen (Dateinamen, Blütezeit, zerschnitten von, gemessen, etc) in Microsoft Excel oder gleichwertige Software.
4. Blattzelle Image Analysis in ImageJ
- Fix seziert lässt, wie in Bezug 15 nach dem Scannen (Schritt 2) beschrieben. FAA festen Blätter können in 4 ° C für mindestens 6 Monate aufbewahrt werden.
- Deaktivieren Sie die Blätter, indem FAA Fixativ Chloralhydratlösung und inkubieren Blätter für 1 bis 2 Stunden vor der mikroskopischen Beobachtung 15.
- Berg verlässt auf mimikroskop gleitet mit Trichomen nach oben. Mit 40-facher Vergrößerung auf einem zusammengesetzten Mikroskop, Bild Mesophyll Schicht der Mitte jedes Blatt auf beiden Seiten der Hauptader, die Vermeidung Zellen in der Nähe Trichomen oder Venen.
- Trace Blattzelle umreißt von ImageJ ROI-Manager-Tool mit Hilfe des Touchscreen-Tablet und einem Stift (wie in Schritt 3 beschrieben). Zelle Bildanalyse nutzt die integrierten Funktionen der ImageJ aber nicht erforderlich LeafJ.
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Representative Results
Ein. Blatt Images Zeige Schätzungen der Blattstiel und Blattspreite Boundary, und ihre Messfenster
Eines der nützlichsten Funktionen von LeafJ ist automatische Erkennung von Blattspreite / Blattstiel Grenze (Abbildung 1). Die LeafJ Algorithmus arbeitet wie folgt: die integrierte ImageJ ParticleAnalyzer Funktionalität wird verwendet, um herauszufinden und bestimmen die Orientierung der Blätter Innenseite der Benutzerauswahl. Für jedes Blatt die Breite des Blattes ist entlang des gesamten Blattes Achse bestimmt. Dann wird die Änderung in der Breite an jeder Stelle entlang der Achse wird mit einem laufenden Fenster (die mittlere Breite für die sieben Positionen proximal zu der Fokusposition von der mittleren Breite für die sieben Positionen distal der Brennpunktposition subtrahiert). Der Blattstiel / Klinge Grenze wird als erste Position jenseits der Blattbasis wenn die Änderung in der Breite größer ist als 90% aller berechneten Breite Unterschiede definiert. LeafJ macht zusätzliche Überprüfungen Zuver erhöhenkeit dieser Aufforderung; spezifisch LeafJ erfordert auch, dass 1) die Breite des schmalsten 5% von Positionen in der Länge (dies verhindert aberrante Rufen an der Blattstiel Base) überschreitet, 2) die Region proximal zu der Fokusposition keinen wesentliche Änderung in der Breite und 3) die Breite des Blattes 20% distal der Fokuslage wenigstens 150% breiter als an der Fokusposition (wahr, wenn die Brennpunkt-Position ist die Grenze, da 20% proximal zu der Grenze Klinge sein sollte und deshalb viel breiter).
Sobald LeafJ hat den Blattstiel / Klinge Grenze definiert, built-in ImageJ Klassen und Methoden werden verwendet, um Blade Fläche, Umfang und Rundheit zu bestimmen. Integrierter ImageJ Methoden werden auch verwendet, um eine Ellipse zu der Klinge zu passen und um die Haupt-und Nebenachse der genannten Ellipse (anschließend als Klinge Länge und Breite verwendet) zu berechnen. Blattstiel Länge durch eine Linie, die entlang der Mitte des Stieles Bereich Spuren bestimmt.
2. Erkennung von Shade-induzierte Blattstiel Dehnung </ P>
Zu fragen, ob LeafJ Messungen nützlich bei der Untersuchung Vermeidung von Schatten zählen waren, verwendeten wir eine gemischte Effects-Modell mit der Behandlung und Blattzahl als fixe Effekte und replizieren als zufälligen Effekt. Wir fanden, dass Blattstiel Länge, Blattfläche, Klingenlänge Klingenbreite und die Blattstiel Länge / Klingenlänge Verhältnis signifikant durch Schatten Behandlung nicht beeinflusst, während Blade Rundheit und die Klingenlänge / Klinge Breite-Verhältnis nicht (p <0,05). Unsere Daten zeigten, dass LeafJ Plugin nützlich für Studien auf Blatt Vermeidung von Schatten zählen Reaktionen (Abbildung 2).
