Summary
En metod för att snabbt och fullständigt avlägsna cellulära komponenter från en intakt grishjärta genom retrograd perfusion beskrivs. Denna metod ger en platsspecifik hjärt extracellulär matrix byggnadsställning som har potential för användning i flera kliniska tillämpningar.
Abstract
Perfusion-baserade helt organ decellularisering har nyligen vunnit intresse inom området för vävnadsteknik som ett medel för att skapa platsspecifika extracellulära matrix ställningar, medan i hög grad bevarar den nativa strukturen av byggnadsställningen. Hittills har detta tillvägagångssätt använts i en mängd olika organsystem, däribland hjärta, lunga, lever och 1-5. Tidigare decellularisering metoder för vävnader utan en lättillgänglig vaskulär nätverk har åberopas långvarig exponering av vävnad för lösningar av detergenter, syror, eller enzymatiska behandlingar såsom ett medel för att avlägsna de cellulära och nukleära komponenter från omgivande extracellulära miljön 6-8. Men hur effektivt dessa metoder gångjärn på förmågan hos de lösningar genomsyrar vävnaden via diffusion. Däremot minskade perfusion av organ genom naturliga kärlsystemet effektivt spridning avstånd och underlättade transporter av decellularizatipå medel i vävnaden och cellulära komponenter från vävnaden. Häri beskriver vi en metod för att helt decellularize en intakt grishjärta genom koronar retrograd perfusion. Protokollet gav en helt decellulariserad hjärt extracellulär matrix (c-ECM) byggnadsställning med den tredimensionella strukturen för hjärtat intakt. Vår metod använde en serie av enzymer, detergenter, och syror i kombination med hypertona och hypoton sköljmedel för att underlätta lys och avlägsnande av celler. Protokollet använde en trypsinlösning att lösgöra celler från matrisen följt av Triton X-100 och natriumdeoxicholat lösningar för att underlätta avlägsnande av cellulärt material. Den beskrivna protokollet använder också perfusion hastigheter större än 2 l / min under längre tidsperioder. Den höga flödeshastigheten, tillsammans med lösning förändringar tillåtna transport av medel till vävnaden utan förorening av cellrester och säkerställt effektiv sköljning av vävnaden. Den beskrivna metoden bort alla kärnämne från Native porcin hjärtvävnad, skapar en platsspecifik hjärt ECM byggnadsställning som kan användas för en mängd olika tillämpningar.
Protocol
1. Tissue Förberedelser och experimentet
- Skörd svin orgel omedelbart efter eutanasi ur ett slakteri eller forskningsanläggning och skölj bort överflödigt blod. Trimma hjärtat av överflödigt fett och vävnad, hålla förmaken och aorta intakt. Klippa bort fett att separera lungartären från aorta. Om det finns några nedskärningar i vävnaden, kassera på lämpligt sätt.
- Wrap varje hjärta individuellt i frysen papper och förvara alla vävnader i en -80 ° C frys i minst 24 timmar för att säkerställa fullständig frysning.
- När du är redo att användas (oftast mindre än 3 månader), tina en intakt frusen grishjärta i typ 1 vatten över natten nedsänkt i en 4 liter bägare vid 4 ° C.
- Efter att hjärtat är helt tinat, klappa hjärtat torr, väga hjärtat, och notera vikten. Hjärtat i en marknad vikt gris bör väga ca 375-450 g..
- Anslut storlek 18 Masterflex slang till ¼ "slutet på en hullingförsedd reducering. In hullingförsedda reducering ochslangen inuti aortan. Placera 2 slangklämmor eller säkra band zip runt aorta, strax under brachiocephalic stammen. Den reducering och rör måste ligga över aortaklaffen, så kranskärlen kan perfusion (figur 1).
- Använd en 30 eller 60 ml spruta för att fylla slangen med typ I vatten. Sätt slangen inom patronen en Masterflex valspump vid dess approximativa mittpunkt. Sänk inflödet änden av röret i botten av en 4 liter bägare fylldes med 2,5 liter vatten och säkra slangen.
- Placera hjärtat i bägaren fylld med vatten, och fyll pumpen för att ta bort luftbubblor. Om bubblor observeras kommer från aorta där slangen införes, kan aortan behöva omplaceras eller säkras med ytterligare band. En lufttät tätning är viktigt att upprätthålla tillräckligt tryck under decellularisering processen (figur 2).
- Placera 4 L bägare innehållande 3 L av en 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 lösning på rör plattan och värm till 37 ° C i beredningen av decellulariseringen processen.
