Summary
Demonstração de métodos fundamentais para medições folha de elevada capacidade. Estes métodos podem ser usados para acelerar a folha quando se estuda a fenotipagem mutantes de muitas plantas ou plantas de outro modo de rastreio por fenótipo folha.
Abstract
Fenotipagem de alto rendimento (phenomics) é uma ferramenta poderosa para a ligação de genes para as suas funções (ver revisão 1 e exemplos recentes 2-4). As folhas são o órgão fotossintética primária, e seu tamanho e forma variam developmentally e ambientalmente dentro de uma planta. Por estas razões, os estudos sobre a morfologia foliar exigem a medição de vários parâmetros de muitas folhas, que é o melhor feito por ferramentas semi-automatizadas phenomics 5,6. Sombra da copa é uma sugestão importante ambiental que afeta a arquitetura da planta e história de vida, o conjunto de respostas é coletivamente chamada de síndrome de evitar sombra (SAS) 7. Entre as respostas SAS, sombra induzida alongamento foliar pecíolo e mudanças na área da lâmina são particularmente úteis como índices 8. Até à data, os programas de folha de forma (por exemplo, forma 9, LAMINA 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) pode medir contornos folha e categorizar formas de folha, Mas não pode emitir comprimento do pecíolo. A falta de sistemas de larga escala de medição de pecíolos tem inibido abordagens phenomics a SAS pesquisa. Neste artigo, descreve um recém-desenvolvido plugin do ImageJ, chamado LeafJ, que pode rapidamente medir o comprimento do pecíolo e parâmetros do limbo foliar da planta modelo Arabidopsis thaliana. Para a folha ocasional que a correção manual do limite exigido lâmina pecíolo / folha foi utilizado um tablet touch-screen. Além disso, a forma de folha celular e número de células da folha são determinantes importantes do tamanho da folha 13. Separado LeafJ apresentamos também um protocolo para a utilização de um tablet com tela de toque para medir a forma da célula, área e tamanho. O nosso sistema de medição de folha característica não está limitada a sombra esquiva pesquisa e acelerará a fenotipagem folha de muitos mutantes e plantas de triagem por fenotipagem folha.
Protocol
1. Materiais vegetais
Note-se que este protocolo visa o crescimento da planta para a detecção de resposta de esquiva sombra. Você pode crescer plantas em seu estado preferido.
- Polvilhe sementes de Arabidopsis thaliana na água papel de filtro embebido em 9 centímetros pratos de Petri e loja (estratificar)-los a 4 ° C por quatro dias no escuro.
- Transferir essas placas de Petri para condições de sol simulados: 80-100 μE radiação fotossinteticamente ativa (PAR) e vermelho-distante suplemento para levar o R: relação FR para 1,86. Usar condições de dia longo (16 horas luz / escuro de 8 h) e temperatura constante de 22 ° C. Incubar nesta condição durante três dias, para permitir que as sementes germinem.
- Transfira semente germinou para o solo e manter as plantas sob condições de dom Para experiências em grande escala, recomendamos a preparar pequenas etiquetas para etiquetar cada plantas usando Data Merge Manager no Microsoft Word 2004 (ou posterior) para fazer etiquetas.
- Onze dias após a transfer ao solo, mover metade das plantas à condição de sombra: o mesmo que sol, mas com a luz vermelha distante suplementar para que o rácio R / FR para 0,52.
- Depois de um período adicional de 12 dias, as plantas estão prontas para imagiologia folha. Nesta fase, as folhas mais velhas têm totalmente amadurecido enquanto as folhas mais jovens estão ainda em expansão, de modo que você capturar um instantâneo do desenvolvimento. Você pode querer escolher um tempo de desenvolvimento diferente dependendo de suas necessidades.
2. Captura de Imagens Folha dissecados
- Prepare folhas de transparência marcados com genótipo da planta e condição de crescimento, com cinco quadros retangulares. Um quadro corresponde às folhas de uma planta. Microsoft Excel pode ser usado para imprimir uma grelha de acordo com as etiquetas.
- Dissecar folhas de 26 dias as plantas antigas.
