Summary
Een methode om snel en volledig cellulaire componenten uit een intact varkens hart door retrograde perfusie beschreven. Deze methode levert een plaatsspecifieke cardiale extracellulaire matrix scaffold die het potentieel voor gebruik in verscheidene klinische toepassingen.
Abstract
Perfusion-based geheel orgaan ontcelling heeft onlangs verworven belang op het gebied van weefselmanipulatie als middel om site-specifieke extracellulaire matrix scaffolds maken, terwijl grotendeels behoud van de natieve structuur van de steiger. Tot op heden is deze benadering gebruikt in verschillende orgaansystemen, waaronder het hart, longen en lever 1-5. Previous decellularisatie werkwijzen voor weefsels geen gemakkelijk toegankelijke vasculaire netwerk zijn uitgegaan van langdurige blootstelling van weefsel oplossingen van wasmiddelen, zuren of enzymatische behandeling als een middel om de cellulaire en nucleaire componenten uit het omringende extracellulaire omgeving 6-8. De effectiviteit van deze methoden scharnierend op het vermogen van de oplossingen het weefsel permeaat via diffusie. In tegenstelling, perfusie van organen door het natuurlijke vasculaire systeem effectief verminderd de verspreiding afstand en vergemakkelijkt het transport van decellularizatide agenten in het weefsel en cellulaire componenten uit het weefsel. Hierin beschrijven we een methode om een intacte varkens hart volledig decellularize door coronaire retrograde perfusie. Het protocol leverde een volledig cardiale cellen ontdane extracellulaire matrix (ECM-c) scaffold met de driedimensionale structuur van het hart intact. Onze methode een aantal enzymen, wasmiddelen, en zuren combinatie met hypertone en hypotone spoelingen te helpen bij de lysis van cellen en verwijdering. Het protocol een trypsine-oplossing om cellen van de matrix gevolgd door Triton X-100 en natriumdeoxycholaat oplossingen helpen bij verwijdering van celmateriaal los. De beschreven protocol gebruikt ook perfusie snelheden van meer dan 2 L / min gedurende langere tijd. De hoge stroomsnelheid, gekoppeld met een oplossing wijzigingen mogelijk transport van middelen om het weefsel zonder verontreiniging van celresten en gewaarborgd effectieve spoelen van het weefsel. De beschreven methode verwijderd alle nucleaire materiaal van native varkens hartweefsel, waardoor een site-specifieke cardiale ECM steiger die kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen.
Protocol
1. Tissue Voorbereiding en Experiment Setup
- Oogst varkens orgaan onmiddellijk na euthanasie vanuit een slachthuis of onderzoeksfaciliteit en spoel het overtollige bloed. Trim het hart van overtollig vet en weefsel, het bijhouden van de atria en de aorta intact. Snij vet om de longslagader te scheiden van de aorta. Als er bezuinigingen in het weefsel, de juiste gooi.
- Individueel Wikkel elk hart in de vriezer papier en bewaar alle weefsel in een -80 ° C vriezer voor tenminste 24 uur om een volledige bevriezing te garanderen.
- Wanneer klaar voor gebruik (meestal minder dan 3 maanden), dooi een intacte bevroren varkens hart in Type 1 water 's nachts ondergedompeld in een 4 L beker bij 4 ° C.
- Nadat het hart is volledig ontdooid, dep het hart droog is, weegt het hart, en registreer het gewicht. Het hart van een markt gewicht varken moeten wegen ongeveer 375 tot 450 g.
- Sluit maat 18 Masterflex slang aan op de ¼ "einde van een prikkeldraad reducer. Steek het prikkeldraad reducer enslang in de aorta. Plaats 2 slangklemmen of beveiligde zip banden rond de aorta, net onder de brachiocephalic kofferbak. Het verloopstuk en leidingen moeten blijven boven de aortaklep, waardoor de kransslagaders worden geperfuseerd (figuur 1).
