Summary
높은 처리량 잎 측정을위한 주요 방법의 시범. 이러한 방법은 잎 표현형하여 많은 식물의 돌연변이 또는 기타 검사 식물을 공부할 때 잎 phenotyping을 가속화하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
높은 처리량 phenotyping (phenomics (주) 검토 1 최근 예 2-4 참조)의 기능과 유전자를 연결하기위한 강력한 도구입니다. 잎은 기본 광합성 기관이며, 크기와 모양이 공장 내에 발달 및 환경 다를 수 있습니다. 이러한 이유로 잎 형태에 대한 연구는 가장 반 자동화 phenomics 도구 5,6에 의해 수행됩니다 많은 잎에서 여러 매개 변수의 측정을 필요로합니다. 캐노피 그늘 공장 건축과 생활의 역사에 영향을 미치는 중요한 환경 큐, 응답의 스위트 룸은 총체적으로 그늘 회피 증후군 (SAS) 7이라고합니다. SAS 응답 중 그늘 유도 잎 잎자루의 신장 및 블레이드 지역의 변화는 인덱스 8과 같은 특히 유용합니다. 현재까지, 잎 모양 프로그램 (예 : SHAPE 9, 얇은 판 10, LeafAnalyzer 11 LEAFPROCESSOR 12) 잎 윤곽선을 측정하고 잎 모양을 분류 할 수 있습니다하지만 잎자루 길이를 출력 할 수 없습니다. 잎 petioles의 대규모 측정 시스템의 부족 SAS 연구 phenomics 방식을 저해하고 있습니다. 이 논문에서, 우리는 신속하게 모델 식물 Arabidopsis thaliana의의 잎자루 길이와 잎 블레이드 매개 변수를 측정 할 수 LeafJ라는 새로 개발 된 ImageJ 플러그인을, 설명합니다. 잎자루 / 잎 블레이드 경계의 필요한 수동 보정은 우리가 터치 스크린 태블릿을 사용하는 가끔 잎하십시오. 또한, 잎 세포 모양과 잎 셀 번호는 잎 크기로는 13의 중요한 determinants 있습니다. LeafJ는 별도로 우리는 또한 세포 모양, 면적 및 크기를 측정하기위한 터치 스크린 타블렛을 사용하는 프로토콜을 제시한다. 우리 잎의 특성 측정 시스템은 그늘 회피 연구에 한정되지 않고 잎 phenotyping에 의해 많은 돌연변이 검사 식물의 잎 phenotyping을 가속화합니다.
Protocol
1. 식물 재료
이 식물의 성장 프로토콜이 커버 회피 응답을 검출하기위한 목적으로합니다. 니가 제일 좋아하는 조건에서 식물을 성장 할 수 있습니다.
- 어둠 속에서 4 일 동안 4에 9cm 페트리 요리와 저장소 (계 충화하다)를 ° C로 필터 종이를 흠뻑 물에 Arabidopsis thaliana의 씨앗을 뿌린다.
- 모의 태양 조건에 해당 페트리 요리를 전송 : 1.86에 FR 비율 : 80-100 μE photosynthetically 활성화 방사선 (PAR)과 멀리 빨간 추가 요금이 부과 R을 가지고. 긴 하루를 조건 (16 시간 조명 / 8 시간 어두운) 및 (22)의 일정한 온도 ° C.를 사용하여 씨앗이 발아 할 수 있도록 3 일이 조건에 품다.
- 토양에 germinated 씨앗을 전송, 일광욕 조건에서 식물을 유지. 대규모 실험, 우리는 레이블을 만들기위한 마이크로 소프트 워드 2004 (이상)에서 관리자를 병합 데이터를 사용하여 각 식물을 라벨에 작은 태그를 준비하는 것이 좋습니다.
- 일레븐 일 TR 후토양에 ansfer는 그늘 상태에 식물의 절반을 이동 : 태양 있지만 0.52에 R / FR 비율을 가져다 보완 멀리 붉은 빛으로 동일합니다.
