Summary
En fremgangsmåde til hurtigt og fuldstændigt fjerne cellulære bestanddele fra en intakt porcin hjerte via retrograd perfusion beskrives. Denne metode giver en stedsspecifik hjerte ekstracellulær matrix stillads, der har potentiale til brug i flere kliniske anvendelser.
Abstract
Perfusion baseret helt organ decellularization har for nylig fået interesse inden for tissue engineering som et middel til at skabe stedspecifikke ekstracellulære matrix scaffolds, mens de stort set bevarer den native struktur af stilladset. Til dato er denne fremgangsmåde blevet anvendt i en række forskellige organsystemer, herunder hjerte, lunge og lever 1-5. Tidligere decellularization metoder for væv uden en let tilgængelig vaskulære netværk har påberåbt langvarig udsættelse af væv til opløsninger af vaske-og rengøringsmidler, syrer eller enzymatiske behandlinger som et middel til at fjerne de cellulære og nukleare komponenter fra det omgivende ekstracellulære miljø 6-8. Imidlertid effektiviteten af disse metoder hængslet af evnen af opløsningerne gennemtrænger vævet ved diffusion. I modsætning hertil effektivt perfusion af organer gennem naturlige vaskulære system reducerede diffusionsafstanden og lettet transport af decellularizatipå midler ind i vævet og cellulære komponenter ud af vævet. Heri, beskriver vi en fremgangsmåde til fuldt decellularize et intakt porcin hjerte gennem koronar retrograd perfusion. Protokollen gav et fuldt decellulariseret hjerte ekstracellulære matrix (c-ECM) stillads med den tredimensionale struktur af hjertet intakt. Vores metode en række enzymer, detergenter og syrer kombineret med hypertoniske og hypotonisk skylninger for at hjælpe med lysering og fjernelse af celler. Protokollen anvendt en trypsinopløsning at frigøre celler fra matrixen efterfulgt af Triton X-100 og natriumdeoxycholat opløsninger til hjælp ved fjernelse af cellemateriale. Den beskrevne protokol anvender også perfusion hastigheder på over 2 L / min i længere tid. Den høje strømningshastighed, kombineret med opløsning ændres tilladt transport af midler til vævet uden forurening af cellerester og sikret en effektiv skylning af vævet. Den beskrevne metode fjernede alt nukleart materiale fra Native porcint hjertevæv, hvilket skaber en stedspecifik hjerte ECM stillads, der kan anvendes til en lang række applikationer.
Protocol
1. Tissue Forberedelse og Opsætning af forsøg
- Harvest svin orgel umiddelbart efter eutanasi fra et slagteri eller forskningsanlæg og skylles overskydende blod. Trim hjertet af overskydende fedt og væv, holde forkamre og aorta intakt. Fraklippe fedtstof at adskille lungepulsåren fra aorta. Hvis der er nogen nedskæringer i vævet, kasseres korrekt.
- Wrap hver hjertet individuelt i fryseren papir og gemme alle væv i en -80 ° C fryser i mindst 24 timer for at sikre fuldstændig frysning.
- Når de er klar til brug (normalt mindre end 3 måneder), tø én intakt frossen ornesæd hjerte i Type 1 vand natten nedsænket i en 4 L bægerglas ved 4 ° C.
- Efter at hjertet er helt optøet, klappe hjertet tørre, vejer hjertet, og massen noteres. Hjertet i et marked vægt gris bør veje ca 375-450 gram.
- Slut størrelse 18 Masterflex slange til ¼ "enden af en pigtråd reducer. Sæt pigtråd reduktionsgear ogrør inden i aorta. Placer 2 slangeklemmer eller sikre zip bånd rundt om aorta, lige under brachiocephalic bagagerum. Reduktionsmidlet og slangen skal forblive over aortaklappen, så kranspulsårerne kan perfunderes (fig. 1).
- Anvend en 30 eller 60 ml sprøjte til at fylde slangen med type I vand. Sæt slangen inde i patronen i en Masterflex valsepumpe ved sin omtrentlige midtpunkt. Nedsænkes indstrømning ende af røret i bunden af et 4 liters bægerglas fyldt med 2,5 l vand og sikre slangen.
- Placer hjertet i bægeret fyldt med vand, og prime pumpen for at fjerne luftbobler. Hvis bobler observeres kommer fra aorta, hvor slangen er indsat, kan aorta skal omplaceres eller fastgøres med yderligere forbindelser. En lufttæt forsegling er vigtigt at opretholde tilstrækkeligt tryk under decellularization proces (figur 2).
- Anbring 4 L bægerglas, der indeholder 3 liter af en 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 løsning på røre plade og varme den til 37 ° C i forberedelsen af decellularization processen.
