Summary
Bu yazıda, akut izole beyin dilimleri arasında nöronlarda ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için kullanışlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, standart yama kelepçe teknikler kullanılarak kaydedilmiş nöronlar için ilaçların lokal uygulama için bir ilacın dolu bir mikropipet kullanımını içerir.
Abstract
Tütün kullanımı kanser, kalp hastalığı, amfizem, ve inme gibi birçok sağlık sorunlarına yol açar. Sigara bağımlılığı merkezi sinir sistemi boyunca nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChRs) nikotinin biyofiziksel ve hücresel faaliyetler kaynaklanıyor yaygın bir nöropsikiyatrik bozukluktur. Nikotin bağımlılığı ile ilgili beyin bölgelerinde mevcut çeşitli nAChR alt anlamak önemli bir önceliktir.
Bu tür bütün-hücre yama klempi veya iki elektrotlu voltaj kelepçesi elektrofizyolojik kayıtları gibi teknikleri kullanan deneyler ilgi nAChRs farmakolojik karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tür memeli doku kültürü hücreleri veya Xenopus laevis oosit olarak Hücreler ifade nAChRs, fiziksel olarak izole edilir ve bu nedenle kolayca modern farmakoloji araçları kullanılarak incelenmiştir. Hedef reseptör zaten bilinen, özellikle çok gelişme, bu teknikler kullanılarak yapılmış birnd ektopik ifade kolayca elde edildi. Akut laboratuar fareleri ya da sıçanlar hasat beyin kesitleri içinde nöronlarda: Ancak, çoğu zaman kendi doğal ortamında nAChRs incelemek için gereklidir. Örneğin, bu tür fareler α4 L9'A fareler 1 ve α6 L9, 2'S fareler gibi "duyarlı" nAChR alt üniteleri ifade eden, spesifik nAChR alt birim olan fonksiyonel ekspresyonu esas nöronların kesin tanımlanması için izin verir. Beyin dilimleri içerisinde nöronlardan gelen tüm-hücre yama klemp kayıtları rutin yetenekli elektrofizyolog tarafından yapılmasına rağmen, yerel olarak böyle asetilkolin veya bir beyin dilim içinde kaydedilen hücreye nikotin gibi ilaçların uygulamak zordur. Superfusate içine ilaçların seyreltilmesi (banyo uygulaması) hızla geri dönüşü yoktur, ve U-tüp sistemleri kolayca beyin dilimleri ile çalışmak için adapte değildir.
Bu yazıda, hızla yetişkin m Kaydedilen nöronlar nAChR-aktive edici ilaçları uygulamak için kullanılan bir yöntem tarifbeyin dilimleri Ouse. Standart tam hücre kayıtları dilimleri nöronların yapılır ve ilgi bir ilaç ile dolu ikinci bir mikropipet kaydedilen hücrenin yakınında pozisyon içine manevra edilir. Ilaç ile dolu pipet içine basınçlı hava, nitrojen veya inert bir enjeksiyon kaydedilmiş hücrenin üzerine pipetle çıkartılabilmesi için ilaç solüsyon bir miktar neden olur. Bu yöntemi kullanarak, nAChR-aracılı akımları milisaniyelik doğrulukla çözülecek edebiliyoruz. İlaç uygulama zamanları kolayca değiştirilebilir ve uyuşturucu dolu bir pipet konsantrasyon-cevap eğrileri tek bir nöron için oluşturulmuş olması için izin veren yeni bir pipet yardımıyla çekilerek değiştirilebilir. NAChR nörobiyolojide bağlamında tarif olmasına rağmen, bu yöntem beyin kesitleri nöronları içinde ligand-kapılı iyon kanalları ya da reseptörleri birçok türleri çalışmak için yararlı olacaktır.
