Summary
Yüksek verimlilik yaprak ölçümler için anahtar yöntemleri gösterilmesi. Bu yöntemler, yaprak fenotip ile pek çok bitki mutant ya da başka tarama bitki incelenirken yaprak fenotipleme hızlandırmak için kullanılabilir.
Abstract
Yüksek verim fenotipleme (phenomics) (yorum 1 ve yeni örnekler 2-4 bakın) işlevlerine genleri bağlantı için güçlü bir araçtır. Yapraklar birincil fotosentetik organı vardır, ve boyutu ve şekli, bir bitki içinde gelişimsel olarak ve çevresel olarak değişir. Bu nedenlerden dolayı yaprak morfolojisi üzerine çalışmaları iyi yarı otomatik phenomics araçlar 5,6 yapılır sayısız yaprakları, birden fazla parametre ölçüm gerektirir. Canopy gölge bitki mimarisi ve yaşam öyküsü etkileyen önemli bir çevresel işaret olduğunu; yanıtların paketi topluca gölgede kaçınma sendromu (SAS) 7 denir. SAS yanıtları arasında, gölge uyarılmış yaprak sapı uzama ve bıçak alan değişiklikleri indeksleri 8 olarak özellikle yararlı olmaktadır. Bugüne kadar, yaprak şekli programlar (örn. SHAPE 9, LAMINA 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) yaprak anahatları ölçmek ve yaprak şekilleri kategorilere ayırabilirsinizAma yaprak sapı uzunluğu çıkışını alamazsınız. Yaprak sapı büyük ölçekli ölçüm sistemlerinin eksikliği SAS araştırma phenomics yaklaşımlar inhibe etmiştir. Bu yazıda, hızla model bitki Arabidopsis thaliana sapı uzunluğu ve yaprak ayası parametreleri ölçebilen LeafJ adlandırılan, yeni geliştirilmiş ImageJ eklentisi, tarif. Sapı / yaprak ayası sınır gerekli manuel düzeltme biz bir dokunmatik ekranlı tablet kullanılan sıra yaprak için. Ayrıca, yaprak hücre şekli ve yaprak hücre sayıları yaprak boyutu 13 önemli belirleyicileri. LeafJ ayırın biz de hücre şekli, alanı ve boyutunu ölçmek için bir dokunmatik ekranlı tablet kullanmak için bir protokol mevcut. Bizim yaprak sürekli ölçüm sistemi gölge-kaçınma araştırma ile sınırlı değildir ve yaprak fenotipleme tarafından birçok mutantlar ve tarama bitkilerin yaprak fenotipleme hızlandıracaktır.
Protocol
1. Bitki Materyalleri
Bu bitki büyüme protokolü gölge kaçınma yanıtını tespit için amaçlanmıştır unutmayın. En sevdiğiniz koşul altında bitkiler büyüyebilir.
- Karanlıkta dört gün boyunca 4 az 9 cm Petri kapları ve mağaza (tabakalandırmak) onları ° C filtre kağıtları batırılmış su Arabidopsis thaliana tohumu serpin.
- Simüle güneş koşulları bu petri aktarın: 1.86 FR oranı: 80-100 μE fotosentetik aktif radyasyon (PAR) ve uzak-kırmızı takviyesi R getirmek. Uzun bir günün koşullarında (16 saat aydınlık / 8 saat karanlık) ve 22 sabit sıcaklık ° C kullanın Tohumların çimlenmeye izin vermek üzere üç gün için bu durum içinde inkübe edin.
- Toprağa çimlenmiş tohum aktarın ve güneş koşullarında bitkiler tutmak. Büyük ölçekli deneyler için, etiket yapmak için Microsoft Word 2004 (veya üstü) olarak birleştirme Yöneticisi Veri kullanarak her bitki etiketleme için küçük etiketler hazırlamak öneririz.
- Onbir gün sonra trToprağa ansfer, gölge durumuna bitkilerin yarısı hareket: güneş gibi ama 0.52 ile R / FR oranı getirmek için ek uzak kırmızı ışık ile aynı.
