Summary
Démonstration de méthodes de mesures clés pour la haute feuille de débit. Ces méthodes peuvent être utilisées pour accélérer le phénotypage feuille lors de l'étude des mutants de nombreux végétaux ou installations de criblage autrement par le phénotype feuilles.
Abstract
Phénotypage à haut débit (phénomique) est un outil puissant pour les liens entre les gènes de leurs fonctions (voir avis 1 et des exemples récents 2-4). Les feuilles sont l'organe photosynthétique primaire, leur taille et leur forme varient du développement et de l'environnement dans une usine. Pour ces raisons, les études sur la morphologie des feuilles nécessitent une mesure de plusieurs paramètres de nombreuses feuilles, qui est le mieux fait par des outils semi-automatiques Phenomics 5,6. Ombre Canopy est un indice important de l'environnement qui affecte l'architecture des plantes et de l'histoire de vie, la suite des réponses est collectivement appelé le syndrome d'évitement ombre (SAS) 7. Parmi les réponses SAS, ombre feuilles induit un allongement du pétiole et les changements de zone de la lame sont particulièrement utiles comme les indices 8. À ce jour, les programmes de la forme des feuilles (par exemple, forme 9, LAMINA 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) permet de mesurer les contours de feuilles et de catégoriser les formes de feuilles, Mais ne peut pas émettre la longueur du pétiole. Le manque de systèmes de mesure à grande échelle des pétioles des feuilles a inhibé les approches Phenomics à SAS de recherche. Dans cet article, nous décrivons un plugin ImageJ nouvellement développé, appelé LeafJ, qui peut rapidement mesurer la longueur du pétiole et limbe des paramètres de la plante modèle Arabidopsis thaliana. Pour la feuille de temps en temps que la correction manuelle requise de la frontière lame pétiole / feuille, nous avons utilisé une tablette à écran tactile. De plus, la forme des cellules des feuilles et le nombre de cellules des feuilles sont des déterminants importants de 13 la taille des feuilles. Séparer LeafJ nous présentons également un protocole d'utilisation d'une tablette à écran tactile pour mesurer la forme des cellules, la superficie et la taille. Notre système de mesure feuille de trait ne se limite pas à l'ombre d'évitement de recherche et permettra d'accélérer le phénotypage feuille de mutants et de plantes de dépistage par phénotypage feuille.
Protocol
1. Matières végétales
Notez que ce protocole a pour objectif la croissance des plantes pour détecter la réaction d'évitement ombre. Vous pouvez faire pousser des plantes dans votre état préféré.
- Saupoudrer de graines d'Arabidopsis thaliana sur l'eau trempés papiers filtres dans 9 des plats de Pétri et magasins cm (stratification) les à 4 ° C pendant quatre jours dans l'obscurité.
- Transférer ces boîtes de Pétri à conditions d'ensoleillement simulées: 80-100 rayonnement pE photosynthétiquement actif (RPA) et rouge lointain supplément pour amener le R: FR rapport à 1,86. Utiliser conditions de jours longs (16 h de lumière / 8 h obscurité) et la température constante de 22 ° C. Incuber dans cet état pendant trois jours pour permettre aux graines de germer.
- Transfert de graines germées au sol et garder les plantes dans des conditions dim. Pour les grandes expériences, nous vous recommandons de préparer de petites étiquettes pour l'étiquetage chacune des plantes à l'aide de Gestionnaire de fusion de données dans Microsoft Word 2004 (ou version ultérieure) pour créer des étiquettes.
- Onze jours après transfer sur le sol, placez la moitié des plantes à l'état de l'ombre: même soleil, mais avec droit de reprise rouge lointain lumière pour ramener le ratio R / FR à 0,52.
- Après une période de douze jours, les plantes sont prêtes pour l'imagerie feuille. A ce stade, les feuilles les plus âgées ont pleine maturité alors que les jeunes feuilles sont toujours en expansion, de sorte que vous capturer un instantané de développement. Vous pouvez choisir un temps de développement différent en fonction de vos besoins.
2. Capture d'images feuilles disséquées
- Préparer les feuilles de transparence étiquetés avec génotype de la plante et des conditions de croissance avec cinq cadres rectangulaires. Un cadre correspond à feuilles d'une plante. Microsoft Excel peut être utilisée pour imprimer une grille conforme aux étiquettes.
- Disséquer feuilles de 26 jours vieilles usines.