Protocol
1. Beyin Dilim Hazırlama ve Elektrofizyoloji için çözümler hazırlanması
- Beyin kesitleri hazırlanması için çözümler daha önce 3, 4 tarif edilmiştir. 93. N-metil D-glukamin, 2,5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25: N-metil D-glukamin (NMDG)-tabanlı olarak aşağıdaki bileşime sahip bir kesme ve geri kazanım solüsyonu (mM cinsinden) hazırlanması glikoz, 5 Na + askorbat, 2 tioüre, 3 Na + piruvat, 10 MgSO4 • 7H 2 O, 0.5 CaCl2 • 2H 2 O. NMDG ile 300-310 mOsm ayarlayın. 10 N HCI ile 7,3-7,4 pH ayarlayın.
- Her 2 M stok çözeltiler için Millipore suda MgSO4 • 7H 2 O ve CaCl2 • 2H 2 O çözülür.
- Listelenen sırayla diğer bileşenleri tartılır ve çözülmekte isida Millipore su ile kısmen dolu bir ölçülü balona ekleyin. Her eklendikten sonra, dolguMillipore su ile ölçülü balonda.
- PH ölçün ve 10 N HCI ile ayarlayın.
- Osmolarite ölçün ve gerekirse NMDG ile ayarlayın.
- 92 NaCl, 2,5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 glikoz, 5 Na + askorbat, 2 tioüre, 3 Na: aşağıdaki kompozisyonun yapay serebrospinal akışkan (aCSF) (mM), HEPES tutma hazırlanması + piruvat, 2 MgSO4 • 7H 2 O, 2 CaCl2 • 2H 2 O Sukroz ile 300-310 mOsm ayarlayın. HC1 veya NaOH ile pH'ı 7,3-7,4 için ayarlayın.
- Listelenen sırayla bileşenleri tartılır ve çözülmekte isida Millipore su ile kısmen dolu bir ölçülü balona ekleyin. Her şeyi bir kez eklendiğinde, Millipore su ile ölçülü balona doldurun.
- PH ölçün ve gerekirse NaOH veya HCl ile ayarlayın.
- Osmolarite ölçün ve sukroz Gerekirse ayarlayın.
- 124 NaCl, 2,5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12.5 glikoz, 2 MgSO4 • 2 7H O, 2. CaCl2 • 2H 2 O.: Aşağıdaki bileşim standart aCSF kayıt solüsyonu (mM cinsinden) hazırlanması Sukroz ile 300-310 mOsm ayarlayın. HC1 veya NaOH ile pH'ı 7,3-7,4 için ayarlayın.
2. Akut Beyin Dilimleri hazırlanması
- Daha önce 3, 4 tarif edildiği gibi beyin dilim kesme ve geri kazanım yapılır. Kabarcık iki kristal yemekleri% 95 oksijen /% 5 CO 2 gazı (carbogen), buz üzerinde bir tabak, 33 de diğer ° C ile kurtarma çözümü NMDG dolu
- Kabarcık bir kristal çanak oda sıcaklığında carbogen ile aCSF tutma HEPES ile doldurulur.
- Na + pentobarbital (200 mg / kg, ip) ile erişkin fare (2 ile 12 ay arası) uyuştur. Hayvan ayak tutam hiçbir yanıt olduğunda prosedürü ile devam edin.
- Gerekirse, daha sonra genotip için bir kuyruk doku örneği kestihayvan ing.
- Göğüs boşluğu açın, kalp maruz ve inen aorta klemp. Sağ atrium yaralamak.
- Transkardiyal 0-4 ° C NMDG-kurtarma çözümü ile 5-10 ml hayvan serpmek.
- Hayvan başını kesmek, beyin çıkarın ve 1 dakika süreyle 4 ° C NMDG-kurtarma çözümü yerleştirin.
- Bir buz soğuk metal plaka üzerinde, ilgi alanına dahil etmek istediğiniz yönü (vb, yatay, parasagital, koronal) beyinde kırpın.
- Eke titreşen bir dilimleyici ve kuru aşamasında yüzeye yapıştırıcı ile beyin blok (DSK-Zero 1; Dosaka), 4 daldırın beyin blok carbogen ile ° C NMDG-kurtarma çözümü ve sürekli kabarcık çözüm.
- İlgi beyin bölgesinin dilimleri kesin. Dilim kalınlık özel bir ilgi alanı beyin, hayvan yaş, gerçekleştirilmesi için deney bağlı olarak 200-400 mikron.
