Summary
Ein Verfahren, um schnell und vollständig zu entfernen zellulären Komponenten aus einer intakten Schweineherz durch retrograde Perfusion wird beschrieben. Dieses Verfahren ergibt eine ortsspezifische kardialen extrazellulären Matrix Gerüst, das das Potential für die Verwendung in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen hat.
Abstract
Perfusion-basierte ganzen Organs Dezellularisierung hat kürzlich Interesse im Bereich des Tissue Engineering als Mittel zur ortsspezifischen extrazellulären Matrix Gerüsten erstellen, gewann unter weitgehender Erhaltung der einheimischen Architektur des Gerüsts. Bisher hat dieser Ansatz in einer Vielzahl von Organsysteme verwendet worden, einschließlich Herz, Lunge, Leber und 1-5. Vorherige Verfahren zur Dezellularisierung Gewebe ohne eine leicht zugängliche Gefäßnetz haben bei längerer Exposition von Gewebe, Lösungen von Detergentien, Säuren oder enzymatische Behandlungen als Mittel, um die zellulären und atomare Bestandteile aus dem umgebenden extrazellulären Umgebung 6-8 entfernen gestützt. Allerdings ist die Wirksamkeit dieser Verfahren gelenkig auf der Fähigkeit der Lösungen das Gewebe durch Diffusion eindringen. Im Gegensatz dazu Perfusion von Organen durch die natürliche Gefäßsystem wirksam reduziert den Diffusionsweg und erleichtert den Transport von decellularizatiMittel zum in das Gewebe und zellulären Komponenten aus der Gewebe. Hier beschreiben wir eine Methode, um vollständig decellularize eine intakte Schweine Herzen durch koronare retrograde Perfusion. Das Protokoll ergab ein voll dezellularisierte kardialen extrazellulären Matrix (ECM-c) Gerüst mit der dreidimensionalen Struktur des Herzens intakt. Unser Verfahren verwendet eine Reihe von Enzymen, Detergentien und Säuren mit hypertonischen und hypotonischen Spülungen gekoppelt in der Lyse und Entfernung von Zellen unterstützen. Das verwendete Protokoll eine Trypsin-Lösung, um Zellen von der Matrix durch Triton X-100 und Natriumdesoxycholat Lösungen gefolgt, um die Entfernung von Zellmaterial unterstützen lösen. Die beschriebene Protokoll verwendet auch Perfusion Geschwindigkeiten von mehr als 2 l / min für verlängerte Zeiträume. Die hohe Strömungsgeschwindigkeit, mit der Lösung Änderungen erlaubt den Transport von Agenten des Gewebes ohne Kontamination von Zelltrümmern und gekoppelt gewährleistet effektive Spülung des Gewebes. Das beschriebene Verfahren entfernt alle Kernmaterial von native porcinen Herzgewebe, die Schaffung eines ortsspezifischen kardialen ECM Gerüst, das für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden kann.
Protocol
Ein. Tissue Vorbereitung und Versuchsaufbau
- Ernte Schweinen Organ unmittelbar nach Euthanasie aus einem Schlachthof oder Forschungseinrichtung und spülen Sie überschüssiges Blut. Schneiden Sie die Herzen von überschüssigem Fett und Gewebe, halten die Vorhöfe und der Aorta intakt. Trim entfernt Fett, um die Lungenarterie aus der Aorta zu trennen. Wenn es irgendwelche Schnitte im Gewebe sind, entsprechend zu verwerfen.
- Wickeln Sie jedes Herz einzeln in Freezer Paper und speichern alle Gewebe in einem -80 ° C Gefrierschrank für mindestens 24 Stunden, um eine vollständige Einfrieren zu gewährleisten.