- Gebruik een 30 of 60 ml spuit om de slang te vullen met type I water. Plaats de buis in de cartridge van een Masterflex rollerpomp op zijn benadering middelpunt. Dompel het instroomeinde van de buis in de bodem van een 4 L beker gevuld met 2,5 L water en zet de slang.
- Plaats het hart in het bekerglas gevuld met water, en prime de pomp om luchtbellen te verwijderen. Als er bellen worden waargenomen vanuit de aorta, waar de slang is geplaatst, kan de aorta moet worden verplaatst of vastgezet met extra banden. Een luchtdichte afdichting is belangrijk om voldoende druk te handhaven tijdens de cellen ontdoen proces (figuur 2).
- Plaats het bekerglas met 4 L 3 L van een 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 oplossing op roerplaat en warm deze op tot 37 ° C in de voorbereiding van de decellularisatie proces.
2. Tissue Spoelt
- Stel de pomp met een debiet van 400 ml / min, waarbij de juiste slang is gekozen. Spoel het hart met Type I water voor 15-25 minuten. Als de pomp wordt gestart, moet het hart zwellen en uitstrooien bloed uit de ventrikels. Verse oplossing worden vervangen elke 5-10 min, of zoveel als nodig gebaseerd op de hoeveelheid bloed uit het hart. Als er bloed wordt niet effused uit het hart, past u de slangen en klemmen als het nodig is.
- Stop de pomp en breng het hart een afzonderlijk bekerglas gevuld met 2X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Nadat de buis ondergedompeld in oplossing, start de pomp aan en de stroomsnelheid van 700 ml / min. Het hart blijven in oplossing gedurende 15 min, verandert de oplossing om de 5 minuten. Elke oplossing verandering vereist de pomp tijdelijk is gestopt terwijl het weefsel en slang verplaatstde nieuwe bekerglas.
- Breng de hart I water type voor 10 min en de stroomsnelheid te verhogen tot 750 ml / min.
3. Decellularisatie en oplossing Perfusie
- Breng het hart in het bekerglas met 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 bij 37 ° C. Verhoog de pompsnelheid 1200 ml / min en start de pomp. Gebruik een roerstaaf geplaatst op de bodem van het bekerglas oplossing circuleren in het bekerglas. Het hart blijven in de 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 oplossing bij 37 ° C voor een totaal van drie uur. Na 1 uur verhogen pompsnelheid 1500 ml / min. Na een uur, verhoogt de pompsnelheid 1800 ml / min. Het weefsel wordt langzaam onderworpen aan verhoogde perfusie snelheid wordt om het weefsel en voorkomen breuk van de vaten. Het hart zal opzwellen en bijna het dubbele in omvang tijdens deze stap van het protocol. Het weefsel verliest zijn natuurlijke kleur, vordert van de atria naar de top in heel ee protocol (figuur 3).
- Na elke oplossing perfusie, is een twee stappen spoeling uitgevoerd om cellulaire puin, chemisch residu, en de steun cellysis te verwijderen. Elke spoeling bestaat uit een 10 min spoelen met Type I water gevolgd door 10 min spoelen met PBS 2X oplossing bij kamertemperatuur. Elke wassing bestaat uit het verwijderen van de oplossing van de oorspronkelijke bekerglas toegevoegd spoel oplossingen en circuleren de perfusievloeistof in het bekerglas met ondergedompelde hart. Na 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 oplossing perfuseren water op 1900 ml / min en vervolgens 2X perfuseren PBS op 1950 ml / min.
- Breng het hart aan een oplossing van 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN3 bij kamertemperatuur. Verhoog de pompsnelheid 2000 ml / min en perfuseren oplossing gedurende een uur. Verwijder de oplossing van de beker en vervangen door verse oplossing, verhogen de pompsnelheid tot 2100 ml / min en perfuseren de verse oplossing tegen anderhalf uur, waardoor de totale tijd in3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 tot 2,5 uur.