- Hemen kesim sonrası içinde inkübe istenen dilim, 33 carbogenated ° C NMDG-kurtarma solutitam 12 dakika boyunca, daha sonra 60 dakikalık bir başlangıç dönemi için tutma carbogenated çözelti, oda sıcaklığında HEPES transfer. Bu 60 dakika inkübasyondan sonra, dilimler kayıt için de kullanılabilir. Dilimler bu kayıt için kullanılana kadar gün boyunca çözelti tutma HEPES içinde muhafaza edilir.
3. Beyin Dilimleri nöronlar Patch Clamp Kaydı
- Bir programlanabilir Flaming-Kahverengi çektirmesi (Sutter P-97 veya eşdeğeri dikey çektirme) ile standart yama mikropipet çekin. Giga-ohm mühür oluşumu için optimum olan Pipetler genellikle MΩ 4-6 bir dirence sahiptir
- Dik mikroskop (Nikon FN-1) sahnede; kayıt odasına (Warner Instruments RC-27L) bir dilim aktarın. Sürekli superfuse (1.5 - 2.0 ml / dk) 32 ısıtıldı ve muhafaza carbogenated, standart kayıt aCSF ile dilim ° C. Alternatif olarak, dilimler oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
- Kullanılarak ilgi beyin alan bulmak ve orta10X bir hava hedefi (Nikon Planı Fluor 10X, NA 0.3, WD: 16 mm).
- 40X yakın kızılötesi (IR) su immersiyon objektif (;: 0.80; WD: NA Nikon APO 40XW 3,5 mm) kullanarak tek tek nöronların görselleştirin yakın kızılötesi IR-diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik ve yüksek hızda bağlı birleştiğinde cihazı şarj (CCD) video kamera (Hamamatsu C-7500). IR-DIC gözlem altında, sağlıklı nöronların düzgün, açık gri plazma zarı sergilerler.
- Uygun bir hücre içi kayıt solüsyonu ile bir mikropipet doldurun. 135 Potasyum glukonat, 5 EGTA, 0.5 CaCl 2, 2 MgCl2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP ve 0,1 GTP (pH Tris baz, osmolarite ile 7,25 ayarlanabilir: Çoğu uygulama için, aşağıdaki çözüm (mM) kullanın 290 mOsm sakaroz ile) 'e ayarlanmıştır. Bir görüntülenmiştir nöron bir tam hücreli kayıt oluşturulması.
4. Dilimler nöronlar için Uyuşturucu Yerel Uygulama
- Yukarıda tarif edildiği gibi, bir standart yama kelepçe mikropipet çekin. Kullanmaçoklu ilaç solüsyonları aynı hücre üzerinde kullanılmak üzere bu tür cam aynı parça iki özdeş "kardeş" uç üreten bir Sutter P-97 gibi bir pipet çekici avantajlıdır. Bunlar yukarıda tarif edilen hücre içi solüsyon ile dolduruldu eğer MΩ ila 5 arasında bir dirence sahip olacak meme çapları optimaldir.
- Carbogenated, standart kayıt aCSF içinde sulandırılmış ilaç içeren bir çözelti ile Dolgu mikropipet. Aşağı ucu gelin ve çözüm sütununda sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için uyuşturucu dolu mikropipet fiske.
- Böyle bir Picospritzer III (Genel Vana Co) gibi uygun bir basınç tahliye sistemine boru ile bağlanan bir pipet tutucu içinde ilaç ile dolu mikropipet monte edin. Manipülatör yaygın olarak (örneğin, Sutter MP-285) yama kelepçe kayıt için kullanılan pipet tutucu aynı çözünürlüğe sahip bir micromanipulator üzerine monte edilmelidir. Buna ek olarak, manipülatör içine ve dışına dilim çapraz hareket için izin vermelidir. Manmanuel bir sıvı kolon arkasında yeterli basınç oluşturmak için mikropipet içine basınç 3-4 kez çıkarır.