- Digitalização deixa a 600 dpi em um scanner plano. Note-se que folhas de uma planta devem ser colocadas na vertical no interior de uma janela a preto em um sanduíche de folhas transparentes. Evite tocar em folhaspara um caixilho de janela e as folhas de cor preta que se sobrepõem, o que dará erros nos procedimentos que se seguem.
3. Análise Folha Imagem por LeafJ
- Download ImageJ Arraste o arquivo LeafJ.jar para a pasta plugins do ImageJ.
- Abrir um arquivo de imagem em ImageJ 1.45s ou mais tarde 14.
- Dividir a imagem em três cores canais (vermelho, verde e azul) por "Cor> Imagem de Canais> Split" e aplicar limite para a imagem do canal de azul.
- Seleccionar todas as folhas de uma planta de uma ferramenta retângulo (Figura 1A).
- Selecione "LeafJ" do menu de plugin.
- Selecione informações de anotação para esta planta a partir da caixa de diálogo que aparece. Você podeeditar os valores padrão que aparecem aqui, clicando em "editar essas opções".
- Após a execução do plugin LeafJ e antes de clicar no botão "OK", editar linhas traçadas a partir da região de interesse janela do gerenciador (ROI) (se necessário; Figura 1B). Um tablet com tela de toque (como um iPad) é útil para este procedimento. iPads pode ser ligado a um computador, como um monitor externo usando software Air Display.
- Exportar resultados de medição e informações associadas (nomes de arquivos, tempo de floração, dissecados, medidos por, etc) para o Microsoft Excel ou software equivalente.
4. Folha de Análise de Imagem celular em ImageJ
- Fix dissecados folhas tal como descrito na referência 15 após a digitalização (passo 2). FAA folhas fixas podem ser mantidos em 4 ° C durante pelo menos 6 meses.
- Limpar as folhas mudando fixador FAA para solução de hidrato de cloral e folhas incubar por 1 a 2 horas antes de observação microscópica 15.
- Monte sai em milhascroscope desliza com tricomas voltado para cima. Usando ampliação de 40x em um composto, uma camada de imagem de microscópio mesofilo do centro de cada folha em ambos os lados da nervura principal, evitando células próximas tricomas ou veias.
- Traço célula folha esboça por ImageJ ferramenta de gerenciamento de ROI com auxílio do tablet com tela de toque e uma caneta (como descrito no passo 3). Análise de imagens de células usa os recursos integrados do ImageJ, mas não exige LeafJ.
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Representative Results
1. Imagens de folha mostrando Estimativas do pecíolo e limite de folhas, e sua janela de medição
Um dos recursos mais úteis do LeafJ é a detecção automática de fronteira lâmina foliar / pecíolo (Figura 1). O algoritmo LeafJ funciona da seguinte maneira: o embutido ImageJ funcionalidade ParticleAnalyzer é usado para localizar e determinar a orientação das folhas dentro da selecção do utilizador. Para cada folha a largura da folha é determinada ao longo de todo o eixo da folha. Em seguida, a alteração na largura em cada posição ao longo do eixo é determinada usando uma janela de correr (a largura média das sete posições proximal à posição focal é subtraída da largura média das sete posições distais à posição focal). O limite do pecíolo / lâmina é definida como a primeira posição, para além da base da folha em que a alteração na largura é maior do que 90% de todas as diferenças de largura calculados. LeafJ faz verificações adicionais para aumentar reliabilidade desta chamada; especificamente LeafJ também requer que: 1) a largura mais estreita excede os 5% de posições no comprimento (isto evita que as chamadas aberrantes na base do pecíolo), 2) a região proximal à posição focal não tem uma grande alteração de largura, e 3) a largura da folha 20% para a posição distal focal é de pelo menos 150% maior do que na posição central (verdadeiro se a posição focal é porque o limite de 20% para o limite proximal deve ser da lâmina e, portanto, muito maior).
Uma vez LeafJ definiu o limite pecíolo / lâmina, construído em classes ImageJ e métodos são usados para determinar a área de lâmina, perímetro e circularidade. Os métodos incorporados ImageJ são também utilizados para ajustar uma elipse para a lâmina e para calcular os eixos maior e menor da elipse (em seguida utilizado como o comprimento e largura da lâmina). Comprimento do pecíolo é determinada por uma linha que traça ao longo do centro da área de pecíolo.