- Wenn Sie bereit sind für den Einsatz (in der Regel weniger als 3 Monate), Tauwetter ein intaktes gefrorenes Schweinesperma Herz in Type 1 Wasser über Nacht in einem 4-Liter-Becher bei 4 ° C getaucht
- Nachdem das Herz vollständig aufgetaut ist, klopfen die Herzen trockenen, wiegen das Herz, und das Gewicht aufgezeichnet. Das Herz eines Marktes Gewicht Schwein sollte wiegen etwa 375-450 g.
- Schließen Sie Größe 18 Masterflex Schlauch mit dem ¼ "Ende einer Stacheldraht Druckminderer. Legen Sie die Stacheldraht Druckminderer undSchlauch innerhalb der Aorta. Platz 2 Schlauchschellen oder sichere Kabelbinder um die Aorta, knapp unterhalb des Truncus brachiocephalicus. Der Druckminderer und Schlauch muss über der Aortenklappe bleiben, so die Koronararterien perfundiert können (Abbildung 1).
- Verwenden Sie eine 30 oder 60-ml-Spritze, um den Schlauch mit Typ I Wasser zu füllen. Legen Sie den Schlauch in der Patrone eines Masterflex Schlauchpumpe in seiner ungefähren Mittelpunkt. Submerge der Zufluss Ende des Schlauches in den Boden eines 4 L-Becherglas mit 2,5 l Wasser gefüllt und sichern den Schlauch.
- Legen Sie die Herzen im Becher mit Wasser gefüllt, und prime die Pumpe Luftblasen zu entfernen. Wenn Blasen beobachtet werden, die von der Aorta, wo der Schlauch eingelegt wird, kann die Aorta neu positioniert oder mit zusätzlichen Bindungen befestigt werden. Eine luftdichte Dichtung ist wichtig, um eine angemessene Druck während der Dezellularisierung Verfahrens (Abbildung 2) zu halten.
- Legen Sie die 4 L Becherglas mit 3 L einer 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 Lösung auf Rührplatte und erwärmen auf 37 ° C bei der Vorbereitung der Dezellularisierung Prozess.
2. Tissue Spülen
- Die Pumpe auf einer Strömungsgeschwindigkeit von 400 ml / min, wobei auf die korrekte Größe Schlauch ausgewählt ist. Spülen Sie das Herz mit Typ I Wasser für 15-25 min. Da die Pumpe gestartet wird, sollte das Herz anschwellen und effuse Blut aus den Herzkammern. Frische Lösung sollte alle 5-10 min substituiert sein kann, oder als bezogen auf die Menge an Blut aus dem Herzen entnommen benötigt. Wenn Blut nicht vom Herzen ausgegossen, passen die Schläuche und Klemmen wie nötig.
- Stoppen Sie die Pumpe und übertragen das Herz zu einem separaten Becherglas mit 2X Phosphat gepufferten Saline (PBS). Nachdem der Schlauch in der Lösung eingetaucht ist, starten Sie die Pumpe und erhöht den Durchfluss auf 700 ml / min. Das Herz sollte in-Lösung für 15 min bleiben, verändert die Lösung alle 5 min. Jede Lösung Wandel erfordert die Pumpe vorübergehend gestoppt werden, während das Gewebe und Schläuche bewegtauf den neuen Becherglas.
- Übertragen Sie das Herz I Wasser für 10 min Geben und erhöhen den Durchfluss auf 750 ml / min.
3. Dezellularisierung und Solution Perfusion
- Übertragen Sie die Herzen in das Becherglas mit 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 bei 37 ° C. Erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 1.200 ml / min und starten Sie die Pumpe. Verwenden Sie einen Rührstab am Boden des Bechers zur Lösung im Becherglas zirkulieren platziert. Das Herz sollte im Bereich von 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3-Lösung bei 37 ° C für insgesamt drei Stunden bleiben. Nach 1 Stunde erhöht die Drehzahl auf 1500 ml / min. Nach einer weiteren Stunde, erhöhen die Pumpendrehzahl bis 1.800 ml / min. Das Gewebe wird langsam auf erhöhte Geschwindigkeiten Perfusion zur Konditionierung des Gewebes ausgesetzt und verhindern Ruptur der Gefäße. Das Herz wird anschwellen und fast doppelt so groß bei diesem Schritt des Protokolls. Das Gewebe verliert seine natürliche Farbe, fortschreitend von den Vorhöfen zu den Scheitelpunkt gesamten the-Protokoll (Abbildung 3).