- IR-DIC optik altında ucu görselleştirme ederken mikromanipülatör denetimlerini kullanarak, dilim içine ilaç pipet indirin. İdeal olarak, bir görsel olarak belirlemek ve merkez önce dilim içine kayıt mikropipet düşürülmesi için hücre yakın ilaç pipet konumlandırılması ardından gelen kaydedilmiş bir nöron için, olmalıdır. Ilaç pipet konumlandırılması ilaç pipet gigaohm bir mühür oluşturmak sonra konuma getirilir, kayıt bozabilir kaydedilmiş hücrenin çevresinde doku hareket etmesine neden olabilir.
- IR video kullanılarak, doku dilim üst yüzeyinde ilaç mikropipet yerleştirin. Bir basınç ejeksiyon ve monitör 1) ejeksiyon ilgili enkaz hareketi için ucu çevresinde ve ucu tıkanmış veya bloke olduğuna dair herhangi bir işaret için 2) mikropipet ucu yürütün. Uç bloke / tıkanır ise, geri çekme pipette ve yenisi ile değiştirin.
- Bu tür dilim üstünden çapraz olarak kaydedilmiş hücrenin yaklaşıma göre, son konumda, ilaç ile dolu bir pipet ucu kaydedilen hücre ve kayıt elektrot ucu ile aynı odak düzlemi (ya da biraz altında) olarak) 1 iken ve 2) kaydedilmiş hücrenin 10-40 um. Ilaç ile dolu bir pipet ucu kaydedilmiş hücrenin üzerine ise, basınç dışarı çıkmasıyla kuvvet gigaohm mühür bozabilir.
- Gerilim kelepçe modu veya akım pensi modunda hücre tutarken istenilen hücresel yanıt kaydedin. Biz rutin asetilkolin kayıt ve / veya gerilim kelepçe modunda nöronlar tutarak cep akımları nikotin ortaya çıkardı. Bir Picospritzer III kullanırken basınç ejeksiyon elle tetiklenebilir rağmen, daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar için dijital TTL darbe ile toplama sistemi (Akson Digidata 1440 ve pClamp 10.3) kullanılarak basınç ejeksiyon tetiklemek için tavsiye edilir.
5. DenetlemeBir Piezoelektrik Translator ile İlaç dolu Mikropipet
- Eğer mümkünse, bir tek-boyutlu piezoelektrik çevirmen uyuşturucu dolu pipet tutucu monte (örn. Piezojena PA-100 veya Burleigh PZM-150) sonra bir analog voltaj girişi (yine, edinim sistemi), kabul edebilir yüksek hassasiyetli mikromanipülatör (Sutter MP-285) üzerine monte. Uyuşturucu dolu pipet hareketin içine ve giriş / çıkış zamanlaması ve hızı gibi dilim, üzerinden daha kolay kontrol ve deneyden deneye yeniden olabilir çünkü piezoelektrik çevirmen yararlıdır. Pipet sadece basınç ejeksiyon an için bir piezoelektrik çevirmen ile hücre yakınında taşındığında nAChRs öğrenim görürken, uyuşturucu dolu pipetle nikotin kaçak desensitizan etkileri, onlar hiç gerçekleşmesi gerektiğini, minimize edilir.
- Piezoelektrik voltaj kontrolü amplifikatörü elle kontrollü potansiyometre kullanarak, gerilim çevirmekmaksimal değeri.
- Mikromanipülatör, pozisyon pipet Kaydedilen hücrenin üzerine içeriğini çıkarın ve elle piezoelektrik voltaj kontrolü amplifikatörü sıfır gerilimini düşürerek pipet çekilecektir dilim uyuşturucu dolu pipet kullanarak.
