Summary
Hızla ve tamamen retrograd perfüzyon yoluyla sağlam bir domuz kalbinden hücresel bileşenleri kaldırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, çoklu klinik uygulamalarda kullanım için potansiyele sahip bir site spesifik kardiyak ekstraselüler matriks iskele verir.
Abstract
Büyük ölçüde iskele yerli mimarisi koruyarak Perfüzyon tabanlı tüm organ decellularization son zamanlarda, siteye özgü ekstraselüler matriks iskelelerinin oluşturmak için bir araç olarak doku mühendisliği alanında ilgi kazanmıştır. Bugüne kadar, bu yaklaşım, kalp, akciğer, karaciğer ve 1-5 de dahil olmak üzere, organ sistemlerinin çeşitli kullanılmıştır. Kolay erişilebilir bir damar ağı olmadan dokuların Önceki decellularization yöntemleri deterjanlar, asitler veya çevredeki ekstraselüler ortamda 6-8 hücresel ve nükleer bileşenleri kaldırmak için bir araç olarak enzimatik tedavi çözümleri doku uzun süre maruz başvurmuşlardır. Bununla birlikte, çözeltilerin yeteneği bu yöntemlerin menteşeli etkinliğini difüzyon yoluyla doku nüfuz. Buna karşılık, doğal damar sistemi aracılığıyla organ perfüzyon etkili bir difüzyon mesafe ve decellularizati kolaylaştırılmıştır taşıma azaltılmışdoku dışarı doku ve hücresel bileşenlerine ajanlardır. Bu yazıda, tam koroner retrograd perfüzyon yoluyla sağlam bir domuz kalbi decellularize için bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol bozulmamış kalp üç-boyutlu bir yapıya sahip bir tam decellularized kardiyak hücre dışı matris (ECM c) iskele elde edilmiştir. Önerilen yöntem, enzimler, deterjan ve hücre lisisi ve çıkarmaya yardım etmek için hipertonik ve hipotonik durulama ile birlikte asit dizisi kullanılır. Protokol hücresel malzeme çıkarmaya yardım etmek için Triton X-100 ve sodyum deoksikolatın çözümler ardından matris hücreleri ayırmak için bir tripsin çözelti kullanılmıştır. Açıklanan protokol, aynı zamanda daha büyük 2 L / uzun süre için min perfüzyon hızlarını kullanır. Hücresel enkaz kirlenme olmadan dokuya ajanlar taşıma izin ve çözüm değişiklikler ile birleştiğinde yüksek debi, doku durulama etkili sağlanmalıdır. Burada tarif edilen yöntem nati tüm nükleer malzeme ayrılmıştırçeşitli uygulamalar için kullanılan bir site-spesifik kardiyak ECM iskele oluşturarak, domuz kardiyak doku ve.
Protocol
1. Doku Hazırlanması ve Deney Kurulumu
- Hemen bir mezbaha veya araştırma tesisi ötanazi sonra ve aşırı kan durulayın Hasat domuz organdır. Atrium ve aorta sağlam tutmak, aşırı yağ ve doku kalp kesin. Uzaklıkta aortadan pulmoner arter ayırmak için yağ kesin. Dokusunda herhangi bir kesik varsa, uygun atın.
- Dondurucu kağıt ayrı ayrı her kalp sarın ve tam donma sağlamak için en az 24 saat için -80 ° C derin dondurucuda tüm doku saklayın.
- Zaman kullanımı (genellikle 3 aydan daha az), gecede 4 ° C'de 4 L beher batık Tip 1 su çözülme biri sağlam dondurulmuş domuz kalbi hazır
- Kalbi tamamen çözülmüş sonra, kalp kurulayın kalp tartmak ve ağırlığı kaydetmek. Bir pazar kilo domuz kalbi yaklaşık 375-450 g tartmak gerekir.
- Bir dikenli redüktör ¼ "sonuna kadar boyutu 18 Masterflex hortumu bağlayın. Dikenli redüktör yerleştirin veaort içine hortum. Sadece brakiyosefalik gövde altındaki Sıra 2 hortum kelepçeleri veya aort etrafında güvenli zip bağları,. Redüktör ve hortum aort kapak üzerinde kalmalıdır, koroner arterler (Şekil 1) perfüze böylece.
