Summary
В этой статье мы описываем полезный метод для изучения лигандами ионных каналов функции в нейронах остро изолированных кусочков мозга. Этот метод включает в себя использование наркотиков заполненные микропипетки для местного применения препаратов на нейроны, записанные с помощью стандартных методов зажим патч.
Protocol
1. Подготовка решения для мозга Подготовка Slice и электрофизиологии
- Решения для подготовки срезах мозга были описаны 3, 4. Подготовка N-метил-D-глюкамин (NMDG)-основанной резки и восстановления данных следующего состава (в мМ): 93 N-метил-D-глюкамин, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 4 PO, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 глюкозы, 5 Na + аскорбиновая кислота, 2 тиомочевины, 3 Na + пируват, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 • 2H 2 O. Отрегулируйте до 300-310 мосм с NMDG. Отрегулируйте рН до 7.3-7.4 с 10 N HCl.
- Растворите MgSO 4 • 7H 2 O и CaCl 2 • 2H 2 O в Millipore воды, чтобы сделать 2 М растворов каждого из них.
- Взвесить другие компоненты в указанном порядке и добавить в мерную колбу частично заполненный Millipore воды при перемешивании до растворения. Как только все будет добавлен, введитемерную колбу с водой Millipore.
- Измерить рН и корректировать с 10 N HCl.
- Измерьте осмолярности и настроить NMDG если это необходимо.
- Подготовка HEPES проведения искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) следующего состава (в мМ): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 4 PO, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 глюкозы, 5 Na + аскорбиновая кислота, 2 тиомочевины, 3 Na + пируват, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Отрегулируйте до 300-310 мосм с сахарозой. Отрегулируйте рН до 7.3-7.4 с 1 N HCl или NaOH.
- Взвесить компоненты в указанном порядке и добавить в мерную колбу частично заполненный Millipore воды при перемешивании до растворения. Как только все будет добавлен, введите мерную колбу с водой Millipore.
- Измерить рН и корректировать с NaOH или HCl, если необходимо.
- Измерьте и отрегулируйте осмолярности с сахарозой, если необходимо.
- Подготовка стандартной записи ACSF решение следующего состава (в мМ): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 4 PO, 24 NaHCO 3, 12,5 глюкозы, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Отрегулируйте до 300-310 мосм с сахарозой. Отрегулируйте рН до 7.3-7.4 с 1 N HCl или NaOH.
2. Подготовка Острые фрагменты мозга
- Мозг резки срез и восстановление выполняется, как описано ранее 3, 4. Bubble два блюда кристалл заполнен NMDG решение для восстановления с 95% кислорода / 5% CO 2 газ (карбогена), одно блюдо на льду, другая на 33 ° C.
- Bubble одном кристалле блюдо заполнено HEPES проведения ACSF с карбогена при комнатной температуре.
- Anesthetize взрослой мыши (в возрасте от 2 до 12 месяцев) с Na + фенобарбитала (200 мг / кг, внутрибрюшинно). Продолжайте процедуру, когда животное не имеет ответа на ноги-пинча.
- Если необходимо, вырезать образец ткани хвоста для последующего genotypING животного.
- Откройте грудную полость, подвергать сердце, и зажмите нисходящей аорты. Lacerate в правое предсердие.
- Transcardially заливать животных с 5-10 мл 0-4 ° C NMDG-решения для восстановления.
- Обезглавьте животного, удалить мозга и поместить его в 4 ° C NMDG-решения для восстановления в течение 1 мин.
- На льду охлажденной металлической пластины, обрезать мозга в нужной ориентации (корональные, парасагиттальных, горизонтальная и т.д.), включают в сферу интересов.
- Прикрепите блок с мозгом суперклей на сухой поверхности этапе вибрирующий среза (ДСК-Zero 1; Dosaka), погрузить мозг в блоке 4 ° C NMDG-решения для восстановления и постоянно пузыря решение с карбогена.
- Вырежьте кусочки мозга сфере интересов. Толщина среза составляет 200-400 мкм, в зависимости от конкретной области мозга интересов, возраста животных, и эксперимент должны быть выполнены.
- Сразу же после резки, инкубировать желаемого ломтики в carbogenated, 33 ° C NMDG восстановления solutiна ровно на 12 мин, затем переносить их на carbogenated, комнатной температуры HEPES проведение решение для начального периода 60 мин. После этого 60 мин инкубации срезы могут быть использованы для записи. Фрагменты сохраняются в HEPES проведение решение в течение дня, пока они используются для записи.
