Summary
En metode til å raskt og fullstendig fjerne cellulære komponenter fra et intakt porcin hjertet gjennom retrograd perfusjon er beskrevet. Denne metode gir et stedsspesifikt kardial ekstracellulær matrix stillaset som har potensial for bruk i flere kliniske applikasjoner.
Abstract
Perfusjon-baserte hele organet decellularization har nylig fått interesse innen tissue engineering som et middel for å skape stedsspesifikke ekstracellulære matrix stillasene, mens stort sett bevare arkitekturens av stillaset. Til dags dato har denne tilnærmingen blitt utnyttet i en rekke organsystemer inkludert hjertet, lunge, og leveren 1-5. Tidligere decellularization metoder for vev uten en lett tilgjengelig vaskulære nettverk har stolt på langvarig eksponering av vev til løsninger av vaskemidler, syrer, eller enzymatiske behandlinger som et middel for å fjerne de cellulære og kjernefysiske komponenter fra den omkringliggende ekstracellulære miljøet 6-8. Imidlertid til effektiviteten av disse metodene hengslet av evnen av løsningene gjennomsyre vevet via diffusjon. I kontrast, perfusjon av organer gjennom naturlige karsystemet effektivt redusert diffusjon avstand og tilrettelagt transport av decellularizatipå agenter inn i vevet og cellulære komponenter ut av vevet. Heri, beskriver vi en metode for å fullt ut decellularize intakt svin hjertet gjennom koronar retrograd perfusjon. Protokollen ga et fullt decellularized kardial ekstracellulær matriks (c-ECM) stillaset med den tredimensjonale strukturen av hjertet intakt. Vår metode brukt en rekke enzymer, vaskemidler og syrer kombinert med hypertone og hypotonisk skyllinger til hjelp i lysis og fjerning av celler. Protokollen brukte en Trypsin løsning å løsne celler fra matrisen etterfulgt av Triton X-100 og natrium deoksycholat løsninger å bidra til å fjerne cellemateriale. Den beskrevne protokoll bruker også perfusjon hastigheter større enn 2 l / min i lengre perioder av gangen. Den høye strømningshastighet, kombinert med løsningen som er tillatt transport av agenter til vevet uten kontaminering av cellulært avfall og sikret effektiv skylling av vevet. Den beskrevne metoden fjernet alle kjernefysisk materiale fra Native svin hjertevev, skape en stedsspesifikk hjertestans ECM stillaset som kan brukes til en rekke bruksområder.
Protocol
1. Tissue Klargjøring og Experiment Setup
- Innhøsting svin organ umiddelbart etter eutanasi fra et slakteri eller forskning anlegget og skyll av overflødig blod. Trim hjertet av overflødig fett og vev, holde atriene og aorta intakt. Klippe bort fett å skille lungearterien fra aorta. Hvis det er noen kutt i vevet, forkaste hensiktsmessig.
- Pakk hvert hjerte individuelt i fryseren papir og lagre alle vev i en -80 ° C fryser i minst 24 timer for å sikre fullstendig frysing.
- Når klar for bruk (vanligvis mindre enn 3 måneder), tines en intakt frosne porcin hjerte i type 1 vann over natten nedsenket i en 4 L begerglass ved 4 ° C.
- Etter hjertet er helt tint, klapp hjertet tørr, veie hjertet, og ta vekten. Hjertet av et marked vekt gris bør veie ca 375-450 gram.
- Koble størrelse 18 Masterflex slangen til ¼ "slutten av en piggete redusering. Sett barbed redusering ogslangen inne aorta. Place 2 slangeklemmer eller sikre zip bånd rundt aorta, like nedenfor brachiocephalic bagasjerommet. Redusering og rør må være over aortaklaffen, så koronararteriene kan perfused (figur 1).
- Bruk en 30 eller 60 ml sprøyte til å fylle sonden med type I vann. Sett slangen i patronen av en Masterflex roller pumpe på sitt omtrentlig midtpunkt. Senk tilsig enden av slangen i bunnen av en 4 L begerglass fylt med 2,5 l vann og sikre slangen.
- Plasser hjertet i begerglasset fylt med vann, og fyll pumpe for å fjerne luftbobler. Hvis bobler det observeres kommer fra aorta hvor slangen er satt, kan aorta må omplasseres eller sikret med ytterligere bånd. En lufttett tetning er viktig å opprettholde tilstrekkelig trykk under decellularization prosessen (figur 2).
- Plasser 4 L beger inneholdende 3 l av en 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 løsning på røre plate og varm det til 37 ° C i utarbeidelsen av decellularization prosessen.
