Summary
迅速かつ完全に逆行灌流を通して無傷ブタ心臓から細胞成分を除去するための方法が記載されている。この方法は、複数の臨床アプリケーションで使用するための可能性を秘めているサイト固有心筋細胞外マトリックス足場が得られます。
Abstract
主に足場のネイティブアーキテクチャを維持しながら、灌流ベースの全臓器の脱細胞化は最近、サイト固有の細胞外マトリックスの足場を作成するための手段として、組織工学の分野で関心を集めています。現在までに、このアプローチは、心臓、肺、肝臓1月5日を含めて、臓器の様々なシステムで利用されている。簡単にアクセスできる血管網なしで組織のための前の脱細胞化法は、界面活性剤、酸、または周囲の細胞外環境6月8日から細胞および核成分を除去するための手段として、酵素処理のソリューションに対する組織の長期の暴露に依存してきた。しかし、拡散を介して組織に浸透するソリューションの能力に応じてこれらの方法ヒンジ式の有効性。 decellularizatiのとは対照的に、自然の血管系による臓器の血流を効果的に拡散距離を減少させ、促進輸送組織のうち、組織および細胞成分にエージェント上。ここで、我々は完全に冠状逆行灌流を通して無傷ブタの心臓をdecellularizeする方法について述べる。プロトコルは、無傷の心臓の3次元構造を完全に脱細胞化された心臓の細胞外マトリックス（C-ECM）の足場を得た。我々の方法は、酵素、界面活性剤、および細胞の溶解および除去を助けるため高張低張とリンスと相まって酸のシリーズを使用していました。プロトコルは、細胞物質の除去を助けるためにTriton X-100およびデオキシコール酸ナトリウム溶液に続くマトリックスから細胞を分離するためにトリプシン溶液を使用していました。説明されたプロトコルはまた、長時間の2リットル/ min以上の灌流速度を使用します。細胞破片の汚染なし、組織への薬剤の輸送許可ソリューションの変更と相まって、高流量、および組織のリンス効果を確実にした。記載された方法はNATIからすべての核物質を除去様々なアプリケーションに使用することができ、サイト固有の心臓ECMの足場を作成VEブタ心臓組織、。
Protocol
1。組織の準備と実験セットアップ
- 食肉処理場や研究施設からすぐに安楽死の後に収穫豚の臓器と過剰血を洗い流す。心房と大動脈をそのまま維持し、余分な脂肪や組織の中心部をトリミングします。離れて大動脈から肺動脈を分離する脂肪トリミング。組織内の任意のカットがある場合は、適切に廃棄してください。
- 冷凍庫の紙で個別にそれぞれの心をラップし、完全凍結を確実にするために、少なくとも24時間、-80℃の冷凍庫内のすべての組織を保管してください。
- ときに使用する（通常3ヶ月未満）、一晩4℃で4リットルのビーカーに沈めタイプ1の雪解け水1そのまま冷凍ブタ心の準備ができて
- 心が完全に解凍された後、心が乾いたなで心を量ると、体重を記録する。市場重量豚の心臓部は、約375〜450グラムの重量を量るべきである。
- とげのある減速機の¼ "最後までサイズで18マスターフレックスチューブを接続します。有刺鉄線減速機を挿入し、大動脈内側チューブ。ちょうど腕頭動脈の下、大動脈周囲に2ホースクランプまたはセキュアジップタイを置きます。減速機とチューブは大動脈弁ので、冠状動脈が灌流することができます（図1）以上を保つ必要があります。
- タイプIの水でチューブを埋めるために30または60 mlの注射器を使用しています。そのおおよその中点でマスターフレックスローラーポンプのカートリッジ内にチューブを挿入します。流入水2.5リットルを充填した4リットルのビーカーの底にチューブの端とチューブを固定沈める。
- 水、気泡を除去するためにプライムポンプを入れたビーカーに心を置きます。気泡がチューブが挿入されている大動脈から来て認められた場合には、大動脈には、追加の関係で再配置または確保する必要があるかもしれません。気密シールは脱細胞化処理（図2）の間に十分な圧力を維持することが重要です。
- 0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％のNaN 3 Lを含む4リットルのビーカーを置きプレートをかき混ぜ、脱細胞化処理の準備で37℃に温めて上の3ソリューションを提供します。
2。組織リンス
- 正しいチューブサイズを選択していることを確認、400ミリリットル/分の流量にポンプを設定します。 15から25分間、私は水を入力して心臓をフラッシュします。ポンプが開始されると、心臓が心室から血液を膨潤し、発散させるべきである。新鮮なソリューションは、すべての5〜10分間に置換、あるいは心臓から削除される血液の量に基づいて、必要に応じなければならない。血液は心臓から流出していない場合は、必要に応じてチューブとクランプを調整します。
