Summary
שיטת מהירות לחלוטין להסיר רכיבים סלולריים מלב חזירי שלם באמצעות זלוף המדרדר מתוארת. שיטה זו מניבה מטריצת אתר פיגום תאי לבבי ספציפי שבו יש פוטנציאל לשימוש ביישומים קליניים מרובים.
Abstract
כל decellularization האיבר זלוף המבוסס צבר לאחרונה עניין בתחום הנדסת רקמות כאמצעי ליצור פיגומים תאיים מטריקס ספציפיים לאתר, תוך שמירה על מידה רבה את הארכיטקטורה המקורית של הפיגום. עד כה, גישה זו נוצלה במגוון רחב של מערכות איברים, כוללת לב, ריאות, הכבד ו1-5. שיטות decellularization קודמות לרקמות ללא רשת כלי דם נגישה הסתמכו על חשיפה ממושכת של רקמות לפתרונות של חומרי ניקוי, חומצות, או טיפולים אנזימטיים כאמצעי כדי להסיר את הרכיבים הסלולריים וגרעיניים מהסביבה התאית 6-8. עם זאת, היעילות של שיטות אלה תלויים על יכולתו של את הפתרונים לחלחל רקמות באמצעות דיפוזיה. לעומת זאת, טפטוף של איברים דרך מערכת כלי הדם הטבעית ביעילות מצמצם את מרחק דיפוזיה ותחבורת הנחייתם של decellularizatiעל סוכנים לרקמה והמרכיבים תאיים מהרקמות. בזאת, אנו מתארים שיטה לdecellularize לב חזירי שלם מלא דרך זלוף המדרדר כלילית. הפרוטוקול הניב decellularized מלוא לב תאי מטריצה (c-ECM) פיגום עם המבנה תלת הממדים של הלב השלם. השיטה שלנו השתמשה בסדרה של אנזימים, חומרי ניקוי, וחומצות בשילוב עם שטיפות hypertonic וhypotonic לסייע בתמוגה וההסרה של תאים. הפרוטוקול המשמש פתרון טריפסין לנתק את התאים מהמטריצה אחרי Triton פתרוני X-100 ונתרן deoxycholate כדי לסייע בהסרה של חומר תאי. הפרוטוקול המתואר משתמש גם במהירויות של יותר מ זלוף 2 ליטר / דקה לפרקי זמן ארוכים. קצב הזרימה הגבוהה, בשילוב עם שינויי פתרון נתן הובלה של סוכנים לרקמות ללא זיהום של פסולת תאית והבטיח יעיל שטיפה של הרקמות. השיטה המתוארת הסירה את כל החומר גרעיני מנתיve רקמת לב חזירית, יצירת לב ECM פיגום באתר ספציפי שיכול לשמש למגוון רחב של יישומים.
Protocol
1. הכנת רקמה והתקנת ניסוי
- איבר חזירי קציר מייד לאחר המתת חסד ממתקן משחטה או מחקר ולשטוף את הדם עודף. חתוך את הלב של שומן ורקמה עודפים, שמירת הפרוזדורים ואב העורקים בשלמותה. לחתוך שומן להפריד מעורק הריאה לאב העורקים. אם יש קיצוצים כלשהם ברקמה, להשליך כראוי.
- עוטף כל אחד בנפרד בנייר לב מקפיא ולאחסן את כל הרקמות במקפיא ° C -80 לפחות 24 שעות כדי להבטיח הקפאה מוחלטת.
- כשמוכן לשימוש (בדרך כלל פחות מ 3 חודשים), לב הפשרה 1 שלם קפוא חזירי במים מסוג 1 מתחת למים למשך הלילה בכוס 4 ליטר ב 4 ° C.
- לאחר הלב מופשר לחלוטין, ללטף את הלב יבש, לשקול את הלב, ולהקליט במשקל. לבו של חזיר במשקל שוק צריך לשקול כ 375-450 גרם.
- חבר צינורות גודל 18 Masterflex לסוף ¼ "של מפחית תיל. הכנס מפחית התיל וצינורות בתוך אב העורקים. 2 תפסי מקום צינור או קשרי zip מאובטחים ברחבי אב העורקים, ממש מתחת לתא מטען brachiocephalic. המפחית והצנרת חייב להישאר מעל לשסתום אב העורקים, ולכן העורקים הכליליים ניתן perfused (איור 1).