2. Detecção de Sombra induzida Alongamento Pecíolo </ P>
Perguntar se as medidas LeafJ foram úteis na prevenção sombra ensaio, foi utilizado um modelo de efeitos mistos com o tratamento e número de folhas como efeitos fixos e replicar como um efeito aleatório. Nós descobrimos que o comprimento do pecíolo, área da lâmina, lâmina de comprimento, a largura da lâmina, e a relação do comprimento do pecíolo comprimento / lâmina foram significativamente afectados pelo tratamento de sombra, enquanto que a circularidade da lâmina ea lâmina relação largura / comprimento da lâmina não foram (p <0,05). Os nossos dados mostraram que encaixe LeafJ é útil para estudos sobre as respostas de evitação máscara de folha (Figura 2).
3. Precisão e velocidade do Plugin LeafJ
Para determinar o desempenho do plugin LeafJ em conjuntos de dados maiores comparamos o tempo de operação e precisão entre manual e medições plugin. Por medição manual, definimos o limite pecíolo / lâmina como o local onde a largura da folha apareceu a aumentar rapidamente. Demorou um investigador experiente uma média de 1 9 min 3 seg para medir uma transparência com cinco plantas (cerca de 50 folhas) por medição manual, enquanto que com LeafJ levou apenas 3 min 20 seg. Média entre 5 transparências, medindo com o plugin foi de 5,7 vezes mais rápido do que a medição manual. A medição manual foi feito por um investigador com experiência em fazer medições manuais muitos, um novato seria consideravelmente mais lento na medição manual, resultando em uma vantagem ainda maior de LeafJ. Avaliou-se a precisão por meio da comparação dos dados a partir dos dois métodos, os dados foram altamente correlacionados para todos os parâmetros de folha (Figura 3). Dos 3.532 pontos de dados foram 172 (4,9%), que mostrou uma diferença marcante entre os métodos (evidenciado por valores extremos sendo as curvas de correlação). Analisamos a causa desses outliers. De 172 outliers, 29 foram devido a erros durante LeafJ medição plugin e 143 foram devido a erros na medição manual. Esta análise de erro também mostrou precisão da medição plugin.
jove_step "> 4 Tamanho da célula. Medição e número de célulasIndependente de LeafJ também desenvolvido um fluxo de trabalho eficiente para a medição do número de células e tamanho. O número de células e, teoricamente, o tamanho pode ser utilizado para classificar as plantas mutantes em nove categorias, quando comparado com o tipo selvagem, (1) menor tamanho de células com o número de células diminuiu, (2) as células menores, com o número de células normais, (3) as células menores, com um aumento de células números, (4) Tamanho de célula normal com o número de células decresceu (5), o tamanho da célula normal com o número de células normais, (6) o tamanho da célula normal com o número de células diminuiu, (7) de tamanho maior de células com o número de células diminuiu, (8) de maior dimensão o tamanho das células com o número de células normais, (9) o tamanho maior de células com o número de células aumentadas 15,16. Nós medimos parâmetros celulares folha em 67 genótipos de Arabidopsis thaliana utilizando o nosso tamanho da célula tablet baseado em células e método de medição número. Medimos o tamanho da célula de células a partir de 8629 877 224 folhas de plantas. Multiplicando b densidade celulary de área foliar (medida pelo LeafJ), estimamos o total da folha de dados do número de células de 438 folhas de 219 plantas. Nossa análise se esses genótipos em seis dos nove possíveis categorias (F ig. 4). A maior categoria foi (5): tamanho da célula normal e número; segunda maior era (8): tamanho maior de células com o número de células normal. Apesar de seguimento trabalho é necessário, isto sugere que o nosso método comprimido baseada pode ser utilizado para classificar os mutantes com base no tamanho e número de células da folha.
Figura 1. Um exemplo de pecíolo / folha de detecção de contorno da lâmina e da interface do utilizador. Note que LeafJ é capaz de definir pecíolo / folha fronteira lâmina automaticamente (Figura 1B). Clique aqui para ver maior figure.