- ポンプを停止し、緩衝生理食塩水（PBS）2Xリン酸で満たされた別のビーカーに心を移す。チューブを溶液中に浸漬された後、ポンプを起動し、700 ml / minに流量を増加させる。心臓は、ソリューションごとに5分を変え、15分間溶液中に残るはずです。各ソリューションの変更は、組織とチューブを移動させながら、ポンプを一時的に停止させておく必要があり新しいビーカーに。
- 10分間、私は水を入力し、750 ml / minに流量を増加するために、心臓を転送します。
3。脱細胞化とソリューション灌流
- 0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％で、37のNaN 3℃の入ったビーカーに心を移す1200ミリリットル/分にポンプ速度を増加させ、ポンプを起動します。ビーカー中の溶液を循環させるためにビーカーの底に置か攪拌棒を使用しています。心臓は3時間の合計を37℃で0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％のNaN 3溶液中に残るはずです。 1時間後、1,500 ml / minにポンプ速度を増加させる。追加の時間後、1,800 ml / minにポンプ速度を増加させる。組織は徐々に条件を組織に増加灌流速度を施し、血管の破裂を防止しています。心臓が膨張し、ほぼプロトコルのこのステップの間にサイズが2倍になります。組織は目を通して心房から頂点へと進行する、その自然な色を失うことになるメールプロトコル（図3）。
- 各ソリューション灌流後、すすぎ2ステップは、細胞破片、化学残留物、援助、細胞溶解を除去するために行われている。すすぎが10分続くタイプI水ですすぎ、10分で構成されてそれぞれが室温で2X PBS溶液ですすいでください。各洗浄は、ソリューションをすすぎ追加、水没心臓を入れたビーカー内に灌流液を循環させ、元のビーカーから溶液の除去で構成されています。 1900ミリリットル/分で0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％のNaN 3溶液、水灌流したあと、これを1950ミリリットル/分で2X PBSを灌流する。
- 室温で3％トリトンX-100/0.05％EDTA/0.05％のNaN 3の溶液に心を移してください。 1時間2000ミリリットル/分であり、灌流液にポンプの速度を増加させる。ビーカーから溶液を除去し、新鮮な溶液と交換し、2100 ml / minにポンプ速度を増加させ、さらに1時間半の新鮮な溶液を灌流、合計時間を持ち込む3パーセントトリトンX-100/0.05％EDTA/0.05％NaN 3を 2.5時間に。
- 10分ごとに2180ミリリットル/分で2150ミリリットル/分と2XのPBSでタイプI水にティッシュを洗い流す。
- 室温で4％デオキシコール酸ナトリウム液に心を移す。 2200ミリリットル/分および3時間灌流液にポンプの速度を増加させる。
- 各ソリューションの5から10分後にソリューションを変更すると、15分ごとに2200ミリリットル/分でタイプIの水でと2X PBS中で組織を洗浄します。説明灌流手順が二回リンス工程を実施し、4℃で一晩添付のチューブと一緒に心を格納することにより、複数の日にわたって分割して、タイプIの水中に沈んでいる可能性があります。
- 次の日は、5分、5分、1,500 ml /分で1×PBSですすぎ、続いて750ミリリットル/分でタイプIの水で洗い流し行う。プロトコルは、その後、適切な解決策で説明流量で継続することができる。
4。消毒と最終処理
- 0.1％peracに心を移すETIC酸/ 2200ミリリットル/分で1.5時間、4％のエタノール溶液と灌流液。
- 組織のための最終的なリンスは、すべての2200ミリリットル/分の速度で実行されます。タイプIの水に2分5回洗浄し、15分のための1×PBSで組織を灌流する。リンスのこのシリーズは、溶液灌流手続きを完了するために、もう一度繰り返されます。
- ポンプの電源をオフにして、心を排出するために、溶液から心臓を削除します。大動脈からの関係を断つ、すべてのチューブを取り外し、1時間排水するために、空のビーカーに心を置く。余分な液体は、定期的に排水する必要があります。完全に心を排出する吸収パッド（図4）に心を置きます。
