Summary
Um método para rápida e completamente remover componentes celulares a partir de um coração porcino intacta através da perfusão retrógrada é descrito. Este método produz um sítio específico cardíaco matriz extracelular andaime que tem o potencial para uso em várias aplicações clínicas.
Abstract
Perfusão baseado descelularização órgão inteiro recentemente ganhou interesse no campo da engenharia de tecidos, como um meio de criar locais específicos andaimes de matriz extracelular, enquanto que em grande parte preservando a arquitectura nativa do andaime. Até à data, esta abordagem tem sido utilizada para uma variedade de sistemas de órgãos, incluindo o coração, pulmão, fígado e 1-5. Métodos anteriores para a descelularização de tecidos, sem uma rede de fácil acesso vascular têm contado após a exposição prolongada do tecido a soluções de detergentes, ácidos, ou tratamentos enzimáticos, como um meio para remover os componentes celulares e nucleares a partir do ambiente circundante extracelular 6-8. No entanto, a eficácia destes métodos articulada sobre a capacidade das soluções para permear o tecido por meio de difusão. Em contraste, a perfusão de órgãos por meio do sistema natural vascular reduzido eficazmente a distância de difusão e transporte facilitado de decellularizatiem agentes para o tecido e os componentes celulares para fora do tecido. Aqui, nós descrevemos um método para a plena decellularize um coração suíno intacta através de perfusão coronariana retrógrada. O protocolo produziu uma totalmente descelularizado cardíaca matriz extracelular (ECM-c) de andaime com a estrutura tridimensional do coração intacto. O nosso método de uso de uma série de enzimas, ácidos e detergentes, juntamente com enxaguamentos hipertónicas e hipotónico para ajudar na remoção e lise de células. O protocolo utilizado uma solução de Tripsina a separar as células da matriz seguido de soluções de Triton X-100 e desoxicolato de sódio para ajudar na remoção do material celular. O protocolo descrito também utiliza velocidades de perfusão superiores a 2 L / min, por períodos de tempo prolongados. A taxa de fluxo elevada, juntamente com a solução muda de agentes de transporte autorizados para o tecido, sem contaminação de detritos celulares e eficaz assegurada a lavagem do tecido. O método descrito removido todo o material nuclear da native tecido cardíaco porcino, criando um local específico cardíaco ECM andaime que pode ser utilizado para uma variedade de aplicações.
Protocol
1. Preparação de tecidos e Experimento Setup
- Colheita de órgãos suínos imediatamente após a eutanásia de um abatedouro ou de pesquisa e enxaguar o excesso de sangue. Aparar o coração do excesso de gordura e de tecido, mantendo os átrios e aorta intacta. Aparar a gordura para separar a artéria pulmonar da aorta. Se houver quaisquer cortes no tecido, descartar adequadamente.
- Enrole cada coração individualmente em papel freezer e armazenar todo o tecido em um congelador -80 ° C durante pelo menos 24 horas para garantir a congelação completa.
- Quando pronto para uso (geralmente menos do que 3 meses), descongelar um coração porcino intacto congelado em água do tipo 1 durante a noite submersa num copo de L 4 a 4 ° C.
- Depois que o coração está completamente descongelado, pat o coração seco, pesar no coração, e registrar o peso. O coração de um porco peso de mercado deve pesar cerca de 375-450 g.
- Ligue tamanho 18 tubulação Masterflex a ¼ final "de um redutor de farpado. Insira o redutor farpado etubo no interior da aorta. Braçadeiras de mangueira coloque 2 ou laços zip seguras ao redor da aorta, logo abaixo do tronco braquiocefálico. O redutor e tubo deve permanecer acima da válvula da aorta, para as artérias coronárias podem ser perfundidos (Figura 1).
- Use uma seringa de 30 ou 60 ml para encher o tubo com água Tipo I. Inserir o tubo no interior do cartucho de uma bomba Masterflex rolo no seu ponto médio aproximado. Submerge final do fluxo de entrada da tubagem no fundo de um copo de L 4 preenchido com 2,5 L de água e fixar o tubo.
- Colocar o coração no copo cheio de água, e a bomba principal para remover bolhas de ar. Se forem observadas bolhas provenientes da aorta onde o tubo é inserido, a aorta pode precisar de ser reposicionada ou protegido com laços adicionais. Uma vedação estanque ao ar é importante para manter a pressão adequada durante o processo de descelularização (Figura 2).
- Colocar o copo L 4 contendo 3 L de uma 0,2% NaN Trypsin/0.05% EDTA/0.05%3 Solução de agitar placa e aquecê-la a 37 ° C em preparação para o processo de descelulação.