- Ek bir on iki gün sonra, bitkilerin yaprak görüntüleme için hazırdır. Eğer bir gelişme anlık yakalamak böylece genç yapraklar hala genişleyen ise bu aşamada büyük yaprakları tamamen olgunlaşmıştır. İhtiyaçlarınıza bağlı olarak, farklı bir gelişme süresini seçmek isteyebilirsiniz.
2. Dissected Yaprak Görüntü Yakalama
- Beş dikdörtgen çerçeveli bitki genotipi ve büyüme durumu ile etiketlenmiş şeffaflık yaprak hazırlayın. Bir frame bir bitki yaprakları karşılık gelir. Microsoft Excel etiket ile tutarlı bir ızgara baskı için de kullanılabilir.
- Yirmi altı gün eski bitkilerin yaprakları teşrih.
- Tarama düz yataklı tarayıcıya 600 dpi bırakır. Bir bitkinin yaprakları Not şeffaf tabaka arasında bir sandviç siyah bir pencere içinde dikey olarak yerleştirilmelidir. Dokunmaktan yaprakları kaçınınAşağıdaki yordamlar hataları verecektir siyah bir pencere çerçevesi ve örtüşen yaprakları için.
3. LeafJ tarafından Yaprak Görüntü Analizi
- İndir ImageJ ImageJ ve plugins klasörüne LeafJ.jar dosya sürükleyin.
- ImageJ 1.45s veya sonraki 14 bir resim dosyası açın.
- "> Split Kanallar Görüntü> Renk" üç renk kanalları (kırmızı, yeşil ve mavi) içine görüntü Split ve mavi kanalda görüntüye eşik uygulayın.
- Bir dikdörtgen aracı (Şekil 1A) tek bitki yapraklarının tümünü seçin.
- Eklenti menüsünden "LeafJ" seçeneğini seçin.
- Görüntülenen iletişim kutusunda bu bitki için açıklama bilgisini seçin. You can"Bu düzenleme seçenekleri" buraya tıklayarak görüntülenen varsayılan değerleri düzenlemek.
- LeafJ eklenti çalıştırdıktan sonra ve "OK" butonuna tıklamadan önce, faiz (ROI) yöneticisi penceresi (; Şekil 1B gerekirse) bölgesinden takip hatları düzenleyin. Bir dokunmatik ekranlı tablet (örneğin bir iPad gibi) bu işlem için yararlıdır. iPad'ler Air Display yazılımı kullanarak harici bir monitör olarak bir bilgisayara bağlanabilir.
- Ölçüm sonuçları ve Microsoft Excel veya eşdeğer yazılım ilişkili bilgileri (dosya adları, çiçekli zamanı ile disseke, ölçülen, vb) aktarın.
4. ImageJ Yaprak Hücre Görüntü Analizi
- Disseke Fix olarak (adım 2) taramadan sonra referans 15'te açıklandığı bırakır. FAA sabit yaprakları en az 6 ay süreyle 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Mikroskobik gözlem 15 önce 1 ~ 2 saat süreyle kloral hidrat çözeltisi ve inkübe yaprakları FAA fiksatif değiştirerek yaprakları temizleyin.
- Dağı mil üzerinde bırakırmikroskop tüyler yukarı bakacak şekilde kayar. Tüyler veya damar yakın hücre kaçınarak, ana damar her iki tarafında her bir yaprak merkezinin bir bileşik mikroskop, görüntü mezofil tabaka üzerinde 40x büyütme kullanılması.