- 추가 십이일 후, 식물 잎 이미지에 대한 준비가되어 있습니다. 당신은 개발의 스냅 샷을 캡처 할 수 있도록 어린 잎은 여전히 확장하는 반면이 단계에서는 기존의 잎이 완전히 성숙했습니다. 당신은 당신의 요구에 따라 다른 발달 시간을 선택 할 수 있습니다.
2. 해부 잎 이미지 캡처
- 다섯 직사각형 프레임이있는 식물 유전자형과 성장 조건과 함께 표시 투명 시트를 준비합니다. 한 프레임 한 공장에서 잎에 해당합니다. Microsoft Excel을이 레이블을 사용하여 일관된 그리드를 인쇄하는 데 사용할 수 있습니다.
- 이십육일 오래된 식물의 잎을 해부.
- 검사는 평면 침대 스캐너에서 600 DPI에서 출발합니다. 씨앗에서 출발 참고 투명 시트의 샌드위치에 검은 창에서 세로로 배치해야합니다. 감동 잎을 피다음 절차에 오류를 줄 것이다 검은 창 프레임과 중복 잎 있습니다.
3. LeafJ의 잎 이미지 분석
- 다운로드 ImageJ ImageJ의 플러그인 폴더로 LeafJ.jar 파일을 드래그합니다.
- ImageJ 1.45s 이상 14 이미지 파일을 엽니 다.
- "> 분할 채널은 이미지> 색상"에 의해 3 색 채널 (빨강, 녹색, 파랑)로 이미지를 분할하고 파란색 채널의 이미지에 임계 값을 적용 할 수 있습니다.
- 사각형 도구 (그림 1A)하여 한 공장에서 잎을 모두 선택합니다.
- 플러그인 메뉴에서 "LeafJ"를 선택하십시오.
- 나타나는 대화 상자에서이 공장 주석 정보를 선택하십시오. 당신은 할 수"이러한 옵션 수정 '을 클릭하여 여기에 표시되는 기본 값을 편집 할 수 있습니다.
- LeafJ 플러그인을 실행 후에 "OK"버튼을 클릭하기 전에,이자 (ROI) 관리자 창 (, 그림 1B 필요한 경우)의 지역에서 추적 선을 편집 할 수 있습니다. 터치 스크린 태블릿 (예 : 아이 패드 등)이 절차에 유용합니다. iPads는 에어 디스플레이 소프트웨어를 사용하여 외부 모니터로 컴퓨터에 연결 할 수 있습니다.
- 측정 결과 및 Microsoft Excel 또는 이에 상응하는 소프트웨어에 관련 정보 (파일 이름, 꽃 시간에 의해 해부에 의해 측정 등) 보냅니다.
4. ImageJ의 잎 세포 이미지 분석
- 해부 해결은 (제 2 단계) 스캔 한 후 참조 15에 설명되어 출발합니다. FAA 고정 잎은 적어도 6 개월 이상에 대해 4 ° C에 보관하실 수 있습니다.
- 현미경 관찰 15 전 1 ~ 2 시간에 클로 랄 하이드레이트 솔루션과 길러 잎에 FAA의 정착액을 변경하여 잎을 해제합니다.
- 마운트 마일에 출발croscope는 trichomes가 직면과 슬라이드. trichomes 또는 정맥 근처의 세포를 피 주요 정맥의 양쪽에 각 잎의 중심 복합 현미경, 이미지 mesophyll 층에 40x 배율을 사용합니다.
