Summary
Un metodo per rimuovere rapidamente e completamente componenti cellulari da un cuore suino intatta attraverso perfusione retrograda viene descritto. Questo metodo fornisce uno specifico sito cardiaca matrice extracellulare ponteggio che ha il potenziale per l'utilizzo in molteplici applicazioni cliniche.
Abstract
Perfusione basata decellularizzazione intero organo ha recentemente guadagnato interesse nel campo dell'ingegneria dei tessuti come mezzo per creare sito-specifici scaffold della matrice extracellulare, mentre gran parte conservando l'architettura nativa del ponteggio. Ad oggi, questo approccio è stato utilizzato in una varietà di sistemi di organi, compreso il cuore, polmone, fegato e 1-5. Decellularizzazione metodi precedenti per tessuti senza una rete facilmente accessibile vascolare hanno invocato esposizione prolungata del tessuto a soluzioni di detergenti, acidi, o trattamenti enzimatici come mezzo per rimuovere i componenti cellulari e nucleari dall'ambiente circostante extracellulare 6-8. Tuttavia, l'efficacia di questi metodi incernierato sulla capacità delle soluzioni di permeare il tessuto tramite diffusione. In contrasto, la perfusione di organi attraverso il sistema vascolare naturale ridotto efficacemente la distanza di diffusione e trasporto facilitato di decellularizatisugli agenti nel tessuto e componenti cellulari dal tessuto. Qui, si descrive un metodo per decellularize pienamente un cuore intatto suino attraverso perfusione coronarica retrograda. Il protocollo ha prodotto completamente decellularizzato cardiaca matrice extracellulare (ECM-c) scaffold con la struttura tridimensionale del cuore intatto. Il nostro metodo utilizzato una serie di enzimi, detergenti e acidi accoppiato con risciacqui ipertoniche e ipotoniche per facilitare la lisi delle cellule e la rimozione. Il protocollo utilizzato una soluzione di tripsina per staccare celle della matrice seguito da Triton X-100 e sodio desossicolato soluzioni per aiutare nella rimozione di materiale cellulare. Il protocollo descritto utilizza anche velocità di perfusione maggiore di 2 L / min per lunghi periodi di tempo. L'elevata portata, accoppiato con soluzione cambia accettati trasporto di agenti al tessuto senza contaminazione di detriti cellulari e assicurato efficace risciacquo del tessuto. Il metodo descritto rimosso tutto il materiale nucleare da native suina tessuto cardiaco, creando un sito-specifico cardiaca ECM scaffold che può essere utilizzato per una varietà di applicazioni.
Protocol
1. Preparazione di tessuto ed esperimento di installazione
- Harvest organo suina immediatamente dopo l'eutanasia da un impianto di macellazione o di ricerca e risciacquare sangue in eccesso. Tagliare il cuore di grasso in eccesso e tessuto, mantenendo gli atri e aorta intatto. Tagliare via il grasso per separare l'arteria polmonare dall'aorta. Se ci sono dei tagli nel tessuto, eliminare in modo appropriato.
- Avvolgere ogni cuore singolarmente in carta freezer e memorizzare tutti i tessuti in un congelatore a -80 ° C per almeno 24 ore per garantire congelamento completo.
- Quando si è pronti per l'uso (di solito meno di 3 mesi), scongelare un cuore intatto suino congelato di tipo 1 acqua per una notte immersi in un bicchiere 4 L a 4 ° C.
- Dopo che il cuore è completamente scongelato, accarezzare il cuore arido, pesare il cuore, e registrare il peso. Il cuore di un maiale del peso di mercato dovrebbe pesare circa 375-450 g.
- Collegare taglia 18 tubo Masterflex alla fine ¼ "di un riduttore spinato. Inserire il riduttore spinato etubo dentro l'aorta. Luogo 2 fascette o fascette sicure in tutto il aorta, appena sotto il tronco brachiocefalico. Il riduttore e la tubazione deve rimanere al di sopra della valvola aortica, così le arterie coronarie possono essere perfuso (Figura 1).