- Tip I su boruları doldurmak için 30 ya da 60 ml şırınga kullanın. Onun yaklaşık orta noktasında bir Masterflex silindir pompa kartuş içinde tüp yerleştirin. Akış 2.5 L su ile doldurulmuş bir 4 L ölçeğinin alt boru ucu ve boru güvenli daldırmak.
- Su ile doldurulmuş behere kalp ve hava kabarcıklarını çıkarmak için pompayı yerleştirin. Kabarcıklar tüp eklenen aort gelen gözlenirse, aort ilave bağları ile yerleştirilmesi veya temin edilmesi gerekebilir. Hava geçirmez bir mühür decellularization işlemi (Şekil 2) sırasında yeterli basınç sağlamak için önemlidir.
- % 0.2 Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 L içeren 4 L kabı yerleştirinPlaka karıştırın ve 37 ısıtın üzerine ° C decellularization sürecinin hazırlanmasında 3 çözüm.
2. Doku durulamak
- Doğru boru boyutu seçilir sağlanması, 400 ml / dak 'lık bir akış oranı ile pompa ayarlayın. 15-25 dk Ben su yazın ile kalp yıkayın. Pompa çalışmaya başladığında, kalp şişer ve karıncıklar kan dökmek gerekir. Taze çözelti her 5-10 dakikada ikame edilmiş, ya da kalp kaldırılır kan miktarına dayalı olarak gerek yoktur. Kan kalp effused ise, gerekli olduğu gibi tüp ve kelepçeler ayarlayın.
- Pompa durdurun ve 2X Fosfat dolu ayrı bir behere kalp aktarmak Salin (PBS) Tamponlanmış. Boru çözelti içine daldırılmış sonra, pompa ve 700 ml / dk 'ya kadar akış oranını artırmaktadır. Kalp çözümü her 5 dk değişen, 15 dakika için çözüm kalmalıdır. Her çözüm değişim doku ve boru hareket ederken geçici olarak kesilmelidir pompa gerektirirYeni behere.
- 10 dakika boyunca bir su tipi ve 750 ml / dakika akış hızı ile artmaya kalp aktarın.
3. Decellularization ve Çözüm Perfüzyon
- 37 NaN 3 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% içeren behere kalp aktarın ° C. 1.200 ml / dk pompa hızını artırın ve pompa başlar. Beher içinde çözelti sirküle beher altına yerleştirilmiş bir karıştırma çubuğu kullanın. Kalp üç saat olmak üzere toplam 37 ° C'de% 0.2 Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 çözüm kalmalıdır. 1 saat sonra, 1.500 ml / dk pompa hızını artırın. Ek bir saat sonra, 1.800 ml / dk pompa hızını artırın. Doku yavaş koşulu doku artmış perfüzyon hızları tabi ve damarların yırtılması önlemek edilir. Kalp protokolün bu adımı sırasında boyutu şişer ve neredeyse çift olacaktır. Doku inci boyunca atriyumlar apekse ilerliyor, doğal rengini kaybedere protokolü (Şekil 3).
- Her çözüm perfüzyon sonra durulama iki adım hücresel enkaz, kimyasal kalıntı ve yardım hücre lizis kaldırmak için yapılır. Her durulama bir 10 dakika oluşan bir 10 dakika, ardından oda sıcaklığında su 2X PBS çözeltisi ile durulama Tip durulama. Her bir yıkama durulama çözüm, ekleme ve batık kalp içeren deney şişesi içinde dolaşan perfüzat, ilk kaptan çıkarılmasını çözelti oluşur. Ardından% 0.2 Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 çözeltisi ardından, perfuse 1,900 ml / dakika, su ve 1950 ml / dk 'da PBS 2X serpmek.
- % 3 oda sıcaklığında, Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN3 ihtiva eden bir çözeltiye kalp aktarın. 2.000 ml / bir saat dakika ve perfuse çözüm pompa hızını artırın. Kaptan çözüm çıkarın ve taze solüsyon ile değiştirin, 2100 ml / dk pompa hızını artırmak, ve ek bir buçuk saat için taze solüsyon serpmek, toplam zamanı getirerek3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 2.5 hr.