- 추적 잎 셀은 터치 스크린 태블릿과 스타일러스 (3 단계에서 설명한대로)의 도움을 ImageJ 투자 수익 (ROI) 관리자 도구에 의해 설명합니다. 세포 이미지 분석 ImageJ의 내장 된 기능을 사용하지만 LeafJ을 필요로하지 않습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. 잎자루과 리프 블레이드 경계의 견적보기 잎 이미지, 그리고 그들의 측정 창
LeafJ의 가장 유용한 기능 중 하나는 잎 블레이드 / 잎자루 경계 (그림 1)의 자동 감지합니다. 다음과 같이 LeafJ 알고리즘은 작동 내장 된 ImageJ ParticleAnalyzer 기능은 사용자 선택의 안쪽 잎의 방향을 찾아 결정하는 데 사용됩니다. 각 잎의 경우 잎의 폭은 잎의 전체 축을 따라 결정됩니다. 그런 다음 축을 따라 각 위치에서 폭의 변화는 실행 창을 (초점 위치에 인접 일곱 위치에 대한 평균 폭은 초점 위치로 말초 일곱 위치에 대한 평균 폭에서 공제됩니다)를 사용하여 결정됩니다. 잎자루 / 블레이드 경계 폭의 변화가 모든 계산 폭의 차이의 90 %보다 더 큰 잎베이스 이외의 첫 번째 위치로 정의됩니다. LeafJ 추가 검사가 reliabi을 증가하는 것이 전화 lity는, 2) 초점 위치로 인접 지역은 큰 변화가없는, 특히 LeafJ도 1)의 폭이 길이 위치의 좁은 5 %를 (이 잎자루베이스에서 탈선 통화를 않도록)를 초과합니다 폭, 그리고 3) 초점 위치로 말초 잎의 20 % 폭의 경계에 인접 20 % 따라서 블레이드하게해야하기 때문에 초점 위치의 경계 경우 초점 위치 (해당시보다 적어도 1백50% 넓은입니다 더 넓은).
일단 LeafJ은 잎자루 / 블레이드 경계를 정의했다 ImageJ 수업 내장 및 방법은 블레이드 지역, 주변, 그리고 순환 성을 결정하는 데 사용됩니다. 내장 ImageJ 방법 또한 블레이드에 타원을 맞게 그 타원 (당시 블레이드 길이와 폭으로 사용)의 전공 및 부전공 축를 계산하는 데 사용됩니다. 잎자루 길이는 잎자루 지역의 중심을 따라 흔적있는 라인에 의해 결정됩니다.
2. 그늘에서 유도 잎자루의 신장의 검색 </ P>
LeafJ 측정은 그늘 방지를 시금에 유용하는지 여부를 묻고, 우리는 임의의 효과로 고정 효과와 복제로 치료와 잎 번호로 혼합 효과 모델을 사용했습니다. 블레이드 순환 성 및 블레이드의 길이 / 날개 폭 비율 (P <0.05)하지 못했습니다 반면에 우리는 그 잎자루 길이, 블레이드 공간, 블레이드 길이, 블레이드 폭과 잎자루 길이 / 날개 길이 비율 크게 그늘 치료에 의해 영향을 받았다고을 발견했다. 우리의 데이터는 LeafJ 플러그인은 잎 그늘 회피 응답 (그림 2)에 대한 연구에 유용 것으로 나타났다.
3. LeafJ 플러그인의 정확성과 속도
큰 데이터의 LeafJ 플러그인의 성능을 결정하는 것은 우리가 작업 시간 및 수동 및 플러그인 측정 사이의 정확도를 비교 설정합니다. 수동 측정을 위해 우리는 잎의 폭이 빠르게 증가 게재 된 곳으로 잎자루 / 블레이드 경계를 정의. 그것은 숙련 된 연구자에게 하나의 평균을했다 그것은 단지 3 분 20 초했다 LeafJ과 동시에 9 분 3 초는, 수동 측정하여 최대 5 개의 식물 (50 잎)와 하나 투명성을 측정합니다. 플러그인이 5.7 배 빠른 수동 측정보다이었습니다을 측정, 5 투명에 걸쳐 평균 한 값입니다. 수동 측정은 많은 수동 측정을 만드는 경험이있는 연구자에 의해 수행되었다, 초보자 LeafJ의 더 큰 장점의 결과로, 수동 측정에서 상당히 느려질 것입니다. 우리는 두 가지 방법의 데이터를 비교하여 정확도를 평가, 데이터는 매우 (그림 3) 모든 잎 매개 변수 상관이되었습니다. 3532 데이터 포인트의 방법 (상관 관계 플롯에 특이점 됨으로써 입증) 사이의 강한 차이를 보여 172 (4.9 %)은 있었다. 우리는이 특이점의 원인을 분석했다. 172 특이점 중 29 LeafJ 플러그인 측정하는 동안 오류에 의한하며, 크기는 143 수동 측정의 오류로 인해했습니다. 이 오류 분석은 또한 플러그인 측정의 정확성을 보여 주었다.