- Balayage part à 600 dpi sur un scanner à plat. Notez que laisse d'une plante doit être placée verticalement dans une fenêtre noire dans un sandwich de feuilles transparentes. Évitez de toucher les feuillespour un cadre de fenêtre noire et feuilles qui se chevauchent, ce qui donnera une erreur, les procédures suivantes.
3. Feuille d'analyse d'images par LeafJ
- Télécharger ImageJ Faites glisser le fichier LeafJ.jar dans le dossier plugins d'ImageJ.
- Ouvrir un fichier image en 1.45s ImageJ ou tard, 14.
- Diviser l'image en trois couleurs canaux (rouge, vert et bleu) par "Image> Couleur Canaux> Split" et appliquer seuil à l'image dans le canal bleu.
- Sélectionner toutes les feuilles d'une plante par un outil rectangle (figure 1A).
- Sélectionnez "LeafJ" dans le menu plugin.
- Sélectionnez informations d'annotation pour cette plante à partir de la boîte de dialogue qui apparaît. Vous pouvezmodifier les valeurs par défaut qui apparaissent ici en cliquant sur "modifier ces options".
- Après l'exécution de plug-in LeafJ et avant de cliquer sur "OK", modifier les lignes tracées de la région de fenêtre du gestionnaire d'intérêt (ROI) (si nécessaire; figure 1B). Une tablette à écran tactile (comme un iPad) est utile pour cette procédure. iPads peut être connecté à un ordinateur comme un moniteur externe en utilisant un logiciel d'affichage de l'air.
- Exporter les résultats de mesure et les informations associées (nom de fichier, le temps de la floraison, disséqués par mesurées par, etc) vers Microsoft Excel ou un logiciel équivalent.
4. Feuille d'analyse d'images de cellules dans ImageJ
- Fixer disséqué laisse comme décrit dans la référence 15 après la numérisation (étape 2). Feuilles FAA fixes peuvent être conservés dans 4 ° C pendant au moins 6 mois.
- Effacer les feuilles en changeant fixateur FAA à la solution de l'hydrate de chloral et les feuilles incuber pendant 1 à 2 heures avant l'observation microscopique 15.
- Mont quitte le microscope glisse avec trichomes vers le haut. En utilisant un grossissement 40x sur un microscope optique, l'image de la couche de mésophylle le centre de chaque feuille de chaque côté de la nervure principale, en évitant les cellules proches de trichomes ou des veines.
- Cellule de feuille de trace décrit par l'outil ImageJ gestionnaire retour sur investissement avec l'aide de la tablette à écran tactile et un stylet (comme décrit dans l'étape 3). Cellule d'analyse d'image utilise les fonctionnalités intégrées de ImageJ mais n'exige pas LeafJ.
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Representative Results
1. Images Feuille Affichage estimations du pétiole et limbe frontière, et leur fenêtre de mesure
L'une des caractéristiques les plus utiles de LeafJ est la détection automatique des limbe / Pétiole limite (figure 1). L'algorithme LeafJ fonctionne comme suit: le haut-ImageJ ParticleAnalyzer fonctionnalité est utilisée pour trouver et déterminer l'orientation des feuilles à l'intérieur de la sélection de l'utilisateur. Pour chaque feuille de la largeur de la feuille est déterminée selon l'axe de la feuille entière. Ensuite le changement de la largeur au niveau de chaque position le long de l'axe est déterminé en utilisant une fenêtre de fonctionnement (la largeur moyenne pour les sept positions proximales de la position focale est soustraite de la largeur moyenne pour les sept positions distales de la position focale). La limite pétiole / lame est définie comme étant la première position au-delà de la base des feuilles lorsque le changement de largeur est supérieure à 90% de toutes les différences de largeur calculée. LeafJ effectue des vérifications supplémentaires pour augmenter la fiabilité de cet appel, plus précisément LeafJ exige également que 1) la largeur est supérieure à la plus étroite de 5% des postes dans la longueur (ce qui évite les appels aberrants à la base du pétiole), 2) la région proximale à la position du foyer ne dispose pas d'un changement majeur en largeur, et 3) la largeur de la feuille 20% en aval de la position focale est d'au moins 150% plus large que la position focale (vrai si la position focale est la limite parce que 20% de la limite proximale de la lame et doit être par conséquent beaucoup plus large).