2. Vev Skylling
- Still pumpen til en strømningshastighet på 400 ml / min, slik at den riktige slangestørrelsen er valgt. Skyll hjertet med type I vann 15-25 min. Som pumpen startes, bør hjertet svelle og effuse blod fra ventriklene. Fersk oppløsningen skal substituert hver 5-10 min, eller etter behov, basert på mengden av blod fjernet fra hjertet. Hvis blodet ikke effused fra hjertet, justere slangen og klemmer som nødvendig.
- Stoppe pumpen og overføre hjertet til en separat begerglass fylt med 2X Fosfatbufret saltvann (PBS). Etter at slangen er nedsenket i løsningen, starte pumpen og øke strømningshastigheten til 700 ml / min. Hjertet bør forbli i løsning i 15 minutter, endre oppløsningen hver 5 min. Hver løsning endringen krever pumpen må stoppes midlertidig mens vev og slangen bevegestil den nye beger.
- Overfør hjerte til Type I vann i 10 min, og øke strømningshastigheten til 750 ml / min.
3. Decellularization og løsning Perfusjon
- Overfør hjertet til beger inneholdende 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 ved 37 ° C. Øk pumpehastigheten 1200 ml / min og starte pumpen. Bruk en rørestav plassert i bunnen av begerglasset å sirkulere løsning i begerglasset. Hjertet bør forbli i 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 løsning ved 37 ° C for totalt tre timer. Etter 1 time, øker pumpehastigheten til 1.500 ml / min. Etter ytterligere en time, øker pumpehastigheten til 1.800 ml / min. Vevet sakte utsatt for økt perfusjon hastigheter til tilstanden vevet og hindre brudd på skipene. Hjertet vil hovne opp og nesten doble i størrelse i løpet av dette trinnet i protokollen. Vevet vil miste sin naturlige farge, går fra atriene til spissen i hele the protokoll (Figur 3).
- Etter hver løsning perfusjon, en to-trinns skyll utføres for å fjerne cellulært avfall, kjemiske rester og bistand cellelyse. Hver skyll består av en 10 min skyll i type I vann etterfulgt av en 10 min skyll med 2X PBS-løsning ved romtemperatur. Hver vask består av fjerning av oppløsningen fra den opprinnelige begerglasset, legge skyll løsninger og sirkulerende perfusatet innenfor beger inneholdende den neddykkede hjertet. Etter 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 løsning, perfuse vann ved 1900 ml / min og deretter perfuse 2X PBS ved 1950 ml / min.
- Overfør hjertet til en oppløsning av 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 ved romtemperatur. Øk pumpehastigheten til 2000 ml / min og perfuse løsning for en time. Fjerne løsning fra begeret og erstatte med frisk løsning, øker pumpehastigheten til 2100 ml / min, og perfuse frisk løsning for ytterligere en time og en halv, bringe den totale tiden i3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 til 2,5 timer.
- Skyll vevet i type I vann ved 2150 ml / min og 2X PBS ved 2180 ml / min i 10 minutter hver.
- Overfør hjertet til en 4% natriumdeoksykolat oppløsning ved romtemperatur. Øk pumpehastigheten 2200 ml / min og perfuse løsning i 3 timer.
- Skyll vevet i type I vann ved og 2X PBS ved 2200 ml / min i 15 minutter hver, endre løsninger etter 5-10 min for hver løsning. De beskrevne perfusjon trinnene kan deles over flere dager ved å utføre skylling trinn to ganger og ved å oppbevare hjertet med vedlagte slange over natten ved 4 ° C og neddykket i type I vann.
- Den følgende dag, utføre en 5 min skyll med type I vann ved 750 ml / min, fulgt av en 5 min skylling i 1X PBS ved 1500 ml / min. Protokollen kan deretter fortsette med den beskrevne strømningsrate i den riktige løsningen.
4. Desinfeksjon og sluttbehandling
- Overfør hjerte til en 0,1% peracetic syre / 4% etanol-løsning og perfuse løsning for 1,5 timer ved 2200 ml / min.
- De endelige skyllinger for vevet er alle utført ved 2200 ml / min. Perfuse vevet med 1X PBS i 15 minutter, etterfulgt av to 5 min vaskinger i type I vann. Denne serien av skyllinger gjentas én gang mer for å fullføre løsningen perfusjon prosedyren.
- Slå av pumpen og fjern hjertet fra løsningen renner hjertet. Skjær bånd fra aorta, fjerne all slangen, og plasser i hjertet i et tomt beger til å renne i 1 time. Overflødig væske vil må dreneres jevne. Lay hjertet på en absorberende pute til fullt tømme hjertet (Figur 4).