jove_step "> 4. 세포 크기와 세포 수 측정LeafJ의 독립 우리는 또한 휴대폰 번호와 크기를 측정하기위한 효율적인 워크 플로우를 개발했다. 이론적으로 휴대폰 번호와 크기는 야생 유형과 비교했을 때 아홉 카테고리로 돌연변이 식물을 분류하는 데 사용할 수 있습니다, 감소 전화 번호 (1) 작은 셀 크기, (2) 일반 전화 번호가있는 작은 세포, (3) 증가 셀 작은 세포 번호, 감소 셀 번호 (4) 일반 세포 크기, (5) 일반 전화 번호로 정상 세포의 크기, (6) 감소 셀 번호를 일반 셀 크기, (7) 감소 전화 번호가있는 큰 셀 크기, (8) 큰 일반 전화 번호가있는 셀 크기, (9) 증가 전화 번호 15,16가있는 큰 셀 크기입니다. 우리는 우리의 태블릿 기반의 셀 크기 및 전화 번호 측정 방법을 사용하여 Arabidopsis thaliana의 67 genotypes에 잎 세포 매개 변수를 측정. 우리는 224 식물의 잎에서 877 8629 셀의 셀 크기를 측정했습니다. 셀 밀도 B를 곱한Y 잎 면적은 (LeafJ에 의해 측정), 우리는 219 식물에서 438 잎 총 잎 전화 번호 데이터를 추정했다. 우리 분석은 가능한 구 범주 (F IG. 4) 여섯에 이러한 genotypes을 배치. 일반 셀의 크기 및 숫자, 두 번째로 큰 (8)했다 : 가장 큰 범주는 (5)였습니다 일반 휴대폰 번호로 큰 셀 크기입니다. 후속 작업이 필요하지만, 이곳은 우리의 태블릿 기반의 방법은 잎 세포의 크기와 수에 따라 돌연변이를 분류하는 데 사용할 수 있습니다하는 것이 좋습니다.
그림 1. 잎자루 / 잎 블레이드 경계 탐지 및 사용자 인터페이스의 예라고 할 수 있습니다. LeafJ는 (그림 1B)이 자동으로 잎 / 잎자루 블레이드 경계를 정의 할 수 있습니다. 큰 figu을 보려면 여기를 클릭하십시오다시.
그림 2. LeafJ 플러그인은 다양한 잎 매개 변수에 커버 회피 응답을 감지 수 있습니다. 각 조건 (태양과 그늘)에서 일곱 야생 형 식물 (Arabidopsis thaliana 콜롬비아 ecotype)에서 잎 6 잎 3 조사되었다. 오른쪽 아래 왼쪽 상단에서 Y 축 단위는 mm, mm, mm, mm 2, 블레이드 길이 잎자루 길이의 비율, 그리고 블레이드 폭 블레이드 길이의 비율입니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. LeafJ 플러그인은 매우 정확합니다. C3532 데이터 포인트에서 수동 측정 및 LeafJ 플러그인 측정의 데이터 orrelation. 각 점은 한 잎을 나타냅니다. 녹색 점은이 그래프에서 170 특이점을 나타냅니다. 잎 영역의 축 2 모든 다른 mm 아르 mm입니다. 각 매개 변수 앞의 숫자는 잎의 위치 (예 : "3"는 세 번째 잎 임) 나타냅니다.