- 水の大部分が除去された後、心臓の細胞外マトリックス（C-ECM）の重量を記録する。心臓を脱細胞化処理中に、その初期重量の約20〜25％を失うことが予想される。
- 右心室と左心室、ならびにDNA quantificatiための心室中隔を解剖上および組織学的処理の順序で組織の完全な脱細胞（図5）を確認します。
- 凍結乾燥前に少なくとも2時間、-80℃で、C-ECMを凍結。
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Representative Results
全体ブタの心臓に脱細胞化の効果は自然に大きさの違い、圧力、容器の配置によって変化する。従って、細胞外マトリックス由来の足場の正確な組成は、心臓から心臓に同じにはなりません。説明されたプロトコルの完了は、細胞材料の損失を示す、白色または半透明表示される心臓を得ることができます。しかし、それは広く組織はさらにいくつかの定量的なパラメータ8の組み合わせに基づいて、 "脱細胞化された"と考えることができることが認められている。成功した脱細胞化プロトコルは、組織1mgあたりの二本鎖DNA（図6）に比べ50 ngの行列を生成します。行列の移植の際に宿主免疫応答を回避するために、残りのDNAは、200未満の塩基対（図7）を含める必要があります。これらの知見を確認するには、ヘマトキシリン及びエオシン染色は、核の有無を明らかにする必要があります心室と心室中隔の代表的なセクション（図8）で染色。マッソントリクロームは、さらに心臓の筋束とコラーゲンネットワークの保持（図9）の損失を確認します。
図1。チューブの有刺鉄線エンドは、ネイティブの心臓の大動脈に挿入されます。チュービングは、冠状動脈を通って血流を確保するためのホースクランプまたは大動脈弁上タイラップで固定してください。
図2：心が4Lビーカーで水に沈められていると気泡がチューブから除去しなければならない。気泡がチューブに近い大動脈から出て認められた場合には、追加の関係はトンにチューブを固定するために使用しなければなりません組織内の適切な圧力を維持するために、彼は大動脈。
ソリューションは、冠状動脈を通って灌流されると図3。、心臓は心房からの冠状動脈の周りの心とローカライズの頂点に進んで、その本来の色を失うことになる。
図4消毒とプロトコルの手順をすすぎが完了した後、チューブを外して、心が過剰な水は心の外に排出させるために吸収パッド上に配置されます。これは、組織の重量を量るときに正確な測定を保証し、また、組織は、切片化前にリラックスすることができます。
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図5左心室（LV）、右心室（RV）、および心室中隔はすべての脱細胞化組織学的処理、凍結および凍結乾燥のために心臓、DNA定量から削除されます。
図6：ピコグリーンアッセイを用いてDNA含量の定量分析。ネイティブ心室と比較した場合、cECM心から心室はDNA含量の有意な減少を示しています。このプロトコルから観察されるDNAの値は、脱細胞化組織のためた50 ng / mgの標準以下で観測されている。
図7：DNA断片の大きさ、などethidiuによって決定メートル臭ゲル、膀胱マトリックス（UBM）標準と比較した場合、脱細胞化された心室に少し残存DNAを示した。
図8ヘマトキシリン及びエオシン染色は脱細胞化プロトコルの完了後に心室からの核物質の完全な除去を示した。
図9）。ネイティブおよびB）脱細胞化された心室のマッソントリクローム染色。
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Discussion
現在の研究では、ブタの心臓の一貫性のある効率的な脱細胞化するための方法論を説明した。プロトコルは、以前に発表した報告書1への変更であり、再現性の高い結果が得られた流量と圧力の上昇に長い露出が含まれていました。結果として脱細胞化組織は、組織2が正常細胞化のために発行基準のすべてを満たした。頻繁なソリューションの変更は組織に細胞物質の再導入を制限するために行われた、各細胞化剤への曝露の期間は、ECMへの悪影響を低減するために最小化されました。プロトコルの初期段階の間、灌流速度は徐々に状態に組織を増加させ、プロトコルの後の段階で、より高い流速を可能にします。早い段階で組織はエアコンなしでは、心臓の血管系が破裂することができ、心臓の血流を不可能。プロトCOLはその効率のために使用したところ、特許請求の範囲は、他のプロトコルを介して、その優位性に加えられません。脱細胞化剤と血流の速度の正確な組成は多分良好な機械的または生物学的特性を持つプロトコルをもたらすために変化しますが、心臓への薬剤の送達のための一般原則が適用されてもよい。