- Kayıt toplama sistemi olan bir analog çıkış sinyali kullanılarak, 250 basınç tahliye TTL nabız msan meydana gelmeden önce 300 milisaniye başlayan bir süre boyunca kesit içine ilaç ile dolu pipet hareket eder. TTL puls sona erdikten sonra 50 msn başlayarak, 250 milisaniye boyunca pipet geri çekin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneylerde, rutin dopamin (DA) üreten ventral tegmental alan (VTA) ve substantia nigra pars compactadaki (SNC) nöronlardan kaydedebilirsiniz. Voltaj-clamp modunda, asetilkolin veya bu hücrelere nikotin basınç uygulama tipik olarak 100-200 ms (Şekil 1A-B) dahilinde zirveye ulaştığı bir hızlı, içe doğru katyon akım neden olur. Mevcut bozulması büyük ölçüde etki bölgesinden ilacın difüzyon tarafından dikte edilir ve dilim enzimler mevcut olup olmadığı, bir inaktif biçim içine ilaç metabolize. Örneğin, ACh DA nöronlar 5 açısından zengin olan beyin bölgelerinde hücrelerin yüzeyi üzerinde bulunması acetylcholinesterases ile hızla hidrolize edilir. Uyarılmış akımı (Şekil 1A) hızlı bir şekilde çürüme ile sonuçlanır. Buna karşılık, nikotin hidrolize ve nikotin-uyarılmış akımları hızla kuvvetle Activ sağlar akımlar (Şekil 1B), ACh uyarılmış olarak çürümez değildiryedik ve nAChRs 6 duyarsızlaştırmak.
Basınç çıkarma sistemleri operatör basınç darbesi esnasında farklı izin verir. Bu araştırmacı maksimum uyarılmış akım, ilacın bir darbe yanıt olarak elde edilmiş olup olmadığını saptamak için izin verir, bu özellik, beyin kesitleri içinde nöronların yüzeyi üzerinde nAChRs okuyan yararlıdır. Örneğin, ilaç uygulama 250 msn (gri iz) açığa olmayabilir veya Şekil 2 gösterisinde iki izlerini kesin maksimum uyarılma ilaç uygulaması 1000 msn (siyah iz) akımı açık bir maksimum artı bazı istikrarlı verimleri ise, mevcut -devlet duyarsızlaştırma. Doğru bir konsantrasyon-cevap eğrisi, veya nAChR duyarsızlaştırma okuyan oluşturarak zaman bu tür "zirve" akımların çözülmesi önemlidir.
Akut beyin dilimleri 7, 8 içinde kaydederken ventral orta beyindeki DA nöronlar genellikle spontan aksiyon potansiyelleri ateş. α6 L9'S fareler, hangi ex, nikotin ACh ya da 2, 9-11 ve 10 ila 100 kat daha az yoğunlukta güçlü bir şekilde tepki nAChRs basın nikotin enjeksiyon tepki olarak artan hareket sergiler. Davranışı ile nöronal aktivite (aksiyon potansiyeli ateşlemesini) korelasyon için, akım-klemp modunda kaydedilmiş α6 L9'S DA nöronlarının nikotin uygulamak yararlıdır. Tipik olarak, α6 L9 Da nöronlar için nikotin lokal uygulama (1 uM) 30-40 sn 2 (Şekil 3, üst panel) içinde başlangıç noktasına geri bozunmaları ki ateşleme hızlı bir şekilde ve geçici hızlanma neden olur. Nikotin Bu tür tepkiler uygun analiz yazılımı (Moleküler Cihazlar Corp örneğin pClamp) ile (Şekil 3, alt panel) kolayca ölçülebilir vardır.
Ektopik olarak ifade nAChRs ile kültür hücreleri veya Xenopus oositlerinde deneyler ilaç konsantrasyonlarının her biri bir dizi kayıtlı hücre 12 için uygulanabilir olduğu avantaj sahiptir. Içindebeyin kesitleri içinde nöronlar, tipik olarak bir konsantrasyon-tepki eğrisi mümkün değildir, ve ilaç tek bir konsantrasyon tepkiler genellikle 1 rapor edilmektedir. Bununla birlikte, bu yazıda tarif edildiği gibi bir ilaç ile dolu bir pipet art arda beyin dilim 2, 8, 13, 14 içinde aynı kaydedilmiş hücrenin uygulanacak olan ilaç birden fazla konsantrasyonları sağlamak için değiştirilebilir. Şekil 4, bir ikinci temsil eden verileri gösterir ACh üç konsantrasyonları ile uyarıldı single kaydetti DA nöron. Uyuşturucu dolu pipet tutan son derece stabil mikromanipülatör ile birlikte araştırmacı Deneyimi, bu tür denemelerde başarı yol açan kritik faktörlerdir. Başarılı olduğunda, bu yaklaşımın doğal nAChRs hakkında değerli farmakolojik bilgiler sağlar.