- 2180 ml / 10 dk için her bir dakikada 2150 ml / dakika ve 2x PBS de Tip I su içinde doku durulayın.
- Oda sıcaklığında, bir% 4 Sodyum deoksikolatın çözeltisine kalp aktarın. 2.200 ml / dk ve 3 saat süreyle perfuse çözüm pompa hızını artırın.
- De Tip I su içinde doku durulayın ve 2x PBS 2.200 her bir çözelti için 5-10 dakika sonra çözüm değişen 15 dakika her biri için, ml / dakika. Açıklanan perfüzyon adımları iki kez durulayın adımı gerçekleştirdikten ve 4 ° C gecede ekli boru ile kalp depolayarak birden fazla gün içinde bölünmüş ve Tip I suya sokulmasına olabilir.
- Ertesi gün, 5 dakika ml / dk 1,500 1X PBS ile durulayın, 5 dakika, ardından 750 ml / dk hızla Tip I su ile durulama gerçekleştirmek. Bu protokol daha sonra uygun bir solüsyon içinde tarif akış hızında devam edilebilir.
4. Dezenfeksiyon ve Nihai İşleme
- % 0.1 'lik perac için kalp aktarınetic asit / 2,200 ml / dk 'da% 4 etanol ve çözelti 1.5 saat için çözelti perfuse.
- Doku için son çalkalamalar hepsi 2,200 ml / dk 'da gerçekleştirilir. Tip I su içinde iki yıkamadan 5 dakika, ardından 15 dk için 1X PBS ile doku serpmek. Durulama Bu bir dizi çözüm perfüzyon işlemi tamamlamak için bir kez daha tekrar edilir.
- Pompayı kapatın ve kalp boşaltmak için çözüm kalp çıkarın. Aortadan bağları kes, tüm tüp kaldırın ve 1 saat boyunca boşaltmak için boş bir behere kalp yerleştirin. Aşırı sıvı periyodik tahliye edilmesi gerekir. Tam kalp (Şekil 4) boşaltmak için bir emici ped üzerine kalp yatırın.
- Su en kaldırıldıktan sonra, kardiyak hücre dışı matris (C-ECM) ağırlığını kaydedin. Kalp decellularization işlemi sırasında iç ağırlığının yaklaşık olarak% 20-25 kaybetmeye beklenebilir.
- Sağ ve sol ventrikül, hem de DNA quantificati için ventriküler septum teşrihve histolojik işlem sırasında doku tam decellularization (Şekil 5) teyit etmek için.
- Liyofilizasyon önce en az 2 saat süreyle -80 ° C'de C-ECM dondurun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bütün domuz kalpleri üzerinde decellularization etkisi doğal boyutunda farklılıklar, baskılar ve damar düzenleme nedeniyle değişir. Bu nedenle, elde edilen hücre dışı matris iskelelerinin tam kompozisyon kalp kalp ile aynı olmaz. Açıklanan protokol tamamlanması hücresel malzeme kaybı gösteren beyaz ya da yarı saydam görünür bir kalp ortaya çıkarır. Ancak, yaygın bir doku bir kaç daha fazla kantitatif parametreleri 8 kombinasyonuna dayalı "decellularized" kabul edilebilir olduğu kabul edilmektedir. Başarılı bir decellularization protokol mg doku başına iki şeritli DNA (Şekil 6) daha az 50 ng ile bir matris üretecektir. Matris implantasyonu üzerine bir konak immün cevabı önlemek için, kalan DNA aynı zamanda en az 200 baz çifti (Şekil 7) içermesi gerekir. Bu bulguları doğrulamak için, Hematoksilen-Eozin boyama nükleer yokluğunda ortaya olmalıdırventriküller ve ventriküler septum (Şekil 8) temsili bölümlerinde boyama. Masson Trichrome, kardiyak kas demetleri ve kolajen ağları tutma (Şekil 9) kaybı doğrulamaktadır.
Şekil 1. Tüpünün uç dikenli doğal kalp aort içine yerleştirilir. Boru koroner arterler yoluyla perfüzyon sağlamak için hortum kelepçeleri veya aort kapak yukarıdaki zip bağları ile güvence altına alınmalıdır.