Une fois LeafJ a défini la frontière pétiole / lame, intégré dans les classes ImageJ et les méthodes sont utilisées pour déterminer zone de la lame, le périmètre et la circularité. Des méthodes intégrées ImageJ sont également utilisées pour ajuster une ellipse à la lame et à calculer les axes majeur et mineur de l'ellipse (alors utilisé comme longueur de la lame et de largeur). Pétiole est déterminée par une ligne qui trace le long du centre de la zone de pétiole.
2. La détection de l'ombre induite par Pétiole Allongement </ P>
De se demander si les mesures LeafJ étaient utiles dans le dosage d'éviter l'ombre, nous avons utilisé un modèle à effets mixtes avec le traitement et le nombre de feuilles comme des effets fixes et des analyses répétées comme un effet aléatoire. Nous avons constaté que la longueur du pétiole, zone de la lame, longueur de la lame, largeur de la lame, et le ratio de la longueur du pétiole de longueur / de la lame ont été significativement affectée par le traitement d'ombre, tandis que la circularité lame et le rapport largeur longueur de la lame / lame ne sont pas (p <0,05). Nos données montrent que le plugin LeafJ est utile pour des études sur les feuilles de réponses d'évitement d'ombre (figure 2).
3. La précision et la vitesse du plugin LeafJ
Pour déterminer la performance du plugin LeafJ dans les grands ensembles de données, nous avons comparé le temps de fonctionnement et la précision entre le manuel et les mesures plugin. Pour les mesures manuelles, nous avons défini la frontière pétiole / lame comme le lieu où la largeur de la feuille semble augmenter rapidement. Il a fallu un chercheur expérimenté en moyenne 1 9 min 3 sec pour mesurer une transparence avec cinq usines (environ 50 feuilles) par mesure manuelle, alors qu'avec LeafJ il a fallu seulement 3 min 20 sec. En moyenne sur 5 transparents, mesurer avec le plugin était 5,7 fois plus rapide que la mesure manuelle. La mesure manuelle a été réalisée par un chercheur ayant de l'expérience dans la fabrication mesures manuelles nombreux; un débutant serait considérablement plus lente à mesure manuelle, ce qui entraîne un avantage encore plus grand de LeafJ. Nous avons évalué la précision en comparant les données des deux méthodes, les données étaient fortement corrélées pour tous les paramètres feuilles (Figure 3). Sur les 3.532 points de données, il y avait 172 (4,9%) qui a montré de grandes différences entre les méthodes (en témoigne étant valeurs aberrantes sur les parcelles de corrélation). Nous avons analysé la cause de ces valeurs aberrantes. De 172 valeurs aberrantes, 29 étaient dus à des erreurs lors de la mesure plug-in LeafJ et 143 étaient dus à des erreurs de mesure manuelle. Cette analyse a également montré erreur précision de la mesure plugin.
jove_step "> 4 Taille de la cellule. Mesure et Nombre de cellulesIndépendamment de LeafJ nous avons également développé un flux de travail efficace pour mesurer le nombre de cellules et la taille. Le nombre de cellules et la taille théorique peut être utilisé pour classer les plantes mutantes en neuf catégories par rapport au type sauvage; (1) plus petite taille des cellules avec une diminution du nombre de cellules, (2) les petites cellules avec des nombres de cellules normales, (3) les petites cellules avec des cellules a augmenté nombres, (4) la taille des cellules normales avec le nombre de cellules a diminué, (5) la taille normale des cellules avec des nombres de cellules normales, (6) la taille des cellules normales avec le nombre de cellules a diminué, (7) de plus grande taille de cellule avec une diminution du nombre de cellules (8), plus la taille des cellules avec des nombres de cellules normales, (9) la taille plus grande cellule avec une augmentation du nombre de cellules 15,16. Nous avons mesuré les paramètres cellulaires de feuilles dans 67 génotypes d'Arabidopsis thaliana en utilisant notre taille de la cellule sous forme de comprimés et de la méthode de mesure la cellule numéro. Nous avons mesuré la taille de cellule de 8.629 cellules de 877 feuilles de 224 plantes. B multipliant la densité cellulairey foliaire (mesurée par LeafJ), nous avons estimé données sur le total des feuilles cellulaires nombre de 438 feuilles de 219 plantes. Notre analyse a placé ces génotypes dans six des neuf catégories possibles (F ig. 4). La catégorie la plus importante était (5): la taille et le nombre de cellules normales; la deuxième était (8): taille de cellule plus grande avec le nombre de cellules normales. Bien que le travail de suivi est nécessaire, ce qui suggère que notre forme de comprimés méthode peut être utilisée pour classer les mutants en fonction de la taille des cellules des feuilles et le nombre.