- Spoel het weefsel in Type I water bij 2150 ml / min en 2x PBS bij 2180 ml / min gedurende 10 min. elk.
- Breng het hart aan 4% natriumdeoxycholaat oplossing bij kamertemperatuur. Verhoog de pompsnelheid 2200 ml / min en perfuseren oplossing gedurende 3 uur.
- Spoel het weefsel in Type I water en 2x PBS bij 2200 ml / min gedurende 15 min elk, veranderen de oplossingen na 5-10 min voor elke oplossing. De beschreven perfusie stappen kunnen worden verdeeld over meerdere dagen na door de spoel stap tweemaal en opslaan van het hart met bevestigde buis overnacht bij 4 ° C en ondergedompeld in Type I water.
- De volgende dag voeren op 5 min met Type I water spoelen bij 750 ml / min, gevolgd door een 5 min spoeling in 1X PBS op 1500 ml / min. Het protocol kan vervolgens voortgezet worden beschreven debiet in de juiste oplossing.
4. Desinfectie en eindverwerking
- Breng het hart een 0,1% peracetic zuur / 4% ethanol oplossing en perfuseren oplossing gedurende 1,5 uur bij 2200 ml / min.
- Het uiteindelijke spoelen voor het weefsel worden alle uitgevoerd bij 2200 ml / min. Perfuseren het weefsel met 1X PBS gedurende 15 minuten gevolgd door twee wassingen in 5 min Type I water. Deze serie spoelingen wordt nog eens herhaald om de oplossing perfusie voltooien.
- Schakel de pomp uit en verwijder het hart uit de oplossing naar het hart af te tappen. Snijd de banden van de aorta, verwijdert u alle slangen, en plaats het hart in een lege beker om uit te lekken gedurende 1 uur. Overtollige vloeistof moet regelmatig worden afgetapt. Leg de hart op een absorberend kussen om al het water het hart (figuur 4).
- Na de meeste water wordt verwijderd, registreer het gewicht van het cardiale extracellulaire matrix (ECM-C). Het hart kan worden verwacht dat ongeveer 20-25% van zijn oorspronkelijke gewicht te verliezen tijdens het proces ontcelling.
- Ontleden de rechter en linker ventrikels, en de ventriculaire septum voor DNA quantification en histologische verwerking om volledige ontcelling van het weefsel (Figuur 5) te bevestigen.
- Bevriezen C-ECM bij -80 ° C gedurende ten minste 2 uur vóór lyofilisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het effect van ontcelling op hele varkensharten varieert natuurlijk gevolg van verschillen in grootte, druk en vat arrangement. Daarom zal de exacte samenstelling van de afgeleide extracellulaire matrix scaffolds niet hetzelfde van hart tot hart. De voltooiing van de beschreven protocol levert een hart dat verschijnt wit of doorschijnend, met vermelding van het verlies van celmateriaal. Echter algemeen aanvaard dat een weefsel kan worden beschouwd "ontcelde" gebaseerd op de combinatie van een paar kwantitatieve parameters 8. Een succesvolle decellularisatie protocol zal een matrix met minder dan 50 ng van dubbelstrengs DNA per mg van weefsel (Figuur 6). Om een immuunrespons te voorkomen na implantatie van de matrix, moet de resterende DNA bevatten minder dan 200 basenparen (Figuur 7). Om deze bevindingen te bevestigen, moet hematoxyline en eosine kleuring blijkt de afwezigheid van nucleairekleuring in Representatieve secties van de ventrikels en ventriculaire septum (Figuur 8). Masson's Trichrome bevestigt verder het verlies van de hartspier bundels en behoud van collageen netwerken (Figuur 9).
Figuur 1. Het prikkeldraad uiteinde van de buis wordt ingebracht in de aorta van het eigen hart. De slangen moeten worden vastgezet met slangklemmen of kabelbinders boven de aortaklep naar perfusie waarborgen door middel van de kransslagaders.