- השתמש במזרק 30 או 60 מ"ל כדי למלא את הצינור במי סוג I. הכנס את הצינורות בתוך המחסנית של משאבת גלגלת Masterflex באמצע המשוער שלו. הצף את סוף היבוא של הצינורות בחלק התחתון של 4 כוס ליטר מלאה עם 2.5 ליטר מים ולאבטח את הצינור.
- הנח את הלב בכוס מלאה במים, וראש המשאבה כדי להסיר בועות אוויר. אם בועות הם נצפו מגיעים מאב העורקים שבו הצינור מוכנס, אב העורקים ייתכן שיהיה הצורך לשנות את מיקום או מאובטח עם קשרים נוספים. חותם אטום הוא חשוב כדי לשמור על לחץ מתאים במשך תהליך decellularization (איור 2).
- הנח את 4 כוס הליטר המכיל 3 ליטר של 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 פתרון בצלחת מערבבים ומחמם אותו עד 37 מעלות צלזיוס בהכנת תהליך decellularization.
2. רקמת שטיפות
- הגדר את המשאבה לקצב זרימה של 400 מ"ל / דקה, להבטיח כי את גודל הצינורות נכון נבחר. שטוף את הלב עם סוג מים שעבור 15-25 דקות. כמשאבה התחילה, לב צריך להתנפח וeffuse דם מחדרי הלב. פתרון טרי צריך להחליף כל 5-10 דקות, או לפי צורך על בסיס כמות הדם הוסרה מהלב. אם דם לא effused מהלב, להתאים את הצינורות ותפסים במידת צורך.
- עצור את המשאבה ולהעביר את הלב לכוס נפרדת מלאה בפוספט 2X נאגר מלוח (PBS). אחרי הצינורות הם שקועים בפתרון, מפעיל את המשאבה ולהגביר את קצב הזרימה של 700 מ"ל / דקה. הלב צריך להישאר בתמיסה למשך 15 דקות, שינוי הפתרון כל 5 דקות. כל שינוי דורש פתרון המשאבה צריך לעצור באופן זמני תוך הרקמות והצינורות מועברותלכוס החדשה.
- להעביר את הלב לסוג מים שעבור 10 דקות ולהגביר את קצב הזרימה ל750 מ"ל / דקה.
3. זלוף Decellularization והפתרון
- להעביר את הלב לכוס המכילה 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% 3 NaN ב 37 ° C. הגדל את מהירות משאבת 1200 מ"ל / דקה ומפעיל את המשאבה. השתמש במוט מערבבים הונח בתחתית הכוס לזרום פתרון במבחנה. הלב צריך להישאר בEDTA/0.05% 3 פתרון 0.2% Trypsin/0.05% NaN על 37 מעלות צלזיוס עבור סכום כולל של שלוש שעות. לאחר השעה 1, להגדיל את מהירות המשאבה ל -1,500 מ"ל / דקה. לאחר שעה נוספת, להגדיל את מהירות המשאבה ל -1,800 מ"ל / דקה. הרקמה היא נתונה באיטיות למהירות מוגברת זלוף למצב הרקמות ולמנוע קרע של כלי הדם. הלב יתפח וכמעט כפול בגודלו במהלך שלב זה של הפרוטוקול. הרקמות תאבדנה את צבעו הטבעי, ומתקדם מהאטרייה לשיא בכל רחבי הדואר הפרוטוקול (איור 3).
- לאחר כל זלוף פתרון, 2 שלב שטיפה מתבצע על מנת להסיר שאריות סלולריות, שאריות כימיקלים, ותמוגה תא סיוע. כל השטיפה מורכבת מ10 דקות לשטוף במי סוג I ואחרי 10 דקות לשטוף עם פתרון 2X PBS בטמפרטורת חדר. כל שטיפה מורכבת מהסרת הפתרון מהכוס המקורית, והוסיף לשטוף פתרונות, ומחזור perfusate בתוך הכוס המכילה את הלב מתחת למים. לאחר 3 פתרון NaN 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% מים, ינקבו ב1900 מ"ל / דקה ואז ינקבו 2X PBS ב 1950 מ"ל / דקה.
- להעביר את הלב לפתרון של 3% X-100/0.05% טריטון EDTA/0.05% 3 NaN בטמפרטורת חדר. הגדל את מהירות המשאבה עד 2,000 מ"ל / פתרון ינקב דקות ובמשך שעה אחת. הסר את התמיסה מהמבחנה ולהחליף עם פתרון חדש, להגדיל את מהירות המשאבה עד 2100 מ"ל / דקה, ותנקב את הפתרון הטרי לשעה נוספת וחצי, מביא את הסך כל זמן ב3% טריטון X-100/0.05% EDTA/0.05% 3 NaN ל -2.5 שעות.