2. Væv Skylning
- Indstille pumpen til en strømningshastighed på 400 ml / min, således at den korrekte slange størrelse vælges. Skyl hjertet med type I vand i 15-25 min. Da pumpen startes, bør hjertet kvælde og effuse blod fra ventriklerne. Frisk opløsning bør erstattes hver 5-10 min, eller efter behov på basis af mængden af blod fjernet fra hjertet. Hvis blodet ikke effused fra hjertet, justere røret og klemmer om nødvendigt.
- Stop pumpen og overføre hjertet til et separat bægerglas fyldt med 2X phosphatbufret saltvand (PBS). Efter at røret er nedsænket i opløsning, begynder pumpen og forøge strømningshastigheden til 700 ml / min. Hjertet bør forblive i opløsningen i 15 minutter, ændrer opløsningen hver 5 min. Hver løsning ændring kræver, at pumpen skal stoppes midlertidigt, mens vævet og slangen er flyttettil det nye bæger.
- Overfør hjertet til type I vand i 10 minutter og forøge strømningshastigheden til 750 ml / min.
3. Decellularization og Solution Perfusion
- Overfør hjertet til bægerglasset indeholdende 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 ved 37 ° C. Øge pumpehastigheden til 1.200 ml / min og starte pumpen. Anvende en omrører placeret i bunden af bægerglasset til at cirkulere opløsning i bægerglasset. Hjertet bør forblive i 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3-opløsning ved 37 ° C i i alt tre timer. Efter 1 time øge pumpehastigheden til 1.500 ml / min. Efter yderligere en time, øge pumpehastigheden til 1.800 ml / min. Vævet langsomt udsat for øget perfusion hastigheder til tilstand i vævet og forhindre brud på skibene. Hjertet vil svulme og næsten fordoblet i størrelse i løbet af dette trin af protokollen. Vævet vil miste sin naturlige farve, skrider fra forkamrene til toppunktet i hele the-protokollen (figur 3).
- Efter hver opløsning perfusion, er en to-trins skylning udføres for at fjerne cellerester, kemiske rester, og støtte cellelysis. Hver udvaskning består af en 10 min skylles i type I vand efterfulgt af en 10 min skylles med 2 x PBS-opløsning ved stuetemperatur. Hver vask består af fjernelse af opløsningen fra det oprindelige bægerglas, tilsætte skylleopløsninger, og cirkulere perfusatet i bægerglas, der indeholder den neddykkede hjertet. Efter at 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3-opløsning, perfundere vand ved 1.900 ml / min og derefter perfundere 2X PBS ved 1950 ml / min.
- Overfør hjertet til en opløsning af 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN3 ved stuetemperatur. Øge pumpehastigheden til 2.000 ml / min og perfundere opløsning i en time. Fjern opløsningen fra bægeret og erstattes med frisk opløsning, øge pumpehastigheden til 2100 ml / min, og perfundere det frisk opløsning i yderligere halvanden time, hvorved det samlede tid i3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 til 2,5 timer.
- Skyl vævet med type I vand ved 2150 ml / min og 2X PBS ved 2180 ml / min i 10 min.
- Overfør hjertet med 4% natriumdeoxycholat opløsning ved stuetemperatur. Øge pumpehastigheden til 2.200 ml / min og perfundere opløsning i 3 timer.
- Skyl vævet med type I vand ved og 2X PBS ved 2.200 ml / min i 15 minutter hver, ændre opløsningerne efter 5-10 min for hver opløsning. De beskrevne perfusion trin kan opdeles over flere dage ved at udføre skylletrinnet to gange og lagring af hjertet med tilknyttet rør natten over ved 4 ° C og nedsænket i type I vand.
- Den følgende dag udføre en 5 min skylning med type I vand ved 750 ml / min, efterfulgt af en 5 min skylning i 1 X PBS på 1500 ml / min. Protokollen kan derefter genoptages ved den beskrevne strømningshastighed i den korrekte løsning.
4. Desinfektion og endelige forarbejdning
- Overfør hjertet til en 0,1% peracmatopoietisk acid / 4% ethanolopløsning og perfundere opløsning i 1,5 time ved 2.200 ml / min.
- De slutskyl til vævet udføres alle ved 2.200 ml / min. Perfundere vævet med 1X PBS i 15 minutter, efterfulgt af to 5 minutters vaske i type I vand. Denne række af skylninger gentages en gang mere for at fuldføre opløsningen perfusion procedure.
- Sluk pumpen, og fjern hjertet fra opløsningen løbe hjertet. Skær bånd fra aorta, fjerne alle rør, og anbring hjertet i et tomt bæger til afdrypning i 1 time. Overskydende væske skal drænes periodisk. Lægge hjerte på en absorberende pude fuldt ud dræne hjertet (fig. 4).