- Trace yaprak hücresindeki dokunmatik ekranlı tablet ve bir kalemle (olarak 3. adımda açıklandığı gibi) yardımı ile ImageJ ROI yöneticisi aracı tarafından özetliyor. Hücre görüntü analizi ImageJ ve yerleşik özellikler kullanır ama LeafJ gerektirmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Yaprak sapı ve Yaprak Blade Sınır tahminleri gösteriliyor Yaprak Görüntü ve Bunları Ölçme Pencere
LeafJ en kullanışlı özelliklerinden biri yaprak ayası / sapı sınır (Şekil 1) otomatik algılama olduğunu. Aşağıdaki gibi LeafJ algoritması çalışır: yerleşik ImageJ ParticleAnalyzer özelliğe kullanıcının seçim içinde yaprakların yönlendirme bulmak ve belirlemek için kullanılır. Her yaprak için yaprak genişliği yaprağın tüm eksen boyunca belirlenir. Daha sonra her bir eksen boyunca bir konumda genişlik değişim çalışan bir pencere (odak konumuna proksimal yedi pozisyonları için ortalama genişliği odak pozisyon distal yedi pozisyonları için ortalama genişliği çıkartılır) kullanılarak tespit edilir. Yaprak sapı / bıçak sınır genişlik değişim tüm genişlik hesaplanan farkların% 90 daha büyük olduğunda, yaprak tabanın ötesinde birinci pozisyon olarak tanımlanır. LeafJ ek denetimler reliabi artırmak için yaparBu çağrının vasıflı, 2) odak konumuna proksimal bölgede önemli bir değişiklik yok; özellikle LeafJ ayrıca 1) genişliği uzunluğu pozisyonların dar% 5 (bu sapı üssünde aberran çağrıları engeller) aşıyor gerektirir genişlikte ve 3), odak pozisyon distal yaprak% 20 genişlik sınır ile proksimal% 20 olması ve bu nedenle bıçak çünkü odak pozisyon sınır ise, odak pozisyonu (gerçek itibariyle en az% 150 daha geniş daha geniş).
Bir kez LeafJ sapı / bıçak sınırı belirlemiştir, ImageJ sınıflar yerleşik ve yöntemler bıçak alan, çevre ve dairesellik belirlemek için kullanılır. Dahili ImageJ yöntemler de bıçak için bir elips için uygun ve elips (sonra bıçak uzunluk ve genişlik olarak kullanılır) ve büyük ve küçük eksenleri hesaplamak için kullanılır. Yaprak sapı uzunluk yaprak sapı alan merkezi boyunca izler, bir çizgi ile belirlenir.
2. Gölge indüklenen Yaprak sapı Uzama Algılama </ P>
LeafJ ölçümler gölgede kaçınma assaying yararlı olup olmadığını sormak için, rastgele bir etki olarak sabit etkiler ve çoğaltmak gibi tedavi ve yaprak sayısı ile karışık etkiler modeli kullanılmıştır. Bıçak dairesellik ve bıçak uzunluğu / bıçak genişlik oranı (p <0.05) değildi oysa Biz, o yaprak sapı uzunluğu, kanat alanı, bıçak uzunluğu, bıçak genişliği ve yaprak sapı uzunluğu / bıçak uzunluğuna oranı önemli ölçüde gölgede tedavi etkilendi bulundu. Bizim veri LeafJ eklenti yaprak gölge sakınma cevapları (Şekil 2) üzerine çalışmalar için yararlı olduğunu gösterdi.