- Nach jeder Lösung Perfusion wird ein zweistufiger Spülen durchgeführt wird, um Zelltrümmer, chemischer Rest ist, und Hilfsmittel Zelllyse zu entfernen. Jedes Spülen besteht aus einem 10 min Spülen in Typ I Wasser durch eine 10 min abspülen mit 2X PBS-Lösung bei Raumtemperatur. Jede Wäsche besteht in der Entfernung von Lösung aus dem ursprünglichen Becherglas Zugabe Spüllösungen, und Zirkulieren des Perfusats in den Becher mit dem untergetauchten Herzens. Nach 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3-Lösung, Wasser bei perfuse 1900 ml / min und dann perfundieren 2X PBS auf 1950 ml / min.
- Übertragen das Herz zu einer Lösung von 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN3 bei Raumtemperatur. Erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 2.000 ml / min und perfuse Lösung für eine Stunde. Entfernen Sie die Lösung aus dem Becherglas und ersetzen mit frischer Lösung, erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 2100 ml / min, und versorgen die frische Lösung für eine weitere Stunde und eine Hälfte, womit sich die gesamte Zeit in3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 bis 2,5 Stunden.
- Spülen Sie das Gewebe in Typ I Wasser bei 2150 ml / min und 2X PBS bei 2180 ml / min für jeweils 10 Minuten.
- Übertragen das Herz auf eine 4% Natriumdesoxycholat Lösung bei Raumtemperatur. Erhöhen der Pumpgeschwindigkeit, um 2200 ml / min und perfuse Lösung für 3 hr.
- Spülen des Gewebes in Wasser bei Typ I und 2X PBS bei 2200 ml / min für 15 Minuten jeweils, Ändern der Lösungen nach 5-10 min für jede Lösung. Die beschriebenen Schritte Perfusion kann über mehrere Tage durch Durchführen der Spülschritt zweimal und Speichern des Herzens mit aufgesetzter Schlauch über Nacht bei 4 ° C gespalten werden, und eingetaucht in Typ I Wasser.
- Am folgenden Tag, führen Sie eine 5 min mit Typ I Wasser spülen bei 750 ml / min, gefolgt von einer 5 min Spülen in 1X PBS bei 1.500 ml / min. Das Protokoll kann dann bei der beschriebenen Strömungsrate in der richtigen Lösung fortgesetzt.
4. Desinfektion und Endfertigung
- Übertragen Sie das Herz einer 0,1% peracessigsäure / 4% Ethanol-Lösung und perfuse Lösung für 1,5 h bei 2200 ml / min.
- Die Endspülungen für das Gewebe alle auf 2200 ml / min durchgeführt. Perfundieren des Gewebes mit 1X PBS für 15 min, gefolgt von zwei Waschungen in 5 min Typ I Wasser. Diese Reihe von Spülungen wird noch einmal wiederholt, um die Lösung Perfusion abzuschließen.
- Schalten Sie die Pumpe aus und entfernen Sie das Herz aus der Lösung, um das Herz zu entleeren. Schneiden Sie die Bindungen aus der Aorta, entfernen Sie alle Schläuche, und legen Sie das Herz in ein leeres Becherglas für 1 Stunde abtropfen lassen. Überschüssige Flüssigkeit wird müssen regelmäßig entleert werden. Legen Sie das Herz auf eine saugfähige Unterlage vollständig entleeren das Herz (Abbildung 4).
- Nachdem der größte Teil des Wassers entfernt wird, das Gewicht aufgezeichnet des kardialen extrazellulären Matrix (ECM-C). Das Herz kann erwartet werden ca. 20-25% des ursprünglichen Gewichts während der Dezellularisierung Prozess verliert.