- Utilizzare una siringa da 30 o 60 ml per riempire il tubo con acqua di tipo I. Inserire il tubo all'interno della cartuccia di una pompa a rulli Masterflex nel suo punto medio approssimativo. Immergere l'estremità del tubo di afflusso nel fondo di un bicchiere 4 L riempito con 2,5 L di acqua e fissare il tubo.
- Posizionare il cuore nel becher riempito con acqua, e adescare la pompa per rimuovere le bolle d'aria. Se si osservano bolle proveniente dalla aorta dove è inserito il tubo, l'aorta può essere necessario riposizionare o fissato con legami aggiuntivi. Una chiusura ermetica è importante per mantenere la pressione necessaria durante il processo di decellularizzazione (Figura 2).
- Posizionare i 4 becher contenente L 3 L di un 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 soluzione sul piatto mescolare e riscaldare a 37 ° C, in preparazione del processo di decellularizzazione.
2. Tissue Risciacqui
- Impostare la pompa ad una portata di 400 ml / min, assicurando che la misura del tubo sia selezionata. Lavare il cuore di tipo I acqua per 15-25 minuti. Poiché la pompa viene avviata, il cuore deve gonfiarsi e effonderà sangue dai ventricoli. Soluzione fresca dovrebbe essere sostituito ogni 5-10 minuti, o quando necessario sulla base della quantità di sangue prelevato dal cuore. Se il sangue non è effuso dal cuore, regolare il tubo e morsetti sufficiente.
- Arrestare la pompa e trasferire il cuore in un becher separato riempito di 2X Phosphate Buffered Saline (PBS). Dopo il tubo viene immerso in soluzione, avviare la pompa e aumentare il flusso di 700 ml / min. Il cuore dovrebbe rimanere in soluzione per 15 minuti, cambiando la soluzione ogni 5 min. Ogni cambiamento soluzione richiede la pompa da arrestare temporaneamente mentre il tessuto e il tubo viene spostatonel becher nuovo.
- Trasferire il cuore di tipo I di acqua per 10 min e aumentare il flusso di 750 ml / min.
3. Decellularizzazione e soluzione di perfusione
- Trasferire il cuore nel becher contenente 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 a 37 ° C. Aumentare la velocità della pompa a 1.200 ml / min e avviare la pompa. Utilizzare un agitatore posizionato sul fondo del bicchiere per far circolare la soluzione nel becher. Il cuore deve rimanere nella Trypsin/0.05% 0,2% EDTA/0.05% NaN 3 soluzione a 37 ° C per un totale di tre ore. Dopo 1 h, aumentare la velocità della pompa a 1.500 ml / min. Dopo un'altra ora, aumentare la velocità della pompa a 1800 ml / min. Il tessuto è sottoposto a lenta velocità di perfusione aumento alla condizione del tessuto e prevenire la rottura dei vasi. Il cuore si gonfiano e quasi raddoppia durante questa fase del protocollo. Il tessuto perderà il suo colore naturale, procedendo dagli atri ai all'apice tutto °e protocollo (Figura 3).
- Dopo ogni soluzione di perfusione, in due fasi di risciacquo viene eseguita per rimuovere i detriti cellulari, residui chimici, e lisi cellulare aiuto. Ogni lavaggio è costituito da un risciacquo 10 min in acqua di tipo I seguita da 10 min risciacquo con soluzione 2X PBS a temperatura ambiente. Ogni lavaggio consiste nella rimozione della soluzione dal recipiente originale, aggiungere soluzioni di risciacquo, e la circolazione del perfusato nel becher contenente il cuore sommerso. Dopo il 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 soluzione, acqua profumato a 1.900 ml / min e quindi perfondere 2X PBS a 1950 ml / min.
- Trasferire il cuore ad una soluzione di 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 a temperatura ambiente. Aumentare la velocità della pompa a 2.000 ml / min e profumato soluzione per un'ora. Rimuovere la soluzione dal bicchiere e sostituire con soluzione fresca, aumentare la velocità della pompa a 2100 ml / min, e perfondere la soluzione fresca per un'altra ora e mezzo, portando il tempo totale in3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3-2,5 ore.