- שטוף את הרקמה במי סוג I ב2150 מ"ל / דקה ו2X PBS ב 2180 מ"ל / דקה למשך 10 דקות כל אחד.
- להעביר את הלב ל4% פתרון Deoxycholate נתרן בטמפרטורת חדר. הגדל את מהירות משאבת 2200 מ"ל / דקה ופתרון ינקב עבור 3 שעות.
- שטוף את הרקמה במי סוג I וב2X PBS ב 2200 מ"ל / דקה במשך 15 דקות כל אחד, משנות את הפתרונים לאחר דקות 5-10 לכל פתרון. ניתן לפצל את צעדי זלוף תואר על ימים מרובים על ידי ביצוע הצעד לשטוף פעמים ואחסון הלב עם צינורות מחוברים בין הלילה ב 4 ° C ושקוע במי סוג I.
- למחרת, בצעו 5 דקות לשטוף עם מי סוג I ב 750 מ"ל / דקה, ואחרי 5 דקות לשטוף ב1X PBS ב 1500 מ"ל / דקה. הפרוטוקול ואז ניתן להמשיך בקצב הזרימה המתוארת בפתרון הראוי.
4. חיטוי ועיבוד סופי
- להעביר את הלב לperac 0.1%פתרון ינקב עבור 1.5 שעתי פתרון אתנול 4% וב2200 מ"ל / דקת חומצת etic /.
- את השטיפות הסופיות לרקמות שבוצעו בכל 2200 מ"ל / דקה. תנקב את הרקמה עם 1X PBS במשך 15 דקות, ואחרי 2 דקות 5 שטיפות במי סוג I. זו סדרה של שטיפות חוזרת על עצמו פעם נוספת על מנת להשלים את הליך זלוף פתרון.
- הפעל את המשאבה וניתק את הלב מפתרון לניקוז הלב. חותך את הקשרים מאב העורקים, להסיר את כל הצנרת, ולמקם את הלב בגביע ריק לניקוז לשעה 1. עודף נוזלים יהיו צורך לנקז אותו מדי. הנח את הלב על משטח סופג כדי לנקז את הלב (איור 4) באופן מלא.
- לאחר שרוב המים מוסרים, להקליט את המשקל של מטריקס הלב (C-ECM). הלב יכול להיות צפוי לאבד כ 20-25% מהמשקל ההתחלתי שלה במהלך תהליך decellularization.
- לנתח את חדרי לב הימניים ושמאליים, וכן מחצו חדרית לדנ"א quantificatiובעיבוד היסטולוגית כדי לאשר decellularization המלא של הרקמה (איור 5).
- הקפא C-ECM ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 2 שעות לפני lyophilization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההשפעה של decellularization על לב חזירי שלם באופן טבעי משתנית בהתאם להבדלים בגודל, לחצים, וסידור כלי. לכן, את ההרכב המדויק של הפיגומים התאיים מטריקס הנגזרים לא יהיה אותו הדבר מלב אל לב. השלמת הפרוטוקול המתואר תניב לב שמופיע לבן או שקוף, המציין את האובדן של חומר תאי. עם זאת, מקובל כי רקמה יכולה להיחשב "decellularized", המבוסס על שילוב של מספר פרמטרים כמותיים יותר 8. פרוטוקול decellularization מוצלח יהיה לייצר מטריצה עם פחות מ 50 ng של גדילי הדנ"א כפול למ"ג של רקמות (איור 6). על מנת להימנע מתגובה חיסונית מארחת על השתלה של מטריקס, את ה-DNA שנותר צריך להכיל גם פחות מ 200 זוגות בסיסים (איור 7). כדי לאשר את הממצאים הללו, ומכתימים Hematoxylin Eosin צריך לחשוף את ההיעדר גרעיניהכתמה בסעיפים מייצגים של חדרי לב ומחץ חדרית (איור 8). Trichrome של מסון נוסף מאשר את האובדן של חבילות שריר לב ושמירה של רשתות קולגן (איור 9).
איור 1. סוף התיל של הצינור מוחדר לעורק הראשי של לב הילידים. הצינורות חייבים להיות מאובטחים עם מהדק צינור או קשרי zip מעל שסתום אב העורקים כדי להבטיח זלוף דרך העורקים הכליליים.