- Efter det meste af vandet er fjernet, registreres vægten af hjerte-ekstracellulære matrix (C-ECM). Hjertet kan forventes at tabe ca 20-25% af den oprindelige vægt i løbet af decellularization processen.
- Dissekere de højre og venstre ventrikler, samt ventrikelseptumdefekt for DNA quantificatipå og histologisk behandling for at bekræfte fuldstændig decellularization af vævet (fig. 5).
- Fastfryse C-ECM ved -80 ° C i mindst 2 timer før lyofilisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkningen af decellularization på hele porcine hearts naturligvis varierer på grund af forskelle i størrelse, tryk og beholderen arrangement. Derfor vil den nøjagtige sammensætning af de afledte ekstracellulære matrix stilladser ikke være det samme fra hjerte til hjerte. Færdiggørelsen af den beskrevne protokol, vil give et hjerte, der vises hvid eller gennemsigtig, hvilket indikerer tab af cellulært materiale. Det er imidlertid almindeligt accepteret, at et væv kan betragtes som "decellulariseret" baseret på en kombination af et par mere kvantitative parametre 8. En vellykket decellularization protokol vil frembringe en matrix med mindre end 50 ng dobbeltstrenget DNA per mg væv (figur 6). For at undgå en værts immunrespons efter implantering af matrixen, skal den resterende DNA også indeholde mindre end 200 basepar (figur 7). For at bekræfte disse resultater, bør hæmatoxylin-og eosin-farvning afslører fravær af nuklearefarvning i repræsentative afsnit af ventriklerne og ventrikelseptumdefekt (figur 8). Massons Trichrome yderligere bekræfter tabet af hjertemuskel bundter og fastholdelse af kollagen net (figur 9).
Fig. 1. Den modhager ende af slangen er indsat i aorta af det native hjertet. Slangen skal fastgøres med spændebånd eller zip bånd over aortaklappen at sikre perfusion gennem kranspulsårerne.
Figur 2. Hjertet er nedsænket i vand i en 4L bægerglas og luftbobler må fjernes fra røret. Hvis bobler observeres på vej ud af aorta nær røret, skal yderligere bånd anvendes til at fastgøre slangen til t Han aorta for at opretholde tilstrækkeligt tryk i vævet.
Fig. 3. Som løsninger perfuseres gennem koronararterierne vil hjertet miste sin native farve, forløber fra forkamrene til toppunktet af hjertet og lokaliseret omkring coronaries.
Fig. 4. Efter afslutning af desinfektionen og skyl trin i protokollen, er slangen fjernes og hjertet er placeret på en absorberende pude for at tillade overskydende vand løbe ud af hjertet. Dette sikrer en nøjagtig måling ved at veje vævet, og gør det også muligt vævet at slappe af før skæring.
pg "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Den venstre ventrikel (LV), højre ventrikel (RV) og ventrikulær septum er alle fjernes fra den decellulariserede hjertet til histologisk behandling, nedfrysning og lyofilisering, og DNA-kvantificering.
Figur 6. Kvantitativ analyse af DNA-indhold ved anvendelse af en Pico Green assay. Hjertekamrene fra cECM hjerter viser en signifikant nedgang i DNA-indhold i sammenligning med native ventrikler. DNA-værdier observeret fra denne protokol observeres ved eller under 50 ng / mg standard for decellulariseret væv.
Figur 7. DNA fragment størrelse, som bestemt ved ethidium bromide gel, viste lidt resterende DNA i den decellulariserede hjertekamrene i forhold til en urinblære matrix (UBM) standarden.
Figur 8. Hæmatoxylin og eosinfarvning viste fuldstændig fjernelse af nukleare materialer fra ventriklerne efter afslutningen af decellularization protokollen.
Figur 9. Massons Trichrome-farvning af A) nativ og B) decellulariseret ventrikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den aktuelle undersøgelse beskrevne metode for en konsekvent og effektiv decellularization af et svin hjerte. Protokollen var en modifikation til en tidligere udgivet rapport 1, og omfattede længere udsættelse for flow og øget pres, som gav mere reproducerbare resultater. Den resulterende decellulariseret væv mødte alle de offentliggjorte kriterier for en vellykket decellularization af væv 2. Hyppige opløsning ændringer blev udført for at begrænse genindførelse af cellulært materiale til vævet, og varigheden af eksponering for enkelte decellularization middel blev minimeret for at reducere skadelige virkninger på ECM. I de begyndende stadier af protokollen blev perfusionshastigheden gradvist steget til tilstand vævet og give mulighed for højere strømningshastigheder i løbet af de senere stadier af protokollen. Uden konditionering vævet i de tidlige stadier, kan vaskulaturen af hjertet brud, hvilket gør perfusion af hjertet umulig. Protocol blev brugt på grund af dens effektivitet, og ingen krav er lavet til sin overlegenhed over andre protokoller. Den præcise sammensætning af decellularization agenter og satser for perfusion kan tænkes varieres til opnåelse af en protokol med bedre mekaniske eller biologiske egenskaber, men de generelle principper for levering af agenter til hjertet er gældende.