- Risciacquare il tessuto in acqua di tipo I a 2150 ml / min e 2X PBS a 2180 ml / min per 10 min.
- Trasferire il cuore di una soluzione di sodio desossicolato 4% a temperatura ambiente. Aumentare la velocità della pompa a 2200 ml / min e profumato soluzione per 3 ore.
- Risciacquare il tessuto in acqua a tipo I e 2X PBS a 2.200 ml / min per 15 min ciascuna, cambiando le soluzioni dopo 5-10 minuti per ogni soluzione. Le fasi di perfusione descritti possono essere suddivisi su più giorni eseguendo la fase di lavaggio due volte e memorizzazione del cuore con tubo attaccato notte a 4 ° C e sommersa in acqua Tipo I.
- Il giorno seguente, eseguire un 5 min risciacquo con acqua di tipo I a 750 ml / min, seguito da un risciacquo 5 min in 1X PBS a 1.500 ml / min. Il protocollo può essere continuato con la portata descritto nella soluzione adeguata.
4. Disinfezione e trattamento finale
- Trasferire il cuore ad un Perac 0,1%ETIC acido / soluzione di etanolo al 4% e la soluzione profumato per 1,5 ore a 2.200 ml / min.
- I risciacqui finali per i tessuti sono tutti eseguiti in 2.200 ml / min. Perfondere il tessuto con 1X PBS per 15 minuti, seguito da due lavaggi 5 min in acqua di tipo I. Questa serie di risciacqui viene ripetuta ancora una volta, per completare la procedura di perfusione soluzione.
- Spegnere la pompa e rimuovere il cuore da soluzione di scendere al cuore. Tagliare i legami della aorta, rimuovere tutti i tubi, e posizionare il cuore in un bicchiere vuoto a sgocciolare per 1 ora. Liquido in eccesso deve essere svuotato periodicamente. Gettare il cuore su un cuscinetto assorbente per drenare completamente il cuore (Figura 4).
- Dopo la maggior parte dell'acqua viene rimossa, registrare il peso della matrice extracellulare cardiaca (C-ECM). Il cuore può aspettare di perdere circa il 20-25% del suo peso iniziale durante il processo di decellularizzazione.
- Sezionare i ventricoli destro e sinistro, così come il setto ventricolare per DNA quantificatie il trattamento istologico per confermare decellularizzazione completa del tessuto (Figura 5).
- Congelare il C-ECM a -80 ° C per almeno 2 ore prima della liofilizzazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'effetto di decellularizzazione sui cuori suina tutto varia naturalmente a causa delle differenze in termini di dimensioni, pressioni, e la disposizione del serbatoio. Pertanto, la composizione esatta degli scaffold derivati matrice extracellulare non sarà lo stesso da cuore a cuore. Il completamento del protocollo descritto produrrà un cuore che appare bianco o traslucido, indicando la perdita di materiale cellulare. Tuttavia, è ampiamente accettato che un tessuto può essere considerata "decellularizzato" basato sulla combinazione di alcuni parametri ulteriori quantitativi 8. Un protocollo decellularizzazione successo produrrà una matrice con meno di 50 ng di DNA a doppio filamento per mg di tessuto (Figura 6). Per evitare una risposta immunitaria dell'ospite Dopo l'impianto della matrice, il DNA rimanente dovrebbe anche contenere meno di 200 paia di basi (Figura 7). Per confermare questi risultati, colorazione ematossilina e eosina dovrebbe rivelare l'assenza di nuclearecolorazione in sezioni rappresentative dei ventricoli e setto ventricolare (Figura 8). Tricromica di Masson conferma ulteriormente la perdita di fasci muscolari cardiache e ritenzione di reti collagene (Figura 9).
Figura 1. L'estremità sagomata del tubo è inserita in aorta del cuore nativo. Il tubo deve essere fissato con fascette o fascette di sopra della valvola aortica per garantire la perfusione attraverso le arterie coronarie.