心臓のネイティブな三次元構造の保存は、脱細胞化プロトコルを通じて行われ、いくつかの手順に起因するものであった。まず、組織をトリミングし、到着時に凍結した。凍結細胞の溶解を促進し、灌流サイクルの事前調整組織のために重要であった。組織は徹底的に大動脈弁に優れたカット2cmの無傷無傷大動脈検査した。どんな心膜または心外膜がカットされた場合は、灌流液は心臓の下流の領域に到達しなかったため、臓器を捨て、心は完全に脱細胞化されませんでした。次に、組織を完全に使用する前に、I型水で解凍した。水は、それが解凍などの組織は、リラックスさせ、また、心臓内の残留血栓の除去を助けた。チューブが挿入されたとして、最後に、ケアは、それが適切な圧力を溶液が冠状動脈に入ったことを維持していたので、チューブの周りに水密シールを形成したように、大動脈弁がそのまま残っていることを保証するために取られた。
各脱細胞化プロトコルが完了した後、品質管理の一連の措置は、細胞材料の完全な除去を確実にするために完了した。プロトコルは、細胞核の組織学的染色を排除することを確認し、現在の研究では、どのようなDNAのサイズが6未満で200 bpであったことをDNAの50未満ngは組織の乾燥重量mgあたりに存在していたことが明らかになった、と。心臓の脱細胞化のために以前に公開されている方法は、DNA染色および定量化における脱細胞の同様のレベルを示した2,5,9,10。完全に脱細胞は酵素と界面活性剤の類似の治療法を使用して、これらの研究で達成された。しかし、本研究では、それぞれの化学物質への暴露の長さが増加したが、そこに多くのソリューションの変更があって、流量が増加した。本プロトコルはまた、潜在的に細胞外マトリックスからの残留化学物質のより効率的な除去につながる、化学リンスの長さを増加させた。
心臓特異的細胞と細胞化ラット心臓の再細胞化は 、in vitro 2,5 で有望な結果が得られている。全臓器灌流脱細胞は、組織の再細胞化において重要であるネイティブ血管系の維持を可能にした。内在する成長因子、マトリックスタンパク質、および三次元繊維構造はまた、適切な細胞接着、遊走、および再構成する収縮心筋組織へのシグナリングを推進しました。ブタの心臓extracelluマトリックスは、足場のサイズと適切な細胞間のコミュニケーションと栄養輸送のために必要な細胞数に起因recellularizeすることは困難になりますLAR。しかし、心臓のマトリックスからカットパッチはインビボ用途の役に立つかもしれません。複数の研究では、11月13日 、動物モデルにおいて、損傷した組織の再構築のための部位特異的なマトリックスを使用しての潜在的な利点を示している。したがって、心臓組織に由来する細胞外マトリックスの足場は、心筋の再生アプリケーションであることが望ましい。心臓組織の固有のアーキテクチャには、他の臓器や人工生体材料由来のECM足場に勝る利点を提示することができる。サイト固有の足場は、宿主細胞の浸潤をサポートし、瘢痕組織形成とは対照的に、建設的な改造応答を促進する可能性がある。現在までに、心臓のECMパッチは心筋壁14で作成した欠陥を再構築するために、生体内で検討されてきた。将来STUダイは、マトリックス上に播種し、培養心筋細胞をサポートするために足場の能力を調べるために、in vitroで行われます。本明細書に記載の方法はまた、人間の心の脱細胞化にも適用可能である。
結論として、ブタの心臓脱細胞化が可能であり、方法は単純明快です。この材料の継続的な調査は、臨床使用のために、その潜在的な洞察を提供します。
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Disclosures
博士ギルバートは、研究が行われている間にACell、Inc。で科学諮問委員会にあったし、最近の研究開発担当副社長となりました。 ACell社は、膀胱行列を販売しており、本研究では商業的な利害関係はありません。
Acknowledgments
著者はブローガンゲスト、ミシェル·ウィーバー、そしてクリステンリッペルトを承認したいと思います。この研究のための資金は、NIHグラントR03EB009237ならびにNIHの訓練助成生体イメージングとバイオの国立研究所からT32EB001026-06とT32HL076124-05によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
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