Figure 1. Un exemple du pétiole / feuille de détection de frontière lame et l'interface utilisateur. Notez que LeafJ est en mesure de définir la limite lame pétiole / feuille automatiquement (figure 1B). Cliquez ici pour agrandir l'Figure.
Figure 2. LeafJ plug-in peut détecter des réponses d'évitement d'ombrage dans les paramètres feuilles différentes. Feuille 3 à 6 feuilles de sept plantes de type sauvage (Arabidopsis thaliana écotype Columbia) sous chaque condition (soleil et ombre) ont été examinés. De haut en bas de gauche à droite, les unités de l'axe y sont mm, mm, mm, mm 2, rapport de la longueur du pétiole de longueur de la lame, et le ratio de longueur de la lame à la largeur de la lame. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. LeafJ plug-in est très précis. Correlation des données de mesure manuelle et la mesure LeafJ plug-in de 3.532 points de données. Chaque point représente une feuille. Les points verts indiquent les 170 valeurs aberrantes dans ce graphique. Axes de la surface foliaire est mm 2 mm tous les autres sont. Les chiffres en face de chaque paramètre représente position de la feuille (par exemple "3" est le troisième feuille).
Figure 4. Diagramme de dispersion de la zone de cellule de feuille et le numéro de cellule de feuille parmi les 67 génotypes d'Arabidopsis thaliana. Chaque point représente les phénotypes de chaque génotype cultivé dans des conditions ombre. Les plantes ont été classées en neuf catégories en fonction de leur différence de type sauvage (Col) tel que déterminé par un linéaire à effets mixtes modèle et multiples tests valeurs p corrigées: cellule (1) taille de cellule plus petite avec une diminution du nombre de cellules, (2) plus petit taille à la normenombre de cellules al, (3) de plus petite taille de cellule avec le numéro cellulaire accrue, (4) la taille des cellules normales avec le nombre de cellules diminue, (5) la taille des cellules normales avec le nombre de cellules normales, (6) la taille des cellules normales avec le nombre de cellules diminue, (7 ) plus grande taille de cellule avec le nombre de cellules diminue, (8) de plus grande taille avec le nombre de cellules des cellules normales, (9) de plus grande taille de cellule avec le nombre de cellules augmente. "*" Indique le phénotype de type sauvage (Col).
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Discussion
Notre "LeafJ" plugin permet de mesurer la longueur du pétiole semi-automatique, en augmentant le débit de près de 6 fois plus de mesure manuelle. Longueur du pétiole est un indice important de la SAS et est également un emblème d'autres phénomènes, comme la résistance de submersion et la croissance hyponastic 17. Par conséquent, ce plugin peut être utile à un large éventail de chercheurs de plantes.
Notre plugin est mis en œuvre dans un réseau bien établi basé sur Java et le logiciel libre, ImageJ. Cela permet facilement plates-formes d'installation. Facilité de modification du programme est également un avantage du plugin ImageJ LeafJ parce possède déjà une grande bibliothèque de plugins qui ont été écrits par Java et de langages de macro ImageJ ( http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial : commencer ). Actuellement, nous ne testé feuilles d'Arabidopsis, mais notre algorithme du pétiole / feuille de détection de frontière lame pourrait s'appliquer to dicotylédones autre part après quelques modifications du plugin.
Pendant les essais, le plugin LeafJ, nous avons trouvé la plupart des 14 erreurs provenaient des erreurs humaines telles que égarer les résultats copiées sur des fiches techniques et / ou une mauvaise des génotypes végétaux. Dans de rares cas la limite de la lame pétiole / feuille a été appelée de manière incorrecte, ce qui nécessite une correction manuelle et de créer des risques supplémentaires d'erreurs de copier-coller. Nous avons pu détecter de telles erreurs après avoir regardé données (a) par des valeurs de seuillage (par exemple pétioles plus longs que la longueur des feuilles) et (b) en trouvant état de l'échantillon en double (par exemple, "soleil" ou "ombre"), génotype, ou la position des feuilles.
Notre méthode tablette à écran tactile facilite la précision et la vitesse de mesure. Limitation de notre méthode est que la communication entre l'ordinateur principal et la tablette tactile dépend de la vitesse du réseau local sans fil (LAN).
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
LeafJ a été écrit par JNM alors qu'il était en congé sabbatique au laboratoire du Dr Katherine Pollard aux Instituts Gladstone.
Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation (numéro de licence IOS-0923752).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
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