Figura 2. Il cuore è immerso in acqua in un becher 4L e bolle d'aria devono essere rimosse dal tubo. Se si osservano bolle emergendo dall'aorta vicino al tubo, legami aggiuntivi devono essere utilizzati per fissare il tubo di t egli aorta per mantenere una adeguata pressione nel tessuto.
Figura 3. Come soluzioni sono perfusi attraverso le arterie coronarie, il cuore perde il suo colore originario, procedendo dagli atri all'apice del cuore e localizzata attorno coronarie.
Figura 4. Dopo il completamento della disinfezione e risciacquo fasi del protocollo, il tubo viene rimosso e il cuore è posto su un cuscinetto assorbente per consentire il deflusso dell'acqua in eccesso dal cuore. Questo assicura una misurazione accurata nel valutare il tessuto e permette anche il tessuto per rilassarsi prima sezionamento.
pg "alt =" Figura 5 "/>
Figura 5. Il ventricolo sinistro (LV), il ventricolo destro (RV), e il setto interventricolare sono tutti rimossi dal cuore decellularizzato istologico per l'elaborazione, il congelamento e liofilizzazione, e la quantificazione del DNA.
Figura 6. Analisi quantitativa del contenuto di DNA utilizzando un saggio Pico Verde. I ventricoli del cuore CECM mostrano una significativa diminuzione del contenuto di DNA rispetto ai ventricoli nativi. I valori osservati DNA da questo protocollo sono osservati o inferiore alla ng / mg 50 standard per tessuti decellularizzato.
Figura 7. Frammento di DNA dimensioni, come determinato da ethidium bromuro gel, mostrava poco DNA residuo nei ventricoli decellularizzato rispetto ad una matrice vescica urinaria (UBM) standard.
Figura 8. Ematossilina eosina e colorazione ha mostrato la completa rimozione del materiale nucleare dai ventricoli a seguito del completamento del protocollo decellularizzazione.
Figura 9. Colorazione tricromica di Masson di A) nativo e B) ventricolo decellularizzato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lo studio attuale metodologia descritta per decellularizzazione coerente ed efficace di un cuore suino. Il protocollo era una modifica a un precedentemente pubblicato con il rapporto 1, e comprendeva più l'esposizione al flusso e aumento della pressione, che ha fornito risultati più ripetibili. Il tessuto risultante decellularizzato soddisfatto tutti i criteri pubblicati per decellularizzazione successo del tessuto 2. Soluzione cambia frequenti sono stati eseguiti per limitare la reintroduzione di materiale cellulare al tessuto, e la durata di esposizione a ciascun agente decellularizzazione stato minimizzato per ridurre gli effetti negativi sulla ECM. Durante le fasi iniziali del protocollo, il tasso di perfusione è stata gradualmente aumentata per condizionare il tessuto e consentire portate superiori durante le fasi successive del protocollo. Senza condizionamento del tessuto nelle fasi iniziali, la vascolarizzazione del cuore possono rompersi, rendendo la perfusione del cuore impossibile. Il protocol è stato usato per la sua efficacia, e non sono fornite indicazioni per la sua superiorità sugli altri protocolli. L'esatta composizione di agenti decellularizzazione e dei tassi di perfusione possono ragionevolmente essere variata per ottenere un protocollo con migliori caratteristiche meccaniche o biologiche, ma i principi generali per la consegna degli agenti al cuore sono applicabili.
La conservazione del nativo struttura tridimensionale del cuore è stata attribuita a diverse procedure eseguite durante il protocollo decellularizzazione. Primo, il tessuto è stato tagliato e congelato all'arrivo. Congelamento promosso lisi cellulare ed era importante per pre-condizionamento del tessuto per i cicli di perfusione. Il tessuto è stato completamente ispezionato per tagli e 2 cm intatta aorta intatto superiori alla valvola aortica. Se qualsiasi pericardio o epicardio è stato tagliato, l'organo è stato scartato perché il perfusato non ha raggiunto regioni a valle del cuore, e il cuore non è stato completamente decellularizzato.Successivamente, il tessuto è stato completamente scongelato tipo I in acqua prima dell'uso. L'acqua ha permesso il tessuto di rilassarsi come scongelati e favorito anche la rimozione di coaguli di sangue residui all'interno del cuore. Infine, poiché il tubo è inserito, si è fatto in modo che la valvola aortica rimasta intatta in modo da formare una tenuta stagna attorno al tubo, in modo che una corretta pressione è stata mantenuta e che la soluzione immesso le arterie coronarie.