- Etter at mesteparten av vannet er fjernet, registrere vekten av kardial ekstracellulær matriks (C-ECM). Hjertet kan forventes å miste ca 20-25% av sin opprinnelige vekt under decellularization prosessen.
- Skjær høyre og venstre ventrikkel, samt ventrikulære septum for DNA quantificatipå og histologiske prosessering for å bekrefte fullstendig decellularization av vevet (figur 5).
- Frys C-ECM ved -80 ° C i minst 2 timer før lyofilisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av decellularization på hel porcine hjerter varierer naturlig på grunn av forskjeller i størrelse, trykk, og fartøy arrangement. Derfor vil den eksakte sammensetningen av avledede ekstracellulære matrix stillasene ikke være den samme fra hjerte til hjerte. Fullføringen av den beskrevne protokoll vil gi et hjerte som er hvit eller gjennomskinnelig, indikerer tapet av cellemateriale. Men er det allment akseptert at en vev kan betraktes som "decellularized" basert på en kombinasjon av noen mer kvantitative parametre 8. En vellykket decellularization protokoll vil produsere en matrise med mindre enn 50 ng av dobbelt-trådet DNA per mg vev (figur 6). For å unngå en vertsimmunrespons ved implantering av grunnmassen, bør det gjenværende DNA også inneholde mindre enn 200 basepar (figur 7). Å bekrefte disse funnene, bør Hematoxylin og Eosin farging avsløre fravær av kjernefysiskeflekker i representative deler av ventriklene og ventrikulær septum (Figur 8). Masson største Trichrome bekrefter ytterligere tap av hjertemuskelceller bunter og oppbevaring av kollagen nettverk (figur 9).
Figur 1. Den mothaker slangeenden settes inn i aorta av de innfødte hjertet. Slangen må sikres med slangeklemmer eller zip bånd over aortaklaffen for å sikre perfusjon gjennom koronararteriene.
Figur 2. Hjertet er nedsenket i vann i en 4L begerglass og luftbobler må fjernes fra røret. Hvis bobler det observeres fremvoksende fra aorta nær slangen, må ytterligere bånd brukes for å feste slangen til t han aorta for å opprettholde tilstrekkelig trykk i vevet.
Figur 3. Som løsninger perfused gjennom koronararteriene, hjertet mister sin opprinnelige farge, framdrift fra atriene til apeks av hjertet og lokaliserte rundt coronaries.
Figur 4. Etter fullførelse av desinfeksjon og skyll trinnene av protokollen, er slangen fjernet og hjertet er plassert på en absorberende pute for å tillate overskytende vann kan renne ut av hjertet. Dette sikrer en nøyaktig måling når veiing vevet og også lar vevet til å slappe av før snitting.
pg "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Den venstre ventrikkel (LV), høyre ventrikkel (RV) og ventrikulær septum er alle fjernes fra decellularized hjerte for histologisk behandling, frysing og lyofilisering, og DNA kvantifisering.
Figur 6. Kvantitativ analyse av DNA-innhold ved hjelp av en Pico Grønn assay. Ventriklene fra cECM hjerter viser en betydelig nedgang i DNA innhold i forhold til innfødte ventriklene. DNA verdier observert fra denne protokollen er observert ved eller under 50 ng / mg standard for decellularized vev.
Figur 7. DNA fragment størrelse, som bestemmes av ethidium bromide gel, viste liten rest DNA i decellularized ventriklene i forhold til en urinblæren matrise (UBM) standard.
Figur 8. Hematoxylin og Eosin farging viste fullstendig fjerning av kjernefysisk materiale fra ventriklene etter gjennomføringen av decellularization protokollen.
Figur 9. Masson er Trichrome farging av A) innfødte og B) decellularized ventrikkel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende studien beskrevet metodikk for konsistent og effektiv decellularization av en svin hjerte. Protokollen var en modifikasjon til en tidligere publisert rapport en, og inkludert lengre eksponering for strømning og økt trykk, som ga mer reproduserbare resultater. Den resulterende decellularized vev møtte alle de publiserte kriteriene for vellykket decellularization av vev 2. Hyppige løsning endringer ble utført for å begrense gjeninnføring av cellemateriale til vevet, og varigheten av eksponering for hver decellularization agenten ble minimert for å redusere negative effekter på ECM. Under begynnelsen stadier av protokollen, ble perfusjon sats gradvis økt til tilstand vevet og tillate høyere strømningshastigheter løpet av de senere stadier av protokollen. Uten condition vevet i de tidlige stadier, blodkar i hjertet kan sprekke, noe som gjør perfusjon av hjertet umulig. Protocol ble brukt på grunn av sin effektivitet, og ingen krav er gjort til sin overlegenhet over andre protokoller. Den nøyaktige sammensetningen av decellularization agenter og priser av perfusjon kan tenkes varieres for å gi en protokoll med bedre mekaniske eller biologiske egenskaper, men de generelle prinsippene for levering av agenter til hjertet kostnad.