Şekil 2. Kalbi 4L beher ve hava kabarcıkları suya olan boru çıkarılmalıdır. Kabarcıklar tüp yakın aortadan çıkan gözlenmesi halinde, ek bağları t boru sabitlemek için kullanılmalıdır dokuda yeterli basınç sağlamak amacıyla o aorta.
Çözümler koroner arterler ile perfüze olan Şekil 3., Kalp kulakçıklar gelen koroner etrafında kalp ve lokalize apekse ilerliyor kendi yerel renk, kaybedersiniz.
Şekil 4,. Dezenfeksiyon ve protokol durulama aşamaları tamamlandıktan sonra, tüp kaldırılır ve kalp fazla su kalp dışarı akmasını sağlayan bir emici ped üzerine yerleştirilir. Bu doku tartı zaman doğru bir ölçü sağlar ve aynı zamanda doku kesitleri önce rahatlamak için olanak sağlar.
pg "alt =" Şekil 5 "/>
Şekil 5. Sol ventrikül (LV), sağ ventrikül (RV), ve ventriküler septum tüm histolojik işleme, dondurma ve liyofilizasyon ve DNA miktar tayini için decellularized kalp kaldırılır.
Şekil 6. Pico Yeşil deneyi kullanılarak DNA içeriğini kantitatif analizi. Yerli ventriküllere göre cECM kalplerinden ventriküllerde DNA içeriği önemli bir azalma göstermektedir. Bu protokolden gözlenen DNA değerleri decellularized dokular için 50 ng / mg standart veya altında izlenmektedir.
Şekil 7. DNA fragmanı boyut olarak ethidiu tarafından belirlenirBir mesane matrisi (UBM) standardına göre m bromür jel, decellularized ventriküller az kalıntı DNA gösterdi.
Şekil 8. Hematoksilen-Eozin boyama decellularization protokolünün tamamlanmasından sonra ventriküllerden nükleer maddenin tümüyle kaldırılmasını gösterdi.
Şekil 9. A Masson trikrom) yerli ve B) decellularized ventrikül.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çalışmada domuz kalp tutarlı ve verimli decellularization için metodoloji açıklanmalıdır. Protokol, daha önce yayımlanan bir raporunda, 1 bir değişiklik oldu ve daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar elde akışına uzun pozlama ve artan basınç, dahil. Çıkan decellularized doku doku 2 başarılı decellularization için yayınlanmış tüm ölçütleri bir araya geldi. Sık çözüm değişikliklerin doku hücresel materyalin yeniden yerleştirilmesi sınırlamak için yapılmıştır ve her decellularization maruziyet süresi ECM üzerinde olumsuz etkileri azaltmak için minimize edilmiştir. Protokol başında aşamalarında, perfüzyon oranı giderek durumu doku artmış ve protokol ilerleyen aşamalarında daha yüksek akış oranları için izin oldu. Erken aşamalarında klima doku olmadan, kalp damar kalp perfüzyon imkansız hale rüptür olabilir. Protocol verimliliği nedeniyle kullanıldı ve hiçbir iddiada diğer protokolleri olan üstünlüğüne yapılır. Decellularization ajanlar ve perfüzyon oranları kesin kompozisyonu makul iyi mekanik veya biyolojik özelliklere sahip bir protokol verim çeşitlidir, ama kalp ajanların teslimat için genel prensipler uygulanabilir olabilir.
Kalbin doğal üç boyutlu yapısının korunması decellularization protokol boyunca gerçekleştirilen çeşitli işlemlerden bağlandı. İlk olarak, doku kesilmiş ve girişte donduruldu. Donma hücre lizis terfi ve perfüzyon döngüleri için ön şartlandırma doku için önemli idi. Doku iyice aort kapak üstün kesim ve sağlam sağlam aorta 2 cm yönünden muayene edildi. Herhangi bir perikard kesilmiş ya da epikardiyum ise, perfüzat kalp akış aşağı bölge ulaşamamıştır çünkü organı atıldı, ve kalp tam decellularized değildi.Daha sonra, doku kullanmadan önce tam tip I su içinde çözülmüş edildi. Su kalp içinde kalan kan pıhtıları çıkarılması çözülmüş ve aynı zamanda destekli olarak doku dinlenmek için izin verdi. Tüp takıldı Son olarak, bakım da uygun bir baskı çözümü koroner arterlerin girdi ileri sürmüş ve bu yüzden o, tüp etrafında su geçirmez bir mühür oluşur böylece aort kapak bozulmadan kaldı sağlamak için alınmıştır.