Uncharacterized hücre tipleri veya heterojen bir nüfusa sahip beyin bölgelerinde bulunanların da dahil olmak üzere beyin dilimleri, nöronlar genellikle çeşitli temel elemanlar kullanılarak sınıflandırılırctrophysiological ve / veya morfolojik önlemler 15. Örneğin, ben h mevcut, istirahat membran potansiyeli, kendiliğinden ateşleme hızı ve hücre boyutunu ifade DA nöronlarının 2, 7, 8, 16, 17 karakterize etmek için kullanılan tipik önlemlerdir. Bizim yöntem kullanılarak, lokal olarak uygulanabilir ya da nikotin ACh 18, 19 karşı tepki göre nöronlar karakterize etmek de mümkündür. Örneğin, üst kollikulus (SC) α6 20 alt üniteleri içerenler de dahil olmak üzere çeşitli nAChRs, son derece yüksek bir ifade ile, bir heterojen ve nispeten uncharacterized beyin alandır. Α6 L9'S farelerin beyin dilimleri, biz birkaç SC nöronlar ve nikotin dolu pipet ile basınçlı ejeksiyon kullanılarak uygulanan nikotin (1 uM) kaydedildi. İki ayrı yanıt türleri gözlenmiştir: 1) inhibitör postsinaptik akımlar aktivasyonu (IPSCs) (Şekil 5, ben cevapları yazın) ve bazı inducti 2) Büyük içe katyon akımlarıeksitatör postsinaptik akımlar üzerine (EPSCs) (Şekil 5, Tip II yanıtları).
Bir piezoelektrik çevirmen kullanımı hızla basınç çıkarma için hücre bitişik taşınan kadar ilaç ile dolu bir pipet, en az 100 um uzağa kaydedilmiş hücrenin dan sabit bir konumda tutulabilir ki avantaj sağlamaktadır. Bu pipet hareket otomatize edilebilir, çünkü yararlıdır ve hücreden hücreye ve gün gün için uygundur. Şimdiye kadar meydana gerektiği bu ilaç dolu pipetle nikotin kaçak etkisini en aza indirir gibi, nikotin yüksek konsantrasyonlarda (nAChRs duyarsızlaştırmak olan) Kaydedilen Hücreye uygulanan zaman da yararlıdır. Bir piezoelektrik Çevirmen kullanırken nAChR akımların tutarlılık göstermek için, biz α6 L9'S farelerin beyin dilimleri içinde VTA DA nöronlarının kaydedildi. Şekil 6. Aynı α6 L9'S VTA DA nöron ardışık tepkilerini gösterir n konsantrasyonlarına yanıt olarakşiddetle hipersensitif α6 * nAChRs (:;: Şekil 6B 10 uM Şekil 6A 1 uM) aktive icotine. Sürekli olarak kaydedilmiş hücrenin üzerine akmasına izin verilirse, nikotin, bu konsantrasyonlar, hücre yüzeyi üzerinde nAChRs duyarsızlaştırmak için beklenir, ve ikinci cevabın birinci yanıt için göreli olarak zayıflatılmış olur.
Şekil 1. DA nöronlarının Temsilcisi nAChR yanıtları. A. Bir WT fare beyin dilim A DA nöron voltajını ikinci bir ilaç dolu pipet kullanarak basınçlı ejeksiyon (250 msn) ile ACh (100 uM) yerel uygulama tarafından takip kelepçeli idi. Ölçek çubuğu: 100 pA, 3 sn B.. A içinde tarif edildiği gibi Deney DA nöron uygulanmıştır ki nikotin (100 uM) dışında yapıldı. Ölçek çubuğu: 60 pA, 3 sn.
Şekil 2. Değişen ilaç uygulama zaman pik akımları çözümleniyor. Bir WT fare beyin dilim A DA nöron gerilim ACh (100 uM) yerel uygulama tarafından takip kelepçeli idi. İki yanıtları ACh 250 msn (gri iz) veya 1000 milisaniye (siyah iz) için uyuşturucu dolu pipetle çıkartıldığı aynı kaydedilen hücre için gösterilir. Ölçek çubuğu: 50 pA.