איור 2. הלב הוא שקוע במים בכוס 4L ובועות אוויר יש להסיר מן הצינורות. אם בועות הם נצפו יוצאים מאב העורקים בסמוך לצינורות, קשרים נוספים חייבים לשמש כדי לאבטח את הצינור לt הוא אב עורקים כדי לשמור על לחץ מתאים ברקמות.
איור 3. כמו פתרוני perfused דרך העורקים הכליליים, הלב מאבד את הצבע המקורי שלו, ומתקדם מהאטרייה לשיא של לב והמקומי סביב התקפי לב.
איור 4. לאחר סיום החיטוי ושטיפת מדרגות הפרוטוקול, צינורות מוסר והלב מונח על משטח סופג כדי לאפשר למים העודפים לניקוז מתוך הלב. הדבר מבטיח מדידה מדויקת כאשר משקל הרקמה וגם מאפשר לרקמות כדי להירגע לפני החתך.
"Alt =" עמ 'איור 5 "/>
איור 5. חדר השמאלי (LV) מחדר ימין (RV), והמחיצה חדרית כל יוסר מלב decellularized לעיבוד, הקפאה היסטולוגית וlyophilization, וכימות DNA.
איור 6. ניתוח כמותי של תוכן דנ"א באמצעות assay גרין פיק. חדרי הלב מלב cECM מראים ירידה משמעותית בתוכן ה-DNA בהשוואה לחדרי לב ילידים. ערכי DNA שנצפו מפרוטוקול זה נצפה באו מתחת לרמת 50 ng / מ"ג לרקמות decellularized.
איור 7. גודל קטע DNA, כפי שנקבע על ידי ethidiuמ 'רומיד ג'ל, הראה DNA שיורים קטן בחדרי לב decellularized בהשוואה למטריצת שלפוחית שתן (UBM) סטנדרטית.
האיור 8. Hematoxylin ומכתים Eosin הראו הסרה מלאה של חומר גרעיני מחדרי הלב לאחר השלמת פרוטוקול decellularization.
איור 9. מכתימים Trichrome של מסון של) B) חדר לב decellularized יליד ו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר הנוכחי תאר מתודולוגיה לdecellularization עקבי והיעיל של לב חזירי. הפרוטוקול היה שינוי ל1 דו"ח שפורסם בעבר, וכלל חשיפה ארוכה יותר לזרימה ולחץ מוגבר, אשר ספקה תוצאות דיר יותר. רקמת decellularized התקבלה עמדה בכל הקריטריונים שפורסמו לdecellularization המוצלח של רקמה 2. שינויים תכופים פתרון בוצעו על מנת להגביל את החידוש של חומר תאי לרקמה, ומשך חשיפה לכל סוכן decellularization היה ממוזער להפחתת השפעות שליליות על ECM. במהלך השלבים הראשונים של הפרוטוקול, שיעור זלוף היה גדל בהדרגה למצב הרקמות ולאפשר לספיקות גבוהות יותר בשלבים המאוחרים יותר של הפרוטוקול. ללא מיזוג הרקמות בשלבים המוקדמים, בכלי הדם של הלב יכולים להיקרע, מה שהופך פרפוזיה של לב בלתי אפשרית. פרוטוcol שמש בשל יעילותה, ואין לה תביעות נעשות לעליונותו על פני פרוטוקולים אחרים. ההרכב המדויק של סוכני decellularization ושיעורי זלוף מתקבל על דעת עשוי להיות מגוון להניב פרוטוקול עם תכונות מכאניות או ביולוגיות טובות יותר, אך העקרונות הכלליים למסירה של הסוכנים ללב חלים.
השימור של המבנה המקורי תלת הממדי של הלב יוחס למספר פרוצדורות שבוצעו לאורך פרוטוקול decellularization. ראשית, הרקמה הייתה גזוזה והוקפאה בעת ההגעה. הקפאה קדמה תמוגה תא והיה חשוב לרקמה טרום מיזוג למחזורי זלוף. הרקמה, נבדק ביסודיות לחתכים ו2 סנטימטר שלם אב עורקים שלם מעולים סתם אאורטלי. אם כל קרום לב או epicardium נחתך, האיבר הושלך משום perfusate לא הגיע לאזורים במורד זרם של הלב, והלב לא היה decellularized באופן מלא.בשלב הבא, הרקמה הייתה מופשרת לחלוטין במי סוג שלפני השימוש. המים אפשרו לרקמה להירגע כפי שהפשיר וגם סייעתי להסרת קרישי דם השיורי בתוך הלב. לבסוף, כצינור שהוחדר, הוקפד על מנת להבטיח שסתם אאורטלי נותר על הכן, כך שהוא יוצר חותם אטום למים סביב הצינור, כך שלחץ תקין נשמר וכי הפתרון נכנס בעורקים הכליליים.