2. Lava tecido
- Definir a bomba a uma taxa de fluxo de 400 ml / min, assegurando que a dimensão da mangueira correcto está seleccionado. Lave o coração com água tipo I para 15-25 min. Como a bomba é iniciado, o coração deve inchar e derramar o sangue dos ventrículos. Solução fresca deve ser substituído a cada 5-10 minutos, ou conforme necessário, com base na quantidade de sangue removido a partir do coração. Se o sangue não é emanada a partir do coração, ajustar o tubo e as braçadeiras conforme necessário.
- Parar a bomba e transferir o coração para uma proveta separada cheio com Solução Salina Tamponada com Fosfato 2X (PBS). Depois o tubo é imerso em solução, o arranque da bomba e aumentar a taxa de fluxo de 700 ml / min. O coração deve permanecer em solução durante 15 minutos, a mudança da solução a cada 5 min. Cada alteração solução requer que a bomba seja interrompido temporariamente, enquanto o tecido e tubo é movidopara o copo de novo.
- Transferir o coração ao Tipo I de água durante 10 minutos e aumentar a taxa de fluxo de 750 ml / min.
3. Perfusão decelularização e solução
- Transferir o coração ao copo contendo 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 a 37 ° C. Aumentar a velocidade da bomba de 1200 ml / min e ligar a bomba. Use uma barra de agitação colocados na parte inferior do copo para fazer circular solução no copo. O coração deve permanecer na Trypsin/0.05% EDTA/0.05% 0,2% NaN3 solução a 37 ° C durante um total de três horas. Depois de 1 hora, aumentar a velocidade da bomba de 1500 ml / min. Depois de uma hora adicional, aumentar a velocidade da bomba de 1800 ml / min. O tecido é sujeito a lentamente velocidades de perfusão aumentado para condicionar os tecidos e prevenir a ruptura dos vasos. O coração vai inchar e quase o dobro em tamanho durante esta etapa do protocolo. O tecido vai perder a sua cor natural, progredindo a partir do átrio para o ápice durante todo diae protocolo (Figura 3).
- Depois de cada solução de perfusão, de um de dois passos lavagem é realizada para remover os restos celulares, resíduos químicos, e a lise das células de ajuda. Cada lavagem é constituída por uma lavagem de 10 min em água de Tipo I, seguido por uma lavagem de 10 min com 2X solução de PBS à temperatura ambiente. Cada lavagem consiste na remoção da solução a partir do recipiente original, a adição de soluções de lavagem, e fazer circular o perfusato no copo contendo o coração submerso. Após a 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 solução de água, perfundir a 1.900 ml / min e, em seguida, perfundir 2X PBS a 1950 ml / min.
- Transferir o coração para uma solução de 3% de Triton% X-100/0.05 EDTA/0.05% NaN3 à temperatura ambiente. Aumentar a velocidade da bomba de 2000 ml / min e uma solução de perfundir durante uma hora. Remover a solução a partir do recipiente e substituir com solução fresca, aumentar a velocidade da bomba a 2100 ml / min, e perfundir a solução fresca durante mais uma hora e meia, trazendo o tempo total em3% de Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3-2,5 h.
- Enxaguar o tecido em água do tipo I em 2150 ml / min e em PBS 2x 2180 ml / min, durante 10 min cada.
- Transferir o coração para uma solução de desoxicolato de sódio a 4%, à temperatura ambiente. Aumentar a velocidade da bomba de 2200 ml / min e uma solução de perfundir durante 3 hr.
- Enxaguar o tecido em água e de tipo I em 2X PBS a 2200 ml / min durante 15 minutos cada, depois de alterar as soluções de 5-10 min para cada solução. Os passos descritos de perfusão pode ser dividida em vários dias por realizar a etapa de lavagem duas vezes e armazenando o coração com tubagem ligado durante a noite a 4 ° C e submersos em água do tipo I.
- No dia seguinte, executar a 5 minutos, lavar com água de Tipo I, a 750 ml / min, seguida por uma lavagem de 5 minutos em PBS 1X a 1,500 ml / min. O protocolo pode então ser continuada a uma taxa de fluxo descrito na solução apropriada.
4. Desinfecção e Processamento Final
- Transferir o coração a uma perac 0,1%ácido etic / solução de etanol a 4% e solução perfundir durante 1,5 horas a 2200 ml / min.
- As enxaguaduras finais para o tecido são todos realizados a 2.200 ml / min. Perfundir o tecido com 1X PBS durante 15 min, seguido por duas lavagens de 5 min em água de tipo I. Esta série de lavagens é repetido mais uma vez, a fim de completar o procedimento de perfusão de solução.
- Desligar a bomba e retirar o coração da solução para drenar o coração. Cortar os laços da aorta, remover todos os tubos, e colocar o coração em um copo vazio para drenar durante 1 h. O excesso de líquido terá de ser drenado periodicamente. Deite o coração de uma almofada absorvente para drenar completamente o coração (Figura 4).