- Sezieren die rechte und linke Herzkammer, sowie die ventrikuläre Septum zur DNA quantificatiauf und histologischen Bearbeitung, um zu bestätigen komplette Dezellularisierung des Gewebes (Abbildung 5).
- Einfrieren der C-ECM bei -80 ° C für mindestens 2 h vor der Lyophilisation.
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Representative Results
Die Wirkung der Dezellularisierung auf ganze Schweineherzen variiert natürlich aufgrund der Unterschiede in der Größe, Drücke und Behälteranordnung. Daher wird die genaue Zusammensetzung der extrazellulären Matrix abgeleiteten Gerüsten nicht dasselbe vom Herzen zum Herzen. Der Abschluss der beschriebenen Protokoll erbringt ein Herz, das weiße oder durchscheinende zeigt an, den Verlust an Zellmaterial. Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass ein Gewebe angesehen werden "dezellularisierte" auf die Kombination von einigen weiteren quantitativen Parameter 8 basieren. Eine erfolgreiche Dezellularisierung Protokoll wird eine Matrix mit weniger als 50 ng doppelsträngige DNA pro mg Gewebe (Abbildung 6) zu erzeugen. Um eine Immunantwort nach Implantation der Matrix zu vermeiden, sollte die verbliebenen DNA enthalten auch weniger als 200 Basenpaaren (Abbildung 7). Um diese Ergebnisse zu bestätigen, sollten Hämatoxylin und Eosin Färbung zeigen die Abwesenheit von nuklearenAnfärben in repräsentative Abschnitte der Ventrikel und ventrikulären Septums (Abbildung 8). Masson Trichrome bestätigt weiterhin den Verlust von Herzmuskel Bündeln und Retention von Kollagen Netze (Abbildung 9).
Abbildung 1. Widerhaken Ende des Schlauchs in die Aorta des natürlichen Herzens eingefügt. Der Schlauch muss mit Schlauchschellen oder Kabelbinder über der Aortenklappe gesichert werden, um die Perfusion durch die Koronararterien zu gewährleisten.
Abbildung 2. Das Herz wird in Wasser in einem Becherglas 4L und Luftblasen untergetauchten müssen aus der Rohrleitung entfernt werden. Wenn Blasen beobachtet werden, die sich aus der Aorta in der Nähe der Schläuche, müssen zusätzliche Verbindungen verwendet werden, um den Schlauch an t sichern er Aorta, um ausreichenden Druck in dem Gewebe zu halten.
Abbildung 3. Als Lösungen durch die Koronararterien perfundiert werden, wird das Herz verliert seine native Farbe, fortschreitend von den Vorhöfen auf die Herzspitze und lokalisierte um die Koronararterien.
Abbildung 4. Nach Beendigung des Desinfektions-und Spülschritte des Protokolls, der Schlauch wird entfernt und das Herz wird auf einem saugfähigen Kissen platziert, damit das überschüssige Wasser abfließen kann des Herzens. Dies gewährleistet eine präzise Messung beim Wiegen das Gewebe und erlaubt auch das Gewebe vor dem Schneiden zu entspannen.
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Abbildung 5. Der linke Ventrikel (LV), rechter Ventrikel (RV) und Ventrikelseptum sind alle aus dem Herzen dezellularisierte zur histologischen Verarbeitung, Gefrieren und Lyophilisierung und DNA-Quantifizierung entfernt.
Abbildung 6. Quantitative Analyse von DNA-Material mit einem Pico Grün Assay. Die Ventrikel aus CECM Herzen zeigen eine signifikante Abnahme der DNA-Gehalt als in den einheitlichen Ventrikel verglichen. Die DNA-Werte aus diesem Protokoll werden beobachtet bei oder unterhalb der 50 ng / mg Standard für dezellularisiertes Gewebe beobachtet.