Bevaring av de innfødte tredimensjonale strukturen av hjertet ble tilskrevet flere prosedyrer utført hele decellularization protokollen. Først ble vevet trimmet og frosset ved ankomst. Frysing fremmet cellelyse og var viktig for pre-condition vevet for perfusjon sykluser. Vevet ble grundig inspisert for kutt og 2 cm intakt intakt aorta superior til aortaklaffen. Hvis noen hjerteposen eller epicardium ble kuttet, ble orgelet forkastet fordi perfusatet ikke nådde nedstrøms områder av hjertet, og hjertet var ikke fullt decellularized.Deretter ble vevet fullt tint i type I vann før bruk. Vannet tillot vev å slappe av som det tint og også hjulpet fjerning av gjenværende blodpropper i hjertet. Til slutt, som slangen ble satt, ble omsorg påses at aortaklaffen forble intakt, slik at det dannet en vann-tett forsegling rundt slangen, slik at en riktig trykk ble opprettholdt og at løsningen oppgitte koronararteriene.
Etter hvert decellularization protokollen ble gjennomført, ble en rekke kvalitetskontroll tiltak gjennomført for å sikre fullstendig fjerning av cellemateriale. Denne studien verifisert at protokollen eliminert histologisk farging for cellekjerner, viste at mindre enn 50 ng DNA var til stede pr mg tørrvekt av vevet, og at enhver DNA var mindre enn 200 bp i størrelse 6. Tidligere publiserte metoder for hjerte decellularization viste tilsvarende nivåer av decellularization i DNA flekker og kvantifisering2,5,9,10. Komplett decellularization ble oppnådd i disse studiene med lignende behandlinger av enzymer og vaskemidler. Men i denne studien, ble lengden av eksponering for hvert kjemikalie økt, var det flere løsninger endringer, og strømningshastighetene økte. Denne protokoll også økt lengden av kjemiske skyllinger, som potensielt kan føre til mer effektiv fjerning av kjemiske rester fra den ekstracellulære matrix.
Recellularization av decellularized rottehjerter med hjerte spesifikke celler har gitt lovende resultater i vitro 2,5. Hel organperfusjon decellularization tillatt for vedlikehold av de innfødte vaskulatur, som er kritisk i recellularization av vev. Den iboende vekstfaktorer, matrix proteiner, og tre-dimensjonale fiber arkitektur også fremmet skikkelig celleadhesjon, migrasjon, og signaliserer å gjeninnføre kontraktile hjerteinfarkt vev. Porcine hjerte extracelluLar matrise vil være vanskeligere å recellularize grunnet størrelsen av stillaset og antall celler som er nødvendige for riktig celle kommunikasjon og næringsstoff transport. Imidlertid kan flekker kuttet fra hjertets matrisen være nyttig for in vivo applikasjoner. Flere studier har vist at potensialet fordelen av å bruke en stedsspesifikk matrise for gjenoppbygging av skadet vev i dyremodeller 11-13. Dermed er en ekstracellulær matriks stillaset avledet fra hjertevev ønskelig for myokardiale gjenoppbyggingstiltak applikasjoner. Den iboende arkitektur hjertevev kan presentere fordeler over en ECM stillas avledet fra et annet organ eller en kunstig biomateriale. En stedsspesifikk stillas kan støtte vertscellen infiltrasjon og fremme en konstruktiv remodeling respons, i motsetning til arrvev formasjon. Hittil har kardiale ECM patcher blitt undersøkt in vivo for å rekonstruere en feil opprettet i hjerteinfarkt vegg 14. Future stupressformer vil bli utført in vitro for å undersøke muligheten av stillaset til støtte hjerteceller sådd og dyrket på matriksen. Metodene som er beskrevet her, kan også være aktuelt å decellularization av menneskers hjerter.
I konklusjonen, er svin hjerte decellularization mulig og metodene er rett fram. Fortsatt gransking av dette materialet vil gi innsikt i potensialet for klinisk bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Gilbert var på Scientific Advisory Board ved ACell, Inc. mens studien ble gjort, og nylig ble visedirektør for forskning og utvikling. ACell, Inc. selger urinblæren matrise og har ingen kommersiell interesse i denne studien.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Brogan Guest, Michelle Weaver, og Kristen Lippert. Midler til denne studien ble gitt av NIH R03EB009237 Grant, samt NIH Training Grants T32EB001026-06 fra National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi og T32HL076124-05.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