- Depois de a maior parte da água é removida, registrar o peso da matriz extracelular cardíaca (C-ECM). O coração pode ser esperado para perder cerca de 20-25% do seu peso inicial, durante o processo de descelulação.
- Dissecar os ventrículos direito e esquerdo, bem como do septo ventricular para DNA quantificatie no processamento histológico, a fim de confirmar a descelularização completa do tecido (Figura 5).
- Congele o C-ECM a -80 ° C durante pelo menos 2 horas antes da liofilização.
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Representative Results
O efeito da descelularização sobre corações porcinos inteiros naturalmente varia devido a diferenças no tamanho, pressões e arranjo do vaso. Portanto, a composição exacta dos derivados scaffolds da matriz extracelular não será o mesmo de coração para coração. A realização do protocolo descrito produzirá um coração que parece branca ou translúcida, o que indica a perda de material celular. No entanto, é geralmente aceite que um tecido, pode ser considerado como "descelularizado" com base na combinação de alguns parâmetros quantitativos mais 8. Um protocolo de descelularização bem sucedido irá produzir uma matriz com menos de 50 ng de ADN de cadeia dupla por mg de tecido (Figura 6). A fim de evitar a resposta imune do hospedeiro após implantação da matriz, o ADN remanescente deve também conter menos de 200 pares de bases (Figura 7). Para confirmar estes resultados, coloração Hematoxilina e Eosina deve revelar a ausência de nuclearcoloração em secções representativas dos ventrículos e do septo ventricular (Figura 8). Trichrome Masson confirma ainda mais a perda de feixes musculares cardíacas e de retenção das redes de colagénio (Figura 9).
Figura 1. O fim farpado do tubo é inserido na aorta do coração nativo. A tubulação deve ser fixada com braçadeiras ou laços zip acima da válvula aórtica para garantir a perfusão através das artérias coronárias.
Figura 2. O coração é imerso em água numa proveta de 4L e as bolhas de ar tem de ser removida do tubo. Se as bolhas são observadas emergindo da aorta perto da tubagem, os laços adicionais devem ser usados para fixar o tubo de t ele aorta, a fim de manter uma pressão adequada no tecido.
Figura 3. Como soluções são perfundidas nas artérias coronárias, o coração vai perder a sua cor natural, progredindo a partir das aurículas para o vértice do coração e localizada em torno das coronárias.
Figura 4. Depois de completada a desinfecção e enxaguamento passos do protocolo, o tubo é removido e o coração é colocado sobre uma almofada absorvente para permitir que o excesso de água drene para fora do coração. Isto assegura uma medição precisa, quando a pesagem do tecido e permite também que o tecido a relaxar antes de seccionamento.
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Figura 5. O ventrículo esquerdo (VE), do ventrículo direito (RV) e do septo ventricular são removidos a partir do coração descelularizado para processamento histológico de congelação e liofilização e quantificação de ADN.
Figura 6. Análise quantitativa do teor de ADN, utilizando um ensaio de verde Pico. Os ventrículos dos corações cECM mostram uma redução significativa no conteúdo de ADN, quando comparada com ventrículos nativos. Os valores observados de DNA a partir deste protocolo são observadas no ou abaixo do padrão de 50 ng / mg para os tecidos descelularizados.
Figura 7. Tamanho do fragmento de DNA, como determinado por ethidium brometo de gel, mostrou DNA residual pouco nos ventrículos descelularizados, quando comparado a uma matriz de bexiga urinária (UBM) padrão.
Figura 8. Hematoxilina-eosina mostrou a completa remoção de material nuclear dos ventrículos após a conclusão do protocolo de decelularização.
Figura 9. Coloração Tricrômico de Masson de A) nativo e B) ventrículo decelularizado.
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Discussion
O presente estudo descreve a metodologia para a descelularização consistente e eficaz de um coração porcino. O protocolo foi uma modificação de um relatório publicado anteriormente 1, e inclui uma exposição mais longa ao fluxo e pressão elevada, o que proporcionou resultados mais reprodutíveis. O tecido resultante descelularizado atendeu a todos os critérios publicados para a descelularização sucesso de tecido 2. Solução muda frequentes foram realizadas para limitar a reintrodução do material celular para o tecido, e da duração da exposição a cada agente descelularização foi minimizado, para reduzir os efeitos nocivos para a ECM. Durante as fases iniciais do protocolo, a taxa de perfusão foi aumentada gradualmente para a condição do tecido e permite maiores taxas de fluxo, durante os estágios posteriores do protocolo. Sem o condicionamento do tecido nas fases iniciais, a vasculatura do coração pode romper, fazendo a perfusão do coração, impossível. O protocol foi usado devido a sua eficiência, e não as reivindicações são feitas para a sua superioridade sobre outros protocolos. A composição exacta dos agentes descelularização e taxas de perfusão pode concebivelmente ser variado para se obter um protocolo com melhores características mecânicas, ou biológica, mas os princípios gerais para a entrega de agentes para o coração são aplicáveis.