2. Mjukpapper Sköljningar
- Ställ pumpen till en flödeshastighet av 400 ml / minut, vilket säkerställer att rätt slangen storlek väljs. Spola hjärtat med typ I vatten 15-25 min. Eftersom pumpen startas, bör hjärtat svälla och UTGJUTA blod från ventriklar. Färsk lösning bör bytas varje 5-10 min, eller vid behov baserat på mängden av blod som avlägsnats från hjärtat. Om blodet inte utströmmade från hjärtat, justera röret och klämmorna som behövs.
- Stoppa pumpen och överföra hjärtat till en separat bägare fylld med 2X Fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Efter röret nedsänkt i lösning, starta pumpen och öka flödeshastigheten till 700 ml / min. Hjärtat bör förbli i lösning under 15 min, ändra lösningen var 5 minut. Varje lösning förändring kräver att pumpen stoppas temporärt medan vävnaden och röret förflyttastill den nya bägaren.
- Överför hjärtat typ I vatten under 10 min och öka flödeshastigheten till 750 ml / min.
3. Decellularisering och lösning Perfusion
- Överför hjärtat i bägaren som innehöll 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 vid 37 ° C. Öka pumphastigheten till 1.200 ml / minut och starta pumpen. Använd en omrörarstav placerad i botten av bägaren att cirkulera lösningen i bägaren. Hjärtat bör finnas kvar i 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaNs 3 lösning vid 37 ° C under totalt tre timmar. Efter 1 timme, öka pumphastigheten till 1.500 ml / min. Efter ytterligare en timme, ökar pumphastigheten till 1.800 ml / min. Vävnaden långsamt utsätts för ökad perfusion hastigheter att påverka vävnaden och förhindra brott av fartygen. Hjärtat sväller och nästan dubbel storlek under detta steg i protokollet. Vävnaden kommer att förlora sin naturliga färg, fortskrider från förmaken till toppen under hela the protokollet (figur 3).
- Efter varje lösning perfusion, är en tvåstegs sköljning utföras för att avlägsna cellrester, kemisk återstod och stöd cellys. Varje sköljning består av en 10 minuter sköljning i typ I vatten, följt av en 10 minuter sköljning med 2X PBS-lösning vid rumstemperatur. Varje tvätt består av avlägsnande av lösning från den ursprungliga bägaren, lägga skölj lösningar, och cirkulerande perfusatet i bägaren innehållande den nedsänkta hjärtat. Efter 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaNs 3-lösning, perfundera vatten vid 1.900 ml / min och sedan perfundera 2X PBS vid 1950 ml / min.
- Överför hjärtat till en lösning av 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaNs 3 vid rumstemperatur. Öka pumphastigheten till 2.000 ml / min och perfundera lösning för en timme. Ta bort lösningen från bägaren och ersätt med färsk lösning, öka pumphastigheten till 2100 ml / min och perfundera färsk lösning för ytterligare en och en halv timme, vilket den totala tiden i3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 till 2,5 timmar.
- Skölj vävnaden i typ I vatten vid 2150 ml / min och 2X PBS vid 2180 ml / min under 10 min vardera.
- Överför hjärtat till en 4% natriumdeoxicholat lösning vid rumstemperatur. Öka pumphastigheten till 2.200 ml / min och perfundera lösning i 3 timmar.
- Skölj vävnaden i typ I vatten vid och 2X PBS vid 2.200 ml / min under 15 min vardera, ändra lösningarna efter 5-10 min för varje lösning. De beskrivna stegen perfusion kan delas över flera dagar genom att utföra skölj steget två gånger och lagring av hjärtat med bifogade rör över natten vid 4 ° C och nedsänktes i typ I vatten.
- Följande dag, utför en 5 minuter sköljning med typ I vatten vid 750 ml / min, följt av en 5 minuter sköljning i 1 x PBS vid 1.500 ml / min. Protokollet kan sedan fortsätta med den beskrivna flöde i rätt lösning.
4. Desinfektion och slutbehandling
- Överför hjärtat till en 0,1% peracetic syra / 4% etanol-lösning och perfundera lösning i 1,5 h vid 2.200 ml / minut.
- De slutliga sköljningar för vävnaden är alla utförs vid 2.200 ml / minut. Perfundera vävnaden med 1X PBS under 15 minuter, följt av två 5 min tvättar i typ I vatten. Denna serie sköljningar upprepas gång för att slutföra proceduren lösningen perfusion.
- Stäng av pumpen och ta bort hjärtat från lösningen rinna hjärtat. Skär av banden från aorta, ta bort alla slangar och placera hjärtat i en tom bägare att rinna under 1 timme. Överskottsvätska måste dräneras periodiskt. Lägga hjärtat på en absorberande dyna för att helt tömma hjärtat (figur 4).
- Efter det mesta av vattnet avlägsnas, registrera vikten av hjärt extracellulär matrix (C-ECM). Hjärtat kan förväntas förlora ca 20-25% av sin ursprungliga vikt under decellulariseringen processen.