Figura 2. Plugin de LeafJ poderia detectar respostas de fuga de sombra nos parâmetros de folhas variadas. Folha de 3 a 6 folhas de sete plantas tipo selvagem (Arabidopsis thaliana Columbia ecótipo) no âmbito de cada estado (sol e sombra) foram examinados. De cima da esquerda para a direita inferior, as unidades do eixo y são mm, mm, mm, 2 mm, relação entre o comprimento do pecíolo de comprimento de lâmina, e razão de comprimento de lâmina para a largura da lâmina. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Plugin de LeafJ é altamente preciso. Correlation de dados de medição manual e medição encaixe LeafJ de 3532 pontos de dados. Cada ponto representa uma folha. Pontos verdes indicam os 170 outliers no gráfico. Eixos de área foliar é mm 2 todos os outros são mm. Os números na parte frontal de cada parâmetro representando a posição da folha (isto é, "3" é a terceira folha).
Figura 4. Dispersão de área foliar e número de células célula folha entre os 67 genótipos de Arabidopsis thaliana. Cada ponto representa os fenótipos de cada genótipo cultivadas sob condição de sombra. As plantas foram classificadas em nove categorias com base na sua diferença a partir de tipo selvagem (Cl), tal como determinado através de um modelo linear de efeitos mistos e teste múltiplo corrigido valores p: cell (1) menor tamanho de célula, com o número de células diminuiu, (2) menor tamanho com a normaal do número de células, (3) menor tamanho de célula, com o número de células aumentada, (4) o tamanho da célula normal com o número de células diminuiu, (5) o tamanho da célula normal com número normal de células (6), o tamanho da célula normal com o número de células diminuiu, (7 ) de tamanho maior de células com o número de células diminuiu, (8) de tamanho maior de células com o número normal de células (9), maior tamanho de célula, com o número de células aumentou. "*" Indica o fenótipo de tipo selvagem (Col).
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Discussion
Nosso "LeafJ" plugin permite a medição do comprimento do pecíolo semi-automaticamente, aumentando o rendimento quase seis vezes medição manual. Comprimento do pecíolo é um índice importante da SAS e também é um marco de outros fenômenos, como a resistência submersão e crescimento hyponastic 17. Por conseguinte, este encaixe pode ser útil para uma vasta gama de pesquisadores de plantas.
Nosso plugin é implementado em uma bem estabelecida de software baseado em Java livre, ImageJ. Isso permite a instalação de plataforma cruzada fácil. Facilidade de modificação do programa também é uma vantagem do plugin ImageJ LeafJ porque já tem uma grande biblioteca de plug-ins que foram escritos por Java e linguagens ImageJ macro ( http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : iniciar ). Atualmente, apenas testado folhas de Arabidopsis, mas o nosso algoritmo de pecíolo / folha detecção de limite lâmina poderia aplicar tdicotiledônea o outro sai depois de algumas modificações do plugin.
Durante os testes do plugin LeafJ, encontramos a maioria dos 14 erros vieram de erros humanos, tais como extravio resultados copiados em fichas técnicas e / ou erros na etiquetagem de genótipos de plantas. Em casos raros o limite lâmina pecíolo / folha foi chamada incorretamente, necessitando de correção manual e criando riscos adicionais de erros de copiar e colar. Podemos detectar tais erros depois de olhar para os dados (a) por valores limiarização (por exemplo, pecíolos mais longos do que comprimento da folha) e (b) por encontrar condição amostra duplicado (por exemplo, "dom" ou "sombra"), genótipo, ou posição de folhas.
Nosso método tablet touch-screen facilitado precisão e velocidade de medição. Limitação do nosso método é que a comunicação entre o computador principal e o ecrã táctil comprimido depende da velocidade da rede de área local sem fios (LAN).
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
LeafJ foi escrito por JNM, enquanto ele estava em licença sabática no laboratório do Dr. Katherine Pollard dos Institutos Gladstone.
Este trabalho foi financiado por uma doação da Fundação Nacional de Ciência (concessão número IOS-0923752).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
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