3. Genauigkeit und Geschwindigkeit der LeafJ Plugin
Um die Leistung des LeafJ plugin in größeren Daten zu bestimmen setzt verglichen wir Betriebszeit und Genauigkeit zwischen Handbuch und Plugin-Messungen. Für manuelle Messungen definierten wir die Blattstiel / Klinge Grenze als Ort der Flügelbreite schien rasch zu erhöhen. Es dauerte ein erfahrener Forscher einen Durchschnitt von 1 9 min 3 sec zu einer Transparenz mit fünf Werken (ca. 50 Blätter) durch manuelle Messung zu messen, während mit LeafJ es nur 3 min dauerte 20 Sekunden. Gemittelt über 5 Folien, Messen mit dem Plugin betrug 5,7 mal schneller als die manuelle Messung. Die manuelle Messung wurde von einem Forscher mit Erfahrung in der Herstellung viele manuelle Messungen durchgeführt; ein Anfänger wäre deutlich langsamer manuelle Messung, was zu einer noch größeren Vorteil LeafJ. Wir untersuchten Genauigkeit durch Vergleich der Daten aus den beiden Methoden, die Daten waren hoch für alle Blätter korreliert (Abbildung 3). Von den 3.532 Datenpunkte wurden 172 (4,9%), die starke Unterschiede zwischen den Methoden (belegt indem Ausreißer auf den Korrelationskurven) zeigte. Wir analysierten die Ursache dieser Ausreißer. Von 172 Ausreißer waren 29 aufgrund von Fehlern bei LeafJ plugin Messung und 143 waren aufgrund von Fehlern bei der manuellen Messung. Dieser Fehler Analyse zeigte auch, Genauigkeit plugin Messung.
jove_step "> 4. Cell Size and Cell Anzahl MeasurementUnabhängig von LeafJ entwickelten wir auch eine effiziente Arbeitsabläufe für Messzelle Anzahl und Größe. Theoretisch Zellzahl und Größe können verwendet werden, um mutierten Pflanzen in neun Kategorien zu klassifizieren, wenn sie mit Wildtyp verglichen werden, (1) kleineren Zellen mit einer verringerten Größe Zellzahlen, (2) kleineren Zellen mit normaler Zellzahlen, (3) kleineren Zellen mit erhöhter Zell Zahlen (4) normalen Zellgröße mit verminderter Zellzahlen, (5) normalen Zellgröße mit normaler Zellzahlen, (6) normalen Zellgröße mit verminderter Zellzahlen, (7) größere Zellgröße mit verminderter Zellzahlen, (8) größeren Zellgröße mit normaler Zellzahlen, (9) größere Zellgröße mit erhöhter Zellzahl 15,16. Wir maßen Blattzelle Parameter in 67 Genotypen von Arabidopsis thaliana mit unseren Tablet-basierte Zellgröße und Zellzahl Messverfahren. Wir maßen Zellgröße von 8.629 Zellen aus 877 Blätter von 224 Pflanzen. Multipliziert Zelldichte by Blattfläche (gemessen LeafJ) schätzten wir gesamten Blattfläche Zellzahl Daten 438 Blätter von 219 Pflanzen. Unsere Analyse brachte diese Genotypen in sechs der neun möglichen Kategorien (F ig. 4). Die größte Kategorie war (5): normale Zelle Größe und Anzahl; zweitgrößten war (8): größer Zellgröße mit normalen Zellzahl. Obwohl Nachbereitung erforderlich ist, bedeutet dies, dass unsere Tablet-basiertes Verfahren verwendet werden, um Mutanten auf Blattzelle Größe und Anzahl der Grundlage kategorisieren.
Abbildung 1. Ein Beispiel Blattstiel / Blattspreite Grenze Erkennung und Benutzeroberfläche. Beachten Sie, dass LeafJ können Blattstiel / Blattspreite Grenze automatisch zu definieren (Abbildung 1B). Klicken Sie hier für eine größere FIGU anzeigenwieder.