אחרי כל פרוטוקול decellularization הושלם, סדרה של אמצעי בקרת איכות הושלמה כדי להבטיח הסרה מלאה של חומר תאי. המחקר הנוכחי אשר שהפרוטוקול בוטל מכתים היסטולוגית לגרעין תא, הראה כי פחות מ 50 ng של DNA היה נוכח למ"ג של משקל יבש של הרקמה, וכי כל הדנ"א היה פחות מ 200 נ"ב בגודל 6. שיטות שפורסמו בעבר לdecellularization לב הראו רמות דומות של decellularization במכתים דנ"א וכימות2,5,9,10. decellularization המלא הושג במחקרים אלה באמצעות טיפולים דומים של אנזימים וחומרי ניקוי. עם זאת, במחקר הנוכחי, באורך של חשיפה לכל חומר כימי שעלה, היו יותר שינויי פתרון, ואת קצב הזרימה היה מוגברים. הפרוטוקול הנוכחי גם הגדיל את אורכו של שטיפות כימיות, שעלול לגרום להסרה יעילה יותר של שאריות כימיות ממטריקס.
Recellularization לבבות עכברושים decellularized עם תאים ספציפיים לב הניב תוצאות מבטיחות בניסויי מבחנה 2,5. decellularization זלוף איבר השלם אפשר לתחזוקה של מערכת כלי הדם המקורית, שהוא קריטי בrecellularization של הרקמה. גורמי הצמיחה הגלומים, חלבוני מטריצה, וארכיטקטורת סיבים תלת ממדית גם קדמו מצורפים תקין תא, הגירה, ומאותת לרקמות שריר לב לשקם התכווצות. החזירי הלב extracellular מטריצה תהיה קשה יותר לrecellularize בשל גודלו של הפיגום ומספר התאים דרושים לתקשורת סלולרית תקינה ומעבר חומרי מזון. עם זאת, תיקונים שנחתכו ממטריצת הלב עשויים להיות שימושיים עבור ביישומי vivo. מחקרים רבים הראו שיתרון לשימוש במטריצה ספציפית לאתר לבנייה מחדש של רקמות פגועות במודלים של בעלי חיים 11-13. לכן, מטריצת חוץ תאי פיגום נגזר מרקמת לב רצוי עבור יישומי שיקום שריר לב. הארכיטקטורה הפנימית של רקמת הלב עשויה להציג יתרונות על פני פיגום ECM נובע מאיבר אחר או ביולוגי מלאכותית. הפיגום באתר ספציפי עשוי לתמוך חדירת תא מארח ולקדם שיפוץ תגובה בונה, בניגוד להיווצרות רקמת צלקת. נכון להיום, טלאי לב ECM נחקרו in vivo לשחזר פגם שנוצר בקיר שריר הלב 14. העתיד סטהמת יבוצע במבחנה כדי לבחון את יכולתו של הפיגום כדי לתמוך בתאי לב שנזרעו ותרבית על המטריצה. בשיטות המתוארות במסמך זה עשויות גם להיות ישימים decellularization של לב אדם.
לסיכום, decellularization לב החזירי היא אפשרי והשיטות הן ישר קדימה. המשך החקירה של חומר זה תספק תובנה לתוך הפוטנציאל שלה לשימוש קליני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ד"ר גילברט היה בוועדה המדעית המייעצת בACell, Inc בעוד שהמחקר שנעשה, והפך לאחרונה לסגן הנשיא למחקר ופיתוח. ACell, Inc מוכר מטריצת שלפוחית שתן ואין לו עניין מסחרי במחקר הנוכחי.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות רוגן אורח, מישל וויבר, וקריסטן יפרט. מימון למחקר זה מסופק על ידי NIH גרנט R03EB009237, כמו גם מענקי NIH הדרכת T32EB001026-06 ממכון הלאומי לדימות וBioengineering ביו T32HL076124-05.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