Figuur 2. Het hart wordt ondergedompeld in water in een bekerglas 4L en luchtbellen worden verwijderd uit de slang. Als belletjes waargenomen die uit de aorta bij de buis moet extra banden worden gebruikt om de buis vast te zetten t hij aorta om voldoende druk in het weefsel te handhaven.
Figuur 3. Aangezien oplossingen geperfuseerd via de kransslagaders, zal het hart verliezen de oorspronkelijke kleur vordert van de atria aan de apex van het hart en gelokaliseerd rond de kransslagaders.
Figuur 4. Na voltooiing van de desinfectie en spoelen stappen van het protocol, de buis wordt verwijderd en het hart wordt op een absorberend kussen om het overtollige water uit afvoer van het hart. Dit zorgt voor een nauwkeurige meting bij het afwegen van het weefsel en maakt het ook mogelijk het weefsel om te ontspannen voor het snijden.
pg "alt =" Figuur 5 "/>
Figuur 5. Linkerventrikel (LV), rechterventrikel (RV) en ventriculaire septum alle uit de ontcelde hart voor histologische verwerking, invriezen en vriesdrogen en DNA kwantificatie.
Figuur 6. Kwantitatieve analyse van DNA inhoud in een Pico Green assay. De ventrikels van CECM harten tonen een significante afname in DNA-gehalte in vergelijking met natief ventrikels. De DNA gemeten waarden van dit protocol worden waargenomen bij of onder de 50 ng / mg standaard ontcelde weefsels.
Figuur 7. DNA fragmentgrootte, zoals bepaald door ethidium bromide gel, vertoonden weinig resterende DNA in de ontcelde ventrikels in vergelijking met een blaas matrix (UBM) standaard.
Figuur 8. Hematoxyline en eosine kleuring toonde volledige verwijdering van nucleair materiaal uit de ventrikels na voltooiing van de decellularisatie protocol.
Figuur 9. Masson trichroomkleuring van A) en natief B) ontcelde ventrikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige studie beschreven methodologie voor consistente en efficiënte decellularisatie van een varkens hart. Het protocol was een modificatie van een eerder gepubliceerde report 1 en opgenomen langere blootstelling aan verhoogde druk en debiet die meer herhaalbare resultaten ontvangen. De resulterende ontcelde weefsel voldeed aan alle gepubliceerde criteria voor een succesvolle decellularisatie van weefsel 2. Frequente veranderingen oplossing werden uitgevoerd om de herinvoering van celmateriaal beperken tot het weefsel en de duur van blootstelling aan elke ontcelling middel werd geminimaliseerd tot nadelige effecten op de ECM verminderen. Tijdens de beginfase van het protocol werd de perfusiesnelheid geleidelijk wordt om het weefsel en maken hogere stroomsnelheden in de latere stadia van het protocol. Zonder conditionering het weefsel in de beginfase, de vasculatuur van het hart kan scheuren, waardoor perfusie van het hart onmogelijk. De protocol werd als gevolg van de efficiëntie worden gebruikt, en geen claims zijn gemaakt om zijn superioriteit ten opzichte van andere protocollen. De precieze samenstelling van decellularisatie agenten en de tarieven van de perfusie is denkbaar worden gevarieerd om een protocol opleveren met betere mechanische of biologische kenmerken, maar de algemene beginselen voor de levering van de agenten naar het hart zijn van toepassing.
Het behoud van de natieve driedimensionale structuur van het hart werd toegeschreven aan verschillende procedures uitgevoerd binnen de decellularisatie protocol. Eerst werd het weefsel uitgesneden en bevroren bij aankomst. Bevriezing bevorderd cellysis en was belangrijk voor voorbehandeling het weefsel voor de perfusie cycli. Het weefsel werd grondig geïnspecteerd delen en 2 cm intact intact aorta boven de aortaklep. Indien pericardium of epicardium werd gesneden is het orgel weggegooid, omdat het perfusaat niet bereikt stroomafwaarts gelegen gebieden van het hart, en het hart werd niet volledig ontcelde.Vervolgens werd het weefsel volledig ontdooid in type I water voor gebruik. Het water mag het weefsel te ontspannen als het ontdooid en ook geholpen de verwijdering van de achtergebleven bloedstolsels in het hart. Ten slotte de buis werd ingebracht, werd ervoor gezorgd dat de aortaklep intact zodat vormde een waterdichte afdichting rond de buis, zodat een goede druk werd en dat de oplossing de kransslagaders ingevoerd.