Bevarelse af den native tredimensionelle struktur af hjertet blev tilskrevet adskillige procedurer udføres hele decellularization protokollen. Først blev vævet trimmet og nedfrosset ved ankomsten. Frysning fremmes cellelyse og var vigtig for forbehandling vævet for perfusion cyklusser. Vævet blev grundigt inspiceret for nedskæringer og 2 cm intakt intakt aorta overlegen til aortaklappen. Hvis nogen hjertesækken eller epicardium blev skåret, blev organet kasseret, fordi perfusatet ikke nåede downstream områder af hjertet, og hjertet blev ikke fuldt decellulariseret.Dernæst blev vævet fuldstændigt optøet i type I vand før brug. Vandet gjorde det muligt for vævet at slappe af som det optøet og også hjulpet til fjernelse af resterende blodpropper i hjertet. Da den slange blev indsat, blev der draget omsorg for, at aortaklappen forblev intakt, så det dannede en vand-tæt forsegling rundt om slangen, således at et passende tryk blev opretholdt, og at opløsningen ind kranspulsårerne.
Efter hver decellularization protokol var tilendebragt, blev en række kvalitetskontrolforanstaltninger udført for at sikre fuldstændig fjernelse af cellemateriale. Den aktuelle undersøgelse verificeret, at protokollen elimineres histologisk farvning for cellekerner, viste, at mindre end 50 ng DNA var til stede per mg tørvægt af væv, og at enhver DNA var mindre end 200 bp i størrelse 6. Tidligere offentliggjorte metoder til hjerte-decellularization viste lignende niveauer af decellularization i DNA-farvning og kvantificering2,5,9,10. Komplet decellularization blev opnået i disse studier med tilsvarende behandlinger af enzymer og rengøringsmidler. Men i den foreliggende undersøgelse, blev varigheden af eksponering for hvert kemikalie øges, var der flere opløsning ændres, og strømningshastighederne blev forøget. Den foreliggende protokol også øget længden af kemiske skylninger, der kan føre til mere effektiv fjernelse af kemiske rester fra den ekstracellulære matrix.
Recellularization af decellulariseret rottehjerter med hjerte specifikke celler har givet lovende resultater in vitro 2,5. Hele organperfusion decellularization tilladt for vedligeholdelse af det native vaskulatur, som er kritisk i recellularization af vævet. De iboende vækstfaktorer, matrixproteiner, og tre-dimensionelle fiber arkitektur også promoveret ordentlig cellevedhæftning, migration og signaler at rekonstruere kontraktile myocardievæv. Porcint hjerte extracellular matrix vil være vanskeligere at recellularize på grund af størrelsen af stilladset og antallet af celler, der er nødvendige for korrekt celle kommunikation og stoftransport. Dog kan patches udskåret fra den kardiale matrix være nyttig til in vivo-anvendelser. Flere undersøgelser har vist den potentielle fordel ved anvendelse af en stedspecifik matrix til genopbygning af beskadiget væv i dyremodeller 11-13. Således en ekstracellulær matrix scaffold afledt fra hjertevæv er ønskeligt for myocardiale genopbygning applikationer. Den iboende arkitektur af hjertevævet kan udgøre fordele i forhold til en ECM scaffold afledt af et andet organ eller en kunstig biomateriale. En stedsspecifik stillads kan støtte værtscelle infiltration og fremme en konstruktiv remodeling svar, i modsætning til dannelse af arvæv. Hidtil har hjerte ECM patches blevet undersøgt in vivo for at rekonstruere en defekt skabt i myocardial væg 14. Future stumatricer vil blive udført in vitro for at undersøge evnen af stilladset for at støtte hjerteceller podet og dyrket på matrixen. De heri beskrevne fremgangsmåder kan også være gældende for decellularization af menneskelige hjerter.
Som konklusion er porcin hjerte decellularization muligt, og fremgangsmåderne er ligetil. Fortsat undersøgelse af dette materiale giver indsigt i dets potentiale for klinisk anvendelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Gilbert var på Scientific Advisory Board hos ACell, Inc. mens undersøgelsen blev gjort, og for nylig blev VP for forskning og udvikling. ACell, Inc. sælger urinblære matrix og har ingen kommerciel interesse i den foreliggende undersøgelse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Brogan Guest, Michelle Weaver, og Kristen Lippert. Finansieringen af denne undersøgelse blev leveret af NIH Grant R03EB009237 samt NIH uddannelsesstipendierne T32EB001026-06 fra National Institute of Biomedical Imaging And Bioengineering og T32HL076124-05.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