3. Patch Clamp Запись от нейронов в срезах мозга
- Потяните стандартных микропипетки патч с программируемым Flaming-Brown съемник (Саттер Р-97 или эквивалент вертикального съемник). Пипетки, которые являются оптимальными для гига-ом уплотнения образование, обычно имеют сопротивление 4-6 МОм
- Трансфер один кусочек к записи камеры (RC-27L; Warner Instruments) на этапе прямого микроскопа (Nikon FN-1). Постоянно переливать (1,5 - 2,0 мл / мин) с ломтиком carbogenated, стандартная запись ACSF нагревают и выдерживают при 32 ° C. Кроме того, ломтики можно поддерживать при комнатной температуре.
- Найдите и центр мозга прочих интересных использования10X цель воздуха (Nikon Plan Fluor 10X, NA 0,3; WD: 16 мм).
- Визуализация отдельных нейронов использованием 40X ближней инфракрасной (ИК) погружение в воду цель (APO Nikon 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 мм), подключенный к ИК-дифференциального интерференционного контраста (DIC) Оптика и высокоскоростных инфракрасных устройств с зарядовой связью (CCD) видеокамеры (Hamamatsu C-7500). В ИК-DIC наблюдения, здоровые нейроны обладают гладкие, светло-серый плазматической мембраны.
- Заполните микропипетки с подходящим внутриклеточных решение для записи. Для большинства приложений, мы используем следующие решения (в мм): 135 глюконат калия, 5 EGTA, 0,5 2 CaCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 Mg-АТФ, ГТФ и 0,1 (рН до 7,25 с Tris базы, осмолярность скорректирована до 290 мосм с сахарозой). Создание цельноклеточной запись с визуализировать нейрона.
4. Местное применение лекарственных средств для нейронов в срезах
- Потяните стандартных микропипетки зажим патч как описано выше. Использованиепипетки съемник, таких как Саттер Р-97, который производит два одинаковых "сестра" Советы из того же куска стекла выгодно, когда несколько решений препарата будут использоваться на той же клетке. Совет размеров, что бы сопротивление ~ 5 МОм, если они были наполнены внутриклеточных решения описанных выше оптимальной.
- Засыпка микропипетки с раствором препарата разводят в carbogenated, стандартный ACSF записи. Направьте наконечник вниз, и вылить препарат заполненные микропипетки, чтобы удалить пузырьки воздуха в ловушке в колонке решение.
- Установите наркотиков заполненные микропипетки в пипетку держатель связанных с трубкой подходящей системы выброса давления, такие как Picospritzer III (General Valve Co.) Держатель пипетки должны быть установлены на микроманипулятора с таким же разрешением, как манипуляторы широко используются для исправления записи зажим (например, Sutter MP-285). Кроме того, манипулятор должен позволять диагональное движение в и из среза. Человекually извлечь давление от 3 до 4 раз в микропипетки для того, чтобы создать достаточное давление за колонной жидкости.
- Использование микроманипулятора управления, снизить наркотиков пипетки в срезе при визуализации кончик при ИК-DIC оптики. В идеале, нужно визуально определить и в центре нейрона быть записан с, а затем позиционирования препарата пипетку рядом с ячейкой до снижения записи микропипетки в срез. Позиционирование препарата пипетку может вызвать движение ткани в непосредственной близости от записанной ячейки, которые могут нарушить записи, если препарат пипеткой перемещается в позицию после установления гигаом уплотнения.
- Использование видео IR, позиционировать препарат микропипетки на верхней поверхности ткани срез. Выполнить одну выброса давления и монитор 1) вблизи острия для перемещения мусора, связанные с выбросом и 2) микропипетки совет для любых признаков того, что наконечник засорился или заблокированы. Если кончик заблокирован / забиты, убрать pipettе и заменить его на новый.
- Подойдите к записанной ячейки по диагонали от верхнего среза так, что, когда в конечном положении, кончик наркотиков заполненной пипетки 1) в той же фокальной плоскости (или чуть ниже), записанный клетки и кончик электрода записи , и 2) 10 до 40 мкм от записали клетки. Если препарат заполненной пипетки выше записанного клетки, сила от давления выброса могут нарушить гигаом уплотнения.
- Запись желаемый клеточный ответ, удерживая ячейки в режиме напряжения зажима или текущем режиме зажим. Мы регулярно записывать ацетилхолина и / или никотина вызвала сотовой токи, удерживая нейронов в режиме напряжения зажима. Несмотря на давление выброса может быть вызвано вручную при помощи Picospritzer III, для более воспроизводимых результатов желательно, чтобы вызвать давление выброса использованием системы сбора (Axon Digidata 1440 и pClamp 10,3) с цифровой TTL импульса.
5. Управлениенаркотиков заполненные микропипетки с пьезоэлектрическим переводчик
- Если возможно, установите наркотиков заполненные пипетки держателю одномерный пьезоэлектрических переводчик (например, Piezojena PA-100 или Burleigh ПЗМ-150), который способен принимать аналоговое входное напряжение (опять же, от приобретения системы), которые затем установлен на высокоточные микроманипулятора (Sutter MP-285). Пьезоэлектрические переводчик полезно, потому что движение наркотиков заполненные пипетки в и из среза, в том числе сроков и скорости въезда / выезда, может быть легко контролируется и воспроизводится от эксперимента к эксперименту. При изучении нАХР, десенсибилизирующее воздействие никотина утечки наркотиков заполненной пипетки, если они когда-нибудь произойдет, сводятся к минимуму, когда пипетки только переехали около клетки с пьезоэлектрическими переводчиком на данный момент давление выброса.