3. LeafJ Plugin Doğruluğu ve Hızı
Büyük veri LeafJ eklenti performansını belirlemek için biz operasyon süresi ve manuel ve eklenti ölçümleri arasında doğruluğu karşılaştırıldı ayarlar. Manuel ölçümler için biz kanat genişliği hızla artırmak için çıktı yer olarak sapı / bıçak sınır tanımlanır. Bu deneyimli bir araştırmacı ortalama 1 aldı Sadece 3 dakika 20 saniye sürdü LeafJ ile ise 9 dk 3 sn, manuel ölçüm tarafından beş bitkiler (yaklaşık 50 yaprak) ile bir şeffaflık ölçmek için. Plugin 5.7 kat daha hızlı manuel ölçüm daha oldu ile ölçüm, 5 asetat genelinde Ortalamalı. Manuel ölçüm birçok manuel ölçümler yapma deneyimi olan bir araştırmacı tarafından yapıldı; bir acemi LeafJ daha da büyük bir avantaj elde, manuel ölçüm de oldukça yavaş olacaktır. Biz iki yöntem verileri karşılaştırılarak doğruluğu değerlendirilir; veriler son derece (Şekil 3) tüm yaprak parametreler için karşılaştırılmıştır. 3,532 veri noktalarının yöntemleri (korelasyon araziler üzerinde aykırı olarak kanıtladığı) arasında güçlü farklılıklar gösterdi 172 (% 4.9) vardı. Biz bu Aykırılıkların nedenini analiz. 172 Aykırılıkların, 29 LeafJ eklenti ölçüm esnasında hata nedeniyle olduğunu ve 143 manuel ölçüm hataları nedeniyle vardı. Bu hata analizi de eklentisi ölçüm doğruluğunu gösterdi.
jove_step "> 4. Hücre Boyutu ve Hücre sayısı ÖlçümLeafJ Bağımsız biz de hücre sayısını ve boyutunu ölçmek için etkin bir iş akışı geliştirilmiştir. Teorik olarak hücre sayısı ve büyüklüğü vahşi tip ile karşılaştırıldığında, dokuz kategoriler halinde mutant bitkileri sınıflandırmak için de kullanılabilir; azalmış hücre sayıları ile (1) daha küçük hücre boyutu, (2) normal hücre sayısının daha küçük hücreler, (3) artmış hücre ile daha küçük hücre numaraları, azalmış hücre numaraları ile (4), normal hücre boyutu, (5) normal hücre sayısının normal hücre boyutu, (6) azalmış hücre sayıları normal hücre boyutu, (7) azalmış hücre sayıları ile büyük bir hücre boyutu, (8) büyük Normal hücre sayıları ile hücre boyutu, (9) artmış hücre sayıları 15,16 ile büyük bir hücre boyutu. Biz tablet tabanlı hücre büyüklüğü ve hücre sayısı ölçüm yöntemi kullanılarak Arabidopsis thaliana 67 genotiplerinde yaprak hücre parametreleri ölçüldü. Biz, 224 bitkilerin 877 yapraklarından 8.629 hücrelerin hücre boyutu ölçülmüştür. Hücre yoğunluğu b çarpımıy yaprak alanı (LeafJ ile ölçülen), biz 219 bitkilerden 438 yaprak toplam yaprak hücresindeki sayı veri tahmin. Bizim analizi mümkün dokuz kategoride (F ig. 4) altı içine bu genotipler yerleştirilir. Normal hücre boyutu ve sayısı; büyük ikinci (8) oldu: büyük kategori (5) idi normal hücre sayısı ile büyük bir hücre boyutu. Takip çalışma gerekli olmasına rağmen, bu da tablet tabanlı bir yöntem yaprak hücre boyutu ve sayısı göre mutantlar kategorize etmek için kullanılabileceğini göstermektedir.
Şekil 1. Sapı / yaprak ayası sınır tespiti ve kullanıcı arayüzü bir örnek. LeafJ (Şekil 1B) otomatik yaprak / sapı bıçak sınırı tanımlamak mümkün olduğunu unutmayın. daha büyük figu görüntülemek için buraya tıklayınyeniden.
Şekil 2. LeafJ eklenti çeşitli yaprak parametreleri gölgede sakınma cevapları tespit olabilir. Her koşul (güneş ve gölge) altında yedi yabani türü bitkiler (Arabidopsis thaliana Columbia ekotipi) den yaprak 6 Yaprak 3 incelendi. Sağ alt sol üst itibaren, y-ekseni birimleri mm, mm, mm, mm 2, bıçak uzunluğu sapı uzunluğu oranı ve bıçak genişliği bıçak uzunluğunun oranı vardır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3. LeafJ eklentisi oldukça doğrudur. C3,532 veri noktaları el ile ölçüm ve LeafJ eklenti ölçüm verilerinin bir korelasyon. Her bir nokta bir yaprak temsil eder. Yeşil nokta bu grafikte 170 sapan göstermektedir. Yaprak alanı Eksenleri 2 diğerleri mm mm. Her parametrenin önünde Numaraları yaprak duruşu (yani "3" üçüncü yaprak) temsil eder.