Dopo ogni protocollo decellularizzazione stata completata, una serie di misure di controllo della qualità sono stati completati per assicurare la completa rimozione di materiale cellulare. Il presente studio ha verificato che il protocollo di colorazione istologica eliminato per nuclei delle cellule, ha mostrato che meno di 50 ng di DNA era presente per mg di peso secco del tessuto, e che qualsiasi DNA era meno di 200 bp in dimensione 6. Metodi precedentemente pubblicati per decellularizzazione cardiaca ha mostrato livelli simili di decellularizzazione in colorazione del DNA e la quantificazione2,5,9,10. Decellularizzazione completa è stata compiuta in questi studi con trattamenti simili di enzimi e detergenti. Tuttavia, nel presente studio, la durata di esposizione ad ogni sostanza chimica è stata aumentata, c'erano soluzione cambia più, e le portate sono state aumentate. Il protocollo presente anche aumentato la lunghezza dei risciacqui chimiche, potenzialmente portando a più efficace rimozione dei residui chimici dalla matrice extracellulare.
Recellularization di cuori di ratto decellularizzato cardiache con cellule specifiche ha dato risultati promettenti in vitro 2,5. Intero decellularizzazione perfusione dell'organo consentito mantenimento del sistema vascolare nativa, che è fondamentale in recellularization del tessuto. I fattori di crescita intrinseci, proteine della matrice e architettura tridimensionale di fibre anche promosso attaccamento proprio cellulare, la migrazione, e alla segnalazione di ricostituire il tessuto contrattile del miocardio. Suini cardiaca extracellularelar matrice sarà più difficile recellularize a causa delle dimensioni del ponteggio e il numero di cellule necessarie per la corretta comunicazione cellulare e trasporto dei nutrienti. Tuttavia, patch tagliati dalla matrice cardiaca può essere utile per applicazioni in vivo. Diversi studi hanno dimostrato il potenziale vantaggio di utilizzare un sito-specifica matrice per la ricostruzione dei tessuti danneggiati in modelli animali 11-13. Così, una matrice extracellulare scaffold derivati da tessuto cardiaco è desiderabile per applicazioni ricostruzione miocardio. L'architettura intrinseca del tessuto cardiaco può presentare vantaggi rispetto ad un ponteggio ECM derivato da un altro organo o un biomateriale artificiale. Un sito-specifica impalcatura può supportare cellula ospite infiltrazione e promuovere una risposta costruttiva rimodellamento, al contrario di formazione di tessuto cicatriziale. Ad oggi, cardiaci patch ECM sono stati studiati in vivo per ricostruire un difetto creato nel miocardio parete 14. Future stustampi verrà effettuata in vitro per esaminare la capacità del scaffold per supportare cellule cardiache seminate e coltivate sulla matrice. I metodi descritti nel presente documento possono essere applicabili anche a decellularizzazione dei cuori umani.
In conclusione, decellularizzazione cuore suino è possibile e i metodi sono straight-forward. Continuazione delle ricerche su questo materiale permettono di percepire il suo potenziale per l'uso clinico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Il dottor Gilbert era sul Scientific Advisory Board a Acell, Inc. mentre lo studio era stato fatto, e recentemente è diventato il VP di Ricerca e Sviluppo. Acell, Inc. vende matrice della vescica urinaria e non ha alcun interesse commerciale in questo studio.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Brogan Guest, Michelle Weaver, e Kristen Lippert. Il finanziamento per questo studio sono state fornite dal NIH Grant R03EB009237, così come le borse di formazione NIH T32EB001026-06 dal National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria e T32HL076124-05.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F.
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