Şekil 3. Lokal ilaç uygulaması sonrasında ateş aksiyon potansiyeli incelenmesi. Bir α6 L9'S fare beyin dilim A DA nöron akım pensi (I = 0) modu, spontan aksiyon potansiyelleri gözlendi kaydedildi. Nikotin (1 uM) basınç ejeksiyon (250 msn) kullanılarak uygulanan ve hızı ve istirahat membran potansiyeli ateş aksiyon potansiyeli değişiklikleri idigözlenmiştir. PClamp yazılımı (eşik ara) kullanarak, ani ateşleme hızı elde edildi ve alt panel gösterilmiştir.
Şekil 4. Aynı kaydedilen hücreye Çoklu ilaç uygulamaları. Bir α6 L9'S fare beyin dilim A DA nöron gerilim kelepçe modunda kaydedilmiş. Bir ilaç ile dolu pipet lokal olarak ACh (; 250 msn 1 uM) uygulamak için kullanıldı. Hücre kayıt yapmak devam ederken, ilaç ile dolu bir pipet dilim çekilir ve 3 uM ACh ile dolu bir pipet ile değiştirildi. 3 uM ACh için bir yanıt kaydedildi ve işlem 10 uM ACh için tekrar tekrar edilmiştir. Ölçek çubuğu: 100 pA, 1,5 sn.
Şekil 5. NAChR yanıt tipine göre nöronlar sınıflandırılması.Bir α6 L9 fare beyin kesit olarak daha üstün kollikulus (SC) bir grup nöron gerilim basınç püskürtme yolu ile nikotin, lokal uygulama (1 uM) ve ardından, monte edilmiş edildi. Tip I nöron nikotin uygulamasını takiben artan IPSCs sergiledi. Tip II nöronlar nikotin uygulaması cevap olarak içe doğru büyük akımları ve artan EPSCs sergiledi. Ölçek çubuğu: 20 pA, 3 sn.
Şekil 6. Piezoelektrik tercümecisi tutarlılığı sunar ve uyuşturucu kaçak korur. A. Bir α6 L9'S fare bir beyin dilim bir VTA DA nöron 1 uM nikotin uygulaması sırasında gerilim kelepçe modunda kaydedilmiş. Nikotin dolu pipet basıncı ejeksiyon önce son pozisyon içine manevra ve piezoelektrik çevirmen kullanarak fırlatmadan sonra geri çekildi. Ikinci bir cevap fi sonra 2 dk kaydedildiHiçbir nAChR duyarsızlaştırma meydana geldiğini göstermek için rst. Ölçek çubuğu: 100 pA, 8 sn B.. α6 L9'S VTA DA nöronlarda nAChR tepkiler A olarak kaydedildi, ama 10 uM nikotin uygulandı. Ölçek çubuğu: 100 pA, 8 sn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada sunulan yöntem, beyin dilim hazırlıkları ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için geniş yararlıdır. Bununla birlikte, önemli ölçüde deneysel veriler, bu yöntemi kullanarak gelen nihai ürünün kalitesi ve yeniden üretilebilirlik etkileyecek bir dizi faktör vardır. Örneğin, uyarılmış akımları ilaç ile dolu bir pipet ucu çapına karşı çok duyarlıdır. Küçük ipuçları ilaç solüsyonu ve düşük direnç ile büyük ipuçları kaydedilen hücre ve kayıt elektrot arasındaki gigaohm mühür bozma olasılığı artacaktır çıkarırken zorluk neden olur. Sunulan yöntemin bir diğer sınırlama olduğu kaydedildi hücrenin 10 mikron olan hücrelerin aktivitesini artırabilir ve potansiyel kaydedilen hücre etkileyebilecek ilaç dolu pipet, uyuşturucu maruz kalabilirsiniz olduğunu.