Abbildung 2. LeafJ Plugin konnte Vermeidung von Schatten zählen Reaktionen in verschiedenen Blatt-Parameter zu erkennen. Blatt 3 zu Blatt 6 aus sieben Wildtyp-Pflanzen (Arabidopsis thaliana Columbia Ökotyp) unter jeder Bedingung (Sonne und Schatten) wurden untersucht. Von links oben nach rechts unten, sind die y-Achsen-Einheiten mm, mm, mm, mm 2, Verhältnis von Blattstiel Länge Klingenlänge, und das Verhältnis der Klingenlänge zu Klingenbreite. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3. LeafJ Plugin ist sehr genau. Correlation von Daten aus manuellen Messung und LeafJ plugin Messung von 3.532 Datenpunkte. Jeder Punkt steht für ein Blatt. Grüne Punkte stehen für die 170 Ausreißer in dieser Grafik. Achsen der Blattfläche ist mm 2 alle anderen sind mm. Zahlen vor jedem Parameter repräsentieren Blattstellung (dh "3" ist das dritte Blatt).
Abbildung 4. Streudiagramm des Blattes Zellfläche und Blatt Zellzahl unter 67 Genotypen von Arabidopsis thaliana. Jeder Punkt repräsentiert die Phänotypen von jedem Genotyp im Schatten Zustand gewachsen. (1) kleinere Zellgröße mit verminderter Zellzahlen, (2) kleinere Zelle: Pflanzen wurden in neun Kategorien auf ihre Differenz aus dem Wildtyp (Col) als durch ein lineares Modell gemischten Effekten und Multiple-Tests korrigiert p-Werte bestimmt klassifiziert Größe mit Normal Zellzahl, (3) kleinere Zellgröße mit erhöhter Zellzahl, (4) normalen Zellgröße mit verminderter Zellzahl, (5) normalen Zellgröße mit normalen Zellzahl, (6) normalen Zellgröße mit verminderter Zellzahl, (7 ) größere Zellgröße mit verminderter Zellzahl, (8) größere Zellgröße mit normalen Zellzahl, (9) größere Zellgröße mit erhöhter Zellzahl. "*" Zeigt der Phänotyp der Wildtyp (Col).
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Discussion
Unser "LeafJ" plugin ermöglicht die Messung von Blattstiel Länge halbautomatisch, Erhöhung des Durchsatzes fast 6 Mal über manuelle Messung. Blattstiel Länge ist ein wichtiger Index für SAS und ist auch ein Wahrzeichen von anderen Phänomenen wie Überflutung Widerstand und hyponastic Wachstum 17. Deshalb dieses Plugin kann nützlich sein, um eine breite Palette von pflanzlichen Forscher.
Unser Plugin ist in einem gut etablierten java-basierte freie Software ImageJ umgesetzt. Dies ermöglicht eine einfache Cross-Plattform-Installation. Einfache Änderung des Programms ist auch ein Vorteil der LeafJ plugin, weil ImageJ hat bereits eine große Bibliothek von Plugins, die von Java und ImageJ Makrosprachen (geschrieben wurden http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : start ). Derzeit haben wir nur Arabidopsis Blättern getestet, aber unser Algorithmus der Blattstiel / Blattspreite Grenze Detektion könnte t gelteno andere dikotyle Blätter nach einigen Änderungen des Plugins.
Während des Tests LeafJ plugin, fanden wir die meisten der 14 Fehler kam von menschlichen Fehlern, wie verlegen kopiert Ergebnisse auf Datenblättern und / oder falsche Etikettierung von pflanzlichen Genotypen. In seltenen Fällen kann die Blattstiel / Blattspreite Grenze wurde falsch aufgerufen erfordern manuelle Korrektur und die Schaffung zusätzlicher Risiko copy and paste Fehler. Wir könnten solche Fehler nach einem Blick auf Daten (a) durch Schwellwertbildung Werte (zB Blattstiele länger als Blattlänge) erkennen und (b) von der Suche vervielfältigt Probe Bedingung (zB "Sonne" oder "Schatten"), Genotyp, oder die Position der Blätter.
Unsere Touchscreen-Tablet-Methode erleichtert Genauigkeit und Geschwindigkeit der Messung. Beschränkung unserer Methode ist, dass die Kommunikation zwischen dem Hauptcomputer und Touchscreen Tablette setzt auf die Geschwindigkeit des drahtlosen lokalen Netzwerks (LAN).
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
LeafJ wurde von JNM geschrieben, während er ein Sabbatical war Dr. Katherine Pollard Labor am Gladstone Institute.
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (Grant-Nummer IOS-0923752) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
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