Abbildung 7. DNA-Fragment Größe, wie ethidiu ermitteltm bromide Gel, zeigte wenig Rest-DNA in den dezellularisierten Herzkammern, wenn sie einer Harnblase Matrix (UBM) Standard verglichen.
Abbildung 8. Hämatoxylin und Eosin-Färbung zeigte eine vollständige Entnahme von Kernmaterial aus den Ventrikeln nach Abschluss der Dezellularisierung Protokoll.
Abbildung 9. Masson Trichromfärbung A) native und B) dezellularisierten Ventrikels.
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Discussion
Die aktuelle Studie beschriebene Methodik für eine konsistente und effiziente Dezellularisierung eines Schweine Herzen. Das Protokoll war eine Änderung an einem zuvor veröffentlichten Bericht 1 und enthalten längerer Exposition zu fließen und erhöhtem Druck, die mehr wiederholbare Ergebnisse geliefert. Die resultierende dezellularisierten Gewebe erfüllt alle veröffentlichten Kriterien für eine erfolgreiche Dezellularisierung von Gewebe 2. Häufige Änderungen Lösung wurden durchgeführt, um die Wiedereinführung von Zellmaterial auf das Gewebe zu begrenzen, und die Dauer der Exposition gegenüber jedem Dezellularisierung Mittel wurde minimiert, um negative Auswirkungen auf die ECM reduzieren. Während der Anfangsphase des Protokolls wurde die Perfusionsrate allmählich zur Konditionierung des Gewebes erhöht und erlauben höhere Fließgeschwindigkeiten während der späteren Stufen des Protokolls. Ohne Konditionierung des Gewebes in den frühen Stadien kann das Gefäßsystem des Herzens Reißen, wodurch die Durchblutung des Herzens unmöglich. Der Prototypcol wurde aufgrund seiner Leistungsfähigkeit, verwendet und keine Ansprüche an seine Überlegenheit über andere Protokolle gemacht. Die genaue Zusammensetzung der Dezellularisierung Agenten und Preise der Perfusion kann möglicherweise verändert werden, um ein Protokoll mit besseren mechanischen oder biologischen Eigenschaften zu erhalten, aber die allgemeinen Grundsätze für die Lieferung von den Agenten des Herzens gelten.
Die Erhaltung der nativen dreidimensionalen Struktur des Herzens wurde auf mehrere Verfahren in der Dezellularisierung Protokoll durchgeführt zugeschrieben. Zuerst wurde das Gewebe zu befreien und eingefroren bei Ankunft. Einfrieren gefördert Zelllyse und war für Vorkonditionieren des Gewebes für die Perfusion Zyklen wichtig. Das Gewebe wurde gründlich Schnitte und 2 cm intakte intakten Aorta überlegen der Aortenklappe inspiziert. Wenn überhaupt Epikard Perikard oder geschnitten wurde, wurde das Organ verworfen, da das Perfusat nicht erreichte stromabwärtigen Regionen des Herzens, und das Herz wurde nicht vollständig dezellularisiert.Als nächstes wurde das Gewebe vollständig in Typ I Wasser vor der Verwendung aufgetaut. Das Wasser erlaubt das Gewebe zu entspannen, wie es aufgetaut und auch begünstigt die Entfernung von restlichem Blutgerinnsel innerhalb des Herzens. Schließlich wird, wie das Rohr eingeführt wurde, wurde darauf geachtet, dass die Aortenklappe intakt blieb so dass er eine wasserdichte Abdichtung rund um den Schlauch gebildet, so dass eine geeignete Druck gehalten wurde und daß die Lösung in die Koronararterien eingesetzt.