Şekil 4. Arabidopsis thaliana 67 genotipler arasında yaprak hücre alanı ve yaprak hücre sayısı Scatter arsa. Her nokta gölge koşullarında yetiştirilen her genotipin fenotipleri temsil eder. Azalmış hücre sayıları (1) küçük hücre boyutu, (2) küçük hücre: Bitkiler p-değerleri düzeltildi doğrusal karma etkiler modeli ve çoklu-test tarafından belirlenen vahşi tip (Col) dan farkı temelinde dokuz kategoride sınıflandırıldı normuna boyutuEl hücre sayısı, (3) artmış hücre sayısı ile daha küçük hücre boyutu, hücre sayısı azalmıştır ile (4) normal hücre boyutu, (5), normal hücre sayısı ile normal hücre boyutu, (6) azalmış hücre sayısı, normal hücre boyutu, (7 ) azalmış hücre sayısı, (8), normal hücre sayısı ile büyük bir hücre boyutu, (9) artmış hücre sayısı ile büyük bir hücre boyutu ile büyük bir hücre boyutu. "*" Vahşi tip (Col) fenotipini gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim "LeafJ" eklentisi manuel ölçüm fazla verim yaklaşık 6 kat artarak, yarı-otomatik sapı uzunluğu ölçüm sağlar. Yaprak sapı uzunluğu SAS önemli bir göstergesi ve aynı zamanda batıklık direnci ve hyponastic büyüme 17 gibi diğer olayların, bir dönüm noktası olduğunu. Bu nedenle, bu eklenti bitki araştırmacılar geniş bir yararlı olabilir.
Bizim eklentisi köklü bir java tabanlı ücretsiz yazılım, ImageJ uygulanmaktadır. Bu kolay çapraz platform kurulmasını sağlar. ImageJ zaten Java ve ImageJ makro dilleri (tarafından yazılmış eklentileri büyük bir kütüphaneye sahiptir, çünkü programın değiştirilmesi kolaylığı da LeafJ eklentisi bir avantajdır http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : başlar ). Şu anda sadece Arabidopsis yaprakları test, ama sapı / yaprak ayası sınır tespiti bizim algoritma t geçerli olabiliro diğer Dikoliledon eklenti bazı değiştikten sonra bırakır.
LeafJ eklenti test sırasında, 14 hataların çoğu gibi bilgi formu ve / veya bitki genotiplerinin yanlış etiketleme üzerine kopyalanan sonuçlar misplacing gibi insan hatalarından geldi. Nadir durumlarda sapı / yaprak ayası sınır manuel düzeltme gerektiren ve kopyalama ve yapıştırma hatalar ek risk oluştururken, yanlış denirdi. Biz Eşik değerleri veri (a) (yaprak uzunluğu uzun örn. petioles) bakarak ve sonra bu hataları tespit olabilir (b) çoğaltılmış örnek durum (ör. "güneş" veya "gölge"), genotip, veya yapraklar konumunu bularak.
Bizim dokunmatik ekranlı tablet yöntemi ölçüm doğruluğu ve hız kolaylaştırdı. Bizim yöntemi Sınırlandırılması o ana bilgisayar ve dokunmatik ekranlı tablet arasındaki iletişim kablosuz yerel alan ağı (LAN) hızı dayanır olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
O Gladstone Institutes Dr Katherine Pollard laboratuvarında tatilde iken LeafJ JNM tarafından yazılmıştır.
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (Hibe numarası IOS-0923752) tarafından sağlanan hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
- Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
- Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
- Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
- Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570 (2012).
- Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
- Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157 (2012).
- Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
- Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
- Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82 (2008).
- Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
- Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
- Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
- Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
- Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).