Her decellularization protokolü tamamlandıktan sonra, kalite kontrol önlemleri bir dizi hücresel materyalin tümüyle kaldırılmasını sağlamak için tamamlanmıştır. Protokol hücre çekirdekleri için histolojik boyama yok ettiğini teyit çalışmada, herhangi bir DNA büyüklüğü 6 içinde yaklaşık 200 bp DNA olduğu daha az 50 ng dokusunun kuru ağırlığı başına mg mevcut olmadığını göstermiş, ve. Kardiyak decellularization için Önceden yayınlanan yöntemler DNA boyama ve nicelleştirmesinde decellularization düzeyinin benzer olduğu2,5,9,10. Komple decellularization enzimler ve deterjan benzeri tedaviler kullanarak bu çalışmalarda başarılı oldu. Ancak, bu çalışmada, her bir kimyasala maruz kalma süresi artmıştır, orada daha fazla çözüm değişiklikler vardı ve akış oranları artmıştır. İşbu Protokol ayrıca potansiyel ekstraselüler matriksin kimyasal kalıntılarının daha verimli kaldırılması yol, kimyasal durulama uzunluğu artmıştır.
Kardiyak spesifik hücreleri ile decellularized sıçan kalpleri Recellularization vitro 2,5 umut verici sonuçlar vermiştir. Tüm organ perfüzyon decellularization doku recellularization kritik olan yerel damar, bakımı için izin verdi. Içsel büyüme faktörleri, matriks proteinleri ve üç boyutlu elyaf mimarisi de uygun hücre eki, göç ve sulandırmak kontraktil miyokard dokusuna sinyalizasyon terfi. Domuz kardiyak ekstraselülermatris iskele boyutu ve uygun hücresel iletişim ve besin nakliye için gerekli olan hücre sayısı nedeniyle recellularize için daha zor olacaktır lar. Bununla birlikte, kardiyak matris kesilmiş yamalar in vivo uygulamaları için kullanışlı olabilir. Çeşitli araştırmalar 11-13 hayvan modellerinde hasarlı doku onarımı için siteye özgü matris kullanarak potansiyel avantajı olmadığı gösterilmiştir. Bu nedenle, kardiyak doku türetilen bir hücre dışı matris iskele miyokardiyal yeniden uygulama için arzu edilen bir durumdur. Kardiyak doku doğal mimarisi başka bir organ veya yapay bir biyomateryal türetilmiş bir ECM iskele üzerinde avantajları sunabilir. Bir siteye özgü iskele konak hücre infiltrasyonu desteklemek ve skar dokusu oluşumuna karşı olarak, yapıcı bir biçimlenme yanıtı teşvik edebilir. Bugüne kadar, kardiyak ECM yamalar miyokard duvarını 14 oluşturulan bir kusur yeniden in vivo incelenmiştir. Gelecek stukalıplar matris üzerinde kültüre ekildi ve kardiyak hücreler desteklemek için iskele yeteneğini incelemek için, in vitro olarak yapılacaktır. Burada açıklanan yöntemler de insan kalplerin decellularization için de geçerli olabilir.
Sonuç olarak, domuz kalbi decellularization mümkündür ve yöntemler düz ileri vardır. Bu malzemenin Devamı soruşturma klinik kullanım için potansiyel hakkında fikir verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gilbert çalışma yapılmakta idi ise ACell, Inc Bilimsel Danışma Kurulu, ve son zamanlarda Araştırma ve Geliştirme Başkan Yardımcısı oldu. ACell, Inc mesane matrisi satıyor ve bu çalışmada hiçbir ticari çıkarı vardır.
Acknowledgments
Yazarlar Brogan Konuk, Michelle Weaver, ve Kristen Lippert kabul etmek istiyorum. Bu çalışma için Fon NIH Grant R03EB009237 yanı sıra, National Biomedical Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü T32HL076124-05 NIH Eğitimi Teşvik T32EB001026-06 ile sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