그림 4. Arabidopsis thaliana의 67 genotypes 사이에 잎 셀 영역과 잎 전화 번호의 분산 플롯. 각 점은 그늘 조건에서 성장 각 유전자형의 phenotypes을 나타냅니다. 감소 전화 번호 (1) 작은 셀 크기, (2) 작은 셀 : 식물은 P-값을 수정 선형 혼합 효과 모델과 여러 테스트에 의해 결정으로 야생 유형 (열)에서의 차이에 따라 아홉 가지 범주로 분류되었다 규범과 크기야외 휴대폰 번호, (3) 증가 휴대폰 번호가있는 작은 셀 크기, 감소 셀 번호 (4) 일반 세포 크기, (5) 일반 휴대폰 번호로 정상 세포의 크기, (6) 감소 핸드폰 번호로 정상 세포 크기, (7 ) 감소 핸드폰 번호, (8) 일반 전화 번호로 큰 셀 크기, (9) 증가 휴대폰 번호가있는 큰 셀 크기가 큰 셀 크기입니다. "*"와일드 유형 (열)의 표현형 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리의 "LeafJ"플러그인은 수동 측정을 통해 처리 할 거의 6 배 증가, 반 자동으로 잎자루 길이의 측정을 할 수 있습니다. 잎자루 길이는 SAS의 중요한 인덱스이며 또한 잠수 저항과 hyponastic 성장 17과 같은 다른 현상의 랜드 마크입니다. 따라서이 플러그인은 식물 연구자의 다양한 유용 할 수 있습니다.
우리 플러그인은 잘 알려진 자바 기반의 무료 소프트웨어, ImageJ에서 구현됩니다. 이 쉽게 크로스 플랫폼 설치를 사용할 수 있습니다. ImageJ가 이미 자바와 ImageJ 매크로 언어 (에 의해 작성되었습니다 플러그인의 큰 도서관이 있기 때문에 프로그램의 수정 용이성 또한 LeafJ 플러그인의 장점 http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=tutorial을 : 시작 ). 현재 우리는 Arabidopsis 잎을 테스트하지만, 잎자루 / 잎 블레이드 경계 검출 우리의 알고리즘은 t를 적용 할 수 있습니다O 다른 쌍떡잎 식물은 플러그인의 일부 수정 후 출발합니다.
LeafJ 플러그인을 테스트하는 동안, 우리는 14 오류의 대부분은 이러한 데이터 시트 및 / 또는 식물 genotypes의 mislabeling에 복사 결과를 misplacing 인간 실수에서 나온 발견했다. 드문 경우에 잎자루 / 잎 블레이드 경계는 수동으로 수정을 necessitating 복사 및 붙여 넣기 실수의 추가 위험을 생성, 잘못 불렀습니다. 우리는 임계 값 값을 기준으로 데이터를 () (잎의 길이보다 긴 예 petioles)에보고 한 후 이러한 오류를 감지 할 수 (B) 복제 샘플 조건 (예 : "일"또는 "그늘"), 유전자형, 또는 잎의 위치를 찾아서.
우리의 터치 스크린 태블릿 방법은 측정의 정확성과 속도를 촉진. 우리의 방법의 제한은 주 컴퓨터와 터치 스크린 태블릿 간의 통신은 무선 로컬 영역 네트워크 (LAN)의 속도에 의존합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
그는 글래드스톤 연구소에서 박사 캐서린 폴라드의 실험실에서 안식년에있는 동안 LeafJ는 JNM에 의해 작성되었습니다.
이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (교부금 번호 IOS-0923752)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| far-red light LED | Orbitec | custom made | |
| transparency | IKON | HSCA/5 | |
| scanner | Epson | Epson Perfection V700 PHOTO | |
| Image J | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| LeafJ | custom | http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab | |
| Air Display | Avatron Software Inc. | http://avatron.com/ | |
| iPad2 | Apple Inc. | http://www.apple.com/ |
References
- Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
- Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
- Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
- Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570 (2012).
- Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
- Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157 (2012).
- Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
- Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
- Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82 (2008).
- Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
- Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
- Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
- Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
- Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).