Na elke decellularisatie protocol was voltooid, werd een reeks kwaliteitscontrole uitgevoerd om volledige verwijdering van celmateriaal waarborgen. De huidige studie protocol nagegaan of de histologische kleuring voor celkernen geëlimineerd, bleek dat minder dan 50 ng van DNA aanwezig was per mg drooggewicht van het weefsel, en dat DNA minder dan 200 bp in grootte 6. Eerder gepubliceerde werkwijzen voor cardiale ontcelling toonden soortgelijke niveaus van ontcelling in DNA kleuring en kwantificering2,5,9,10. Volledige ontcelling werd bereikt in deze studies met vergelijkbare behandelingen van enzymen en detergenten. Echter, in deze studie, de duur van blootstelling aan elke chemische verhoogd, er meer oplossing verandert en de stroomsnelheden verhoogd. Dit protocol verhoogden ook de lengte van chemische spoelingen, kan leiden tot een efficiëntere verwijdering van chemische residuen uit de extracellulaire matrix.
Hercellularisatie van gedecellulariseerde rattenharten met cardiale specifieke cellen heeft opgeleverd veelbelovende resultaten in vitro 2,5. Whole orgaanperfusie ontcelling toegestaan voor onderhoud van het natieve vasculatuur, wat essentieel is in hercellularisatie van het weefsel. De inherente groeifactoren, matrixeiwitten en driedimensionale vezelarchitectuur ook bevorderd juiste celhechting, migratie en signalering te reconstrueren contractiele myocardium. Varkens cardiale extracellular matrix zal moeilijker recellularize door de omvang van de steiger en het aantal cellen noodzakelijk voor een goede cel en voedingsstoffen transport. Kan echter pleisters gesneden uit de cardiale matrix nuttig zijn voor in vivo toepassingen. Meerdere studies hebben aangetoond dat voordeel van een site-specifieke matrix voor reconstructie van beschadigd weefsel in diermodellen 11-13. Dus een extracellulaire matrix scaffold uit hartweefsel is wenselijk myocardiale reconstructie toepassingen. De inherente architectuur van het hartweefsel kan opleveren voordelen een scaffold ECM afgeleid van een ander orgaan of een kunstmatige biomateriaal. Een plaatsspecifieke scaffold kunnen ondersteunen gastheercel infiltratie en via een constructieve remodeling reactie, in tegenstelling tot littekenvorming. Tot op heden hebben cardiale ECM vlekken onderzocht in vivo defect geregistreerd in de myocardiale wand 14 reconstrueren. Toekomst studies worden uitgevoerd in vitro het vermogen van de steiger hartcellen gezaaid en gekweekt op de matrix te buigen over. De hierin beschreven werkwijzen kunnen ook voor ontcelling van mensenharten.
Tot slot, varkens hart decellularisatie mogelijk is en de methoden zijn straight-forward. Vervolg onderzoek van dit materiaal zal inzicht geven in de mogelijkheden voor klinisch gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Gilbert was op de Scientific Advisory Board van ACell, Inc terwijl het onderzoek werd gedaan, en sinds kort de VP van onderzoek en ontwikkeling. ACell, Inc verkoopt urineblaas matrix en heeft geen commercieel belang in de huidige studie.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Brogan Gast, Michelle Weaver, en Kristen Lippert erkennen. De financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door NIH Grant R03EB009237, evenals NIH-beurzen voor opleiding T32EB001026-06 van het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering en T32HL076124-05.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F.
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