- Использование ручного контролируемого потенциометра на пьезоэлектрический усилитель напряжения управления, набрать напряжениядо максимального значения.
- Использование микроманипулятора, должность наркотиков заполненной пипетки в срезе, где пипетка будет извлечь его содержимое на записанную ячейку, и отказаться от пипетки вручную снижении напряжения до нуля на пьезоэлектрический усилитель управления напряжения.
- Используя аналоговый сигнал от системы сбора записи, переместите наркотиков заполненные пипетки в срезе в течение 250 мс от 300 мс до давления выброса TTL импульса происходит. Уберите пипетки в течение 250 мс, начиная с 50 мс после окончания импульса TTL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, представленный в этой статье в целом полезны для изучения лигандами ионных каналов функцию в подготовке среза мозга. Тем не менее, существует ряд факторов, которые существенно влияют на качество и воспроизводимость экспериментальных данных, которые являются результатом использования этого метода. Например, вызванных токами очень чувствительна к диаметр кончика наркотиков заполненной пипетки. Малые советы вызовет трудности с извлечением лекарственный раствор, и большие советы с низким сопротивлением будет больше шансов сорвать гигаом уплотнения между записанной ячейки и записи электрода. Еще одно ограничение метода, изложенного в том, что клетки в течение 10 мкм, внесенные в клетке могут подвергаться воздействию препаратов от наркотиков заполненной пипетки, которые могут повысить их активность и потенциально могут влиять на записанные ячейки.
При применении препарата в клетку несколько раз с той же пипеткой наркотиков, крайне важно, чтобы пипетка быть возвращеныточно такое же положение в срезе для каждого приложения. Даже небольшие отклонения (например, 1-2 мкм) размещения от одного ответа на следующий часто приводит к существенным различиям в наблюдаемый отклик пик. Программируемая пьезоэлектрических переводчик (как описано выше) или роботизированной микроманипулятора выгодно для размещения наркотиками пипетки. Другим ключевым фактором является глубина записанные ячейки в срезе. Наркотиков часто диффундируют от клетки на поверхности среза более быстрыми темпами, в то время как препарат может быть «заперты» внутри слайсов, когда выбрасываются на ячейку, которая находится в глубине среза. Это часто является ключевым фактором при применении никотина, который легко нАХР уменьшает чувствительность при контакте раза длиннее, чем 100-200 мс. Кроме того, давление (PSI), которая выбрасывается в наркотики заполненной пипетки и количество времени, которое давлении (рис. 2) имеют большое значение для интерпретации нАХР текущем дата. Мы обычно используют 10-12 фунтов на квадратный дюйм давления, и мы находим, что 250 мс достаточно времени, чтобы решить токи нАХР пик, не вызывая обширные десенсибилизации рецептора.
Ключевым преимуществом метода мы описываем является возможность обмена наркотиков заполненные пипетки советов, чтобы несколько концентрациях препарат может быть применен к тем же нейроном. Основные соображения при обмене пипетки являются: 1) изменение пипетки место, из одной концентрации в другую, и 2) изменчивость диаметр кончика пипетки. Наконечник местоположение как правило, может быть адекватно управляться с высоким разрешением ближней ИК-видеокамера и точным микроманипулятора. Изменчивость в диаметре кончика пипетки можно управлять с помощью "пипетки сестры" всякий раз, когда это возможно, и с помощью пипетки съемник, который тянет микропипетки с высокой степенью точности и последовательности.
В целом, препарат заполненной пипетки метод, описанный в этой статье, очень полезный подход, когда studyiнг родной нАХР выражается в нейроны находятся в остром кусочки мозга. Помимо того, что полезно для изучения нейробиологии никотиновой зависимости и никотиновой холинергических биологии, этот метод легко применим и к другим лиганд-ионные каналы. 5-HT 3-рецепторов, ГАМК-рецепторы, рецепторы глицина и несколько других "цис-петля" рецепторы, которые могут быть исследованы с помощью этих методов 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (NIH) гранты DA030396. Благодаря членам лаборатории Drenan за полезные обсуждения и критику рукописи. Особая благодарность Ми Ран Ким технической помощи и Джонатан Томас Ting для консультаций по вопросам взрослого кусочки мозга мыши.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
- Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
- Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
- Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
- Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
- Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
- Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neuroscience. 200, 31-41 (2012).
- Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
- Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
- Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
- Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
- Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
- Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
- Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
- Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
- Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
- Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
- Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
- Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