Nachdem jede Dezellularisierung Protokoll abgeschlossen war, wurden eine Reihe von Maßnahmen zur Qualitätskontrolle durchgeführt, um eine vollständige Entfernung von Zellmaterial gewährleisten. Die derzeitige Studie verifiziert, dass das Protokoll histologischen Färbung für Zellkerne eliminiert, zeigte, dass weniger als 50 ng DNA vorliegenden pro mg Trockengewicht des Gewebes war, und dass eine beliebige DNA weniger als 200 bp in der Größe 6 war. Zuvor veröffentlichte Methoden zur kardialen Dezellularisierung zeigten ähnliche Ebenen Dezellularisierung in DNA-Färbung und Quantifizierung2,5,9,10. Komplette Dezellularisierung wurde in diesen Studien mit ähnlichen Behandlungen von Enzymen und Detergentien erreicht. Jedoch in der vorliegenden Studie, die Dauer der Exposition gegenüber jeder chemischen erhöht wurde, gab es mehr Lösung ändert, und die Strömungsraten wurden erhöht. Das vorliegende Protokoll erhöhte auch die Länge der chemischen Spülungen, was möglicherweise zur effizienteren Entfernung von chemischen Rückständen aus der extrazellulären Matrix.
Rezellularisierung dezellularisierten Rattenherzen mit kardialen bestimmte Zellen hat viel versprechende Ergebnisse in vitro 2,5 ergab. Whole Organperfusion Dezellularisierung zur Wartung des nativen Vaskulatur, die kritisch Rezellularisierung des Gewebes erlaubt. Die inhärenten Wachstumsfaktoren, Matrixproteine, und dreidimensionale Faserarchitektur auch ordnungsgemäße Zellanheftung, Migration und Signalisierung zu rekonstituieren kontraktilen Myokardgewebe gefördert. Porcine kardialen extrazellulärenlar Matrix wird schwieriger zu recellularize aufgrund der Größe des Gerüsts und der Anzahl der Zellen die für eine einwandfreie Zellkommunikation und Nährstofftransport. Jedoch kann Patches vom kardialen Matrix geschnitten nützlich für die in vivo-Anwendungen. Mehrere Studien haben den potentiellen Vorteil der Verwendung einer ortsspezifischen Matrix zur Rekonstruktion von beschädigten Gewebes in Tiermodellen 11-13 gezeigt. Somit ist eine extrazelluläre Matrix Gerüst von Herzgewebe abgeleitet wünschenswert myokardialen Rekonstruktion Anwendungen. Die inhärente Architektur des Herzgewebes kann Vorteile gegenüber einer ECM Gerüst aus einem anderen Organ oder einem künstlichen Biomaterial abgeleitet präsentieren. Eine ortsspezifische Gerüst darf unterstützt Host-Zell-Infiltration und fördern eine konstruktive Umgestaltung Antwort, um die Bildung von Narbengewebe entgegen. Bisher wurden kardialen ECM Patches in vivo untersucht, um einen Defekt in dem myokardialen Wand 14 angelegt rekonstruieren. Zukünftige StudierendeGesenke werden in vitro durchgeführt werden, um die Fähigkeit des Gerüsts zu Herzzellen ausgesät und auf der Matrix kultiviert unterstützt untersuchen. Die hierin beschriebenen Verfahren können auch für Dezellularisierung von menschlichen Herzen.
Zusammenfassend ist Schweineherz Dezellularisierung möglich und die Methoden sind geradlinig. Fortlaufende Untersuchung dieses Materials wird Einblick in das Potential für den klinischen Einsatz bereitzustellen.
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Disclosures
Dr. Gilbert war auf dem Scientific Advisory Board bei ACELL, Inc. während der Studie getan wurde, und vor kurzem wurde die VP für Forschung und Entwicklung. ACELL, Inc. vertreibt Harnblase Matrix und hat keine kommerziellen Interessen in der vorliegenden Studie.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Brogan Gast, Michelle Weber und Kristen Lippert anzuerkennen. Die Finanzierung dieser Studie wurde durch NIH Grant R03EB009237 sowie NIH Ausbildung Grants T32EB001026-06 aus dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering und T32HL076124-05 zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
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