Aynı ilaç pipet ile bir hücre için birden çok kez ilaç uygularken, pipet iade edilmesi önemlidirher uygulama için dilim tam aynı konumda. Sonraki bir yerleştirme karşılık gelen küçük sapmalar bile (örneğin, 1-2 um) sık sık görülen zirve yanıt olarak önemli farklılıklar neden olur. Programlanabilir bir piezoelektrik çeviricisi (yukarıda açıklandığı gibi) ya da robot mikromanipülatör ilaç pipet konumlandırılması için avantajlıdır. Başka bir anahtar dikkate dilimi içinde kaydedilen hücre derinliğidir. İlaç genellikle daha hızlı dilimin yüzeyi üzerinde bir hücre uzak dağılacaktır, dilim içinde derin bulunduğu bir hücre üzerine püskürtülen zaman ilaç dilimi içinde "tuzak" olabilir oysa. Pozlama süreleri 100-200 milisaniye daha uzun olduğunda kolayca nAChRs duyarsızlaştırır nikotin, uygularken bu genellikle önemli bir husustur. Benzer şekilde, uyuşturucu dolu pipet ve basınç uygulandığında olduğu süreyi (Şekil 2) içine atılır basıncı (psi) nAChR akımı da yorumlamak için önemli faktörlerdirta. Biz rutin basıncı 10-12 psi kullanıyoruz ve 250 msn kapsamlı reseptör desensitizasyonu yaratmadan nAChR pik akımları gidermek için yeterli zaman olduğunu bulmak.
Bizim tarif yöntemin önemli bir avantajı, birçok ilaç konsantrasyonları aynı nöron uygulanabilir, böylece değiş tokuş ilaç ile dolu pipet uçları yeteneğidir. Anahtar hususlar alışverişi pipetler) pipet ucu çapı pipet sonraki bir konsantrasyon sağladığı konum, ve 2) değişkenliği varyasyon 1 olduğunda. Pipet ucu konumu genellikle yeterince yüksek çözünürlüklü yakın-IR video kamera ve hassas mikromanipülatör ile kontrol edilebilir. Pipet ucu çapı Değişkenlik mümkün, ve doğruluk ve tutarlılık yüksek derecede mikropipetler çeker bir pipet çektirmesi ile "kardeş pipetler" kullanılarak kontrol edilebilir.
Genel olarak, bu yazıda anlatılan ilacın dolu bir pipet yöntem çok yararlı bir yaklaşım olduğu zaman studying yerli nAChRs akut beyin dilimleri bulunan nöronlar ifade. Nikotin bağımlılığı ve nikotinik kolinerjik biyoloji nörobiyolojisinin incelemek için yararlı olmanın yanı sıra, bu yöntem, diğer ligand-kapılı iyon kanalı ile kolaylıkla uygulanabilir. 5-HT 3 reseptörlerinin, GABA A reseptörleri ve glisin reseptörleri bu teknikleri 21 kullanılarak incelenebilir diğer "CYS-loop" reseptörlerin çeşitli vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe DA030396 tarafından desteklenmiştir. Yararlı tartışma ve yazının eleştirisi için Drenan laboratuar üyeleri sayesinde. Mi Özel sayesinde erişkin fare beyin dilimleri ile ilgili tavsiyeler için teknik yardım ve Jonathan Thomas Ting için Kim Ran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| Na+ ascorbate | Sigma | A4034 | |
| thiourea | Sigma | T8656 | |
| Na+ pyruvate | Sigma | P2256 | |
| MgSO4∙7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2∙2H20 | Sigma | 223506 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 | |
| potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | ||
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | ||
| RC-27 Recording chamber | Warner | ||
| TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 | |
| SH-27B Solution heater | Warner | 640102 | |
| Nikon FN-1 | Nikon | ||
| C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | ||
| Picospritzer III | General Valve Co. | ||
| MP-285 Micromanipulator | Sutter | ||
| PA-100 Piez–lectric translator | piezosystem jena, Inc. | ||
| 12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |
References
- Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
- Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
- Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
- Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
- Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
- Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
- Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
- Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neuroscience. 200, 31-41 (2012).
- Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
- Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
- Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
- Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
- Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
- Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
- Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
- Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
- Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
- Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
- Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
- Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. , (2011).