A preservação da estrutura tridimensional nativa do coração foi atribuída a vários procedimentos realizados em todo o protocolo de descelularização. Primeiro, o tecido foi cortado e congelado no momento da chegada. Congelamento promovido a lise das células e foi importante para o pré-condicionamento do tecido para os ciclos de perfusão. O tecido foi cuidadosamente examinada para cortes e 2 cm na aorta intacta intacta superiores à válvula aórtica. Se qualquer pericárdio ou epicárdio foi cortada, o órgão foi descartada porque o perfusato não atingiram as regiões a jusante do coração, e o coração não foi totalmente descelularizado.Em seguida, o tecido foi completamente descongelada em água tipo I antes da utilização. A água permitiu o tecido a relaxar e descongelado uma vez que também ajudou a remoção de coágulos de sangue dentro do coração residuais. Finalmente, como o tubo foi inserido, foi tomado cuidado para assegurar que a válvula aórtica permaneceram intactos, de modo que se formou uma vedação estanque em torno do tubo, de modo que uma pressão adequada foi mantida e que a solução penetrasse nas artérias coronárias.
Depois de cada protocolo descelularização foi completada, uma série de medidas de controlo de qualidade foram completadas para assegurar a remoção completa do material celular. O presente estudo verificou-se que o protocolo de coloração histológica eliminada para os núcleos das células, mostrou que menos de 50 ng de DNA estava presente por mg de peso seco de tecido, e que qualquer ADN era inferior a 200 pb de tamanho 6. Métodos previamente publicados para descelularização cardíaco apresentaram níveis semelhantes de descelularização de coloração e quantificação de ADN2,5,9,10. Decelularização completa foi realizada nestes estudos utilizando tratamentos semelhantes das enzimas e dos detergentes. No entanto, no presente estudo, o tempo de exposição a cada químico foi aumentada, houve mais mudanças de solução, e as taxas de fluxo foram aumentados. O presente protocolo também aumentou o comprimento das lavagens químicas, levando potencialmente a mais eficiente remoção de resíduos de produtos químicos a partir da matriz extracelular.
Recellularization de corações de ratos descelularizados com cardíacas células específicas produziu resultados promissores in vitro 2,5. Perfusão de órgãos descelularização todo permitido para a manutenção da vasculatura nativa, o que é crítico na recellularization do tecido. Os fatores de crescimento inerentes, proteínas e tridimensional arquitetura de fibra também promoveu a fixação das células adequada, migração, e sinalização para reconstituir o tecido contrátil do miocárdio. Suínos cardíaca extracelularlar matriz será mais difícil de recellularize devido ao tamanho do andaime e o número de células necessárias para a comunicação de célula adequada e transporte de nutrientes. No entanto, os remendos cortados a partir da matriz cardíaca, pode ser útil para aplicações in vivo. Vários estudos têm mostrado o potencial vantagem de utilizar uma matriz específica do local para a reconstrução do tecido danificado em modelos animais 11-13. Assim, uma matriz extracelular derivada de andaime tecido cardíaco é desejável para aplicações de reconstrução do miocárdio. A arquitectura inerente do tecido cardíaco podem apresentar vantagens relativamente a um andaime ECM derivada de um outro órgão ou um biomaterial artificial. Um sítio específico de andaime pode apoiar a infiltração da célula hospedeira e promover uma resposta de remodelação construtiva, em oposição à formação de tecido cicatricial. Até à data, os adesivos cardíacas ECM foram investigadas in vivo para reconstruir um defeito criado na parede do miocárdio 14. Futuro stumatrizes serão realizados in vitro para analisar a capacidade do andaime para suportar as células cardíacas semeadas e cultivadas na matriz. Os métodos descritos aqui podem também ser aplicável a decelularização dos corações humanos.
Em conclusão, suínos decelularização coração é possível e os métodos são simples. Investigação contínua deste material irá fornecer informações sobre o seu potencial para a utilização clínica.
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Disclosures
Dr. Gilbert estava no Conselho Consultivo Científico em ACell, Inc. enquanto o estudo estava sendo feito, e, recentemente, tornou-se o vice-presidente de Pesquisa e Desenvolvimento. ACell, Inc. vende matriz bexiga urinária e não tem interesse comercial no presente estudo.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Brogan Visitante, Michelle Weaver e Kristen Lippert. O financiamento para este estudo foi fornecido pelo NIH Grant R03EB009237, bem como bolsas de formação NIH T32EB001026-06 do Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia e T32HL076124-05.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