- Dissekera de högra och vänstra ventriklama, liksom ventrikulära septum för DNA quantificatipå och histologisk bearbetning för att bekräfta fullständig decellularisering av vävnaden (figur 5).
- Frys C-ECM vid -80 ° C under minst 2 h före lyofilisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av decellularisering på hela svin hjärtan varierar naturligtvis beroende på skillnader i storlek, tryck och kärlets arrangemang. Därför kommer den exakta sammansättningen av de framställda extracellulära matrix ställningar inte vara samma från hjärta till hjärta. Slutförandet av den beskrivna protokollet kommer att ge ett hjärta som är vit eller genomskinlig, vilket indikerar förlusten av cellulärt material. Det är dock allmänt accepterat att en vävnad kan betraktas som "decellulariserade" baserat på en kombination av några mer kvantitativa parametrar 8. En framgångsrik decellularisering protokoll ger en matris med mindre än 50 ng dubbelsträngad DNA per mg vävnad (figur 6). För att undvika en värd immunsvar vid implantering av matrisen, bör den återstående DNA också innehålla mindre än 200 baspar (figur 7). För att bekräfta dessa fynd, bör hematoxylin och eosin-färgning visar frånvaron av kärnfärgning i representativa sektioner av ventriklarna och ventrikulära septum (Figur 8). Massons Trichrome bekräftar vidare förlust av hjärtmuskelceller buntar och bibehållande av kollagen nätverk (figur 9).
Figur 1. Den hullingförsedda änden av röret är införd i aortan hos den nativa hjärtat. Slangen måste säkras med slangklämmor eller band zip ovanför aortaklaffen att säkerställa perfusion genom kranskärlen.
Figur 2. Hjärtat är nedsänkt i vatten i en 4L bägare och luftbubblor måste avlägsnas från röret. Om bubblor observeras som kommer ut från aorta nära röret, måste ytterligare band användas för att fästa slangen till t han aorta för att upprätthålla tillräckligt tryck i vävnaden.
Figur 3. Som lösningar perfuseras genom kransartärerna, kommer hjärtat förlora sin nativa färg, fortskrider från förmaken till apex av hjärtat och lokaliserade runt kranskärlen.
Figur 4. Efter avslutad desinfektion och skölj steg i protokollet, är röret avlägsnas och hjärtat placeras på en absorberande dyna för att låta överflödigt vatten att rinna ut från hjärtat. Detta säkerställer en korrekt mätning när väger vävnaden och tillåter också vävnaden att slappna av innan snittning.
PG "alt =" Bild 5 "/>
Figur 5. Den vänstra ventrikeln (LV), höger ventrikel (RV), och ventrikulära septum alla avlägsnas från den decellulariserade hjärtat för histologisk bearbetning, frysning och lyofilisering, och DNA-kvantifiering.
Figur 6. Kvantitativ analys av DNA-innehåll med hjälp av en analys Pico Green. Ventriklarna från cECM hjärtan visar en signifikant minskning i DNA-innehåll jämfört med nativa ventriklarna. DNA värden som observerats från detta protokoll observeras vid eller under 50 ng / mg standard för decellulariserade vävnader.
Figur 7. DNA-fragment storlek, bestäms som genom ethidium bromid gel, visade liten kvarvarande DNA i den decellulariserade ventriklarna jämfört med en urinblåsa matris (UBM) standarden.
Figur 8. Hematoxylin och eosin färgning visade fullständigt avlägsnande av kärnämne från ventriklarna efter avslutad decellulariseringen protokollet.
Figur 9. Massons Trichrome färgning av A) infödda och B) decellulariserade kammare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den aktuella studien beskrivs metoder för konsekvent och effektiv decellularisering av en gris hjärta. Protokollet var en modifiering till en tidigare publicerad rapport 1, och inkluderade längre exponering för flöde och ökat tryck, vilket gav mer repeterbara resultat. Den resulterande decellulariserade vävnaden uppfyllde alla de kriterier som offentliggörs för framgångsrik decellularisering av vävnad 2. Täta lösning förändringar utfördes för att begränsa återinförandet av cellmaterial till vävnaden, och varaktigheten av exponeringen för varje decellularisering medlet minimeras för att minska negativa effekter på ECM. Under början stadier av protokollet var perfusionshastigheten gradvis att konditionera vävnaden och möjliggöra högre flödeshastigheter under de senare stadierna av protokollet. Utan konditionering vävnaden i de tidiga stadierna, vaskulaturen i hjärtat kan spricka, vilket gör perfusion av hjärtat omöjlig. ProtoCol användes på grund av dess effektivitet, och inga påståenden görs till dess överlägsenhet över andra protokoll. Den exakta sammansättningen av decellularisering agenter och priser för perfusion kan tänkas ändras för att ge ett protokoll med bättre mekaniska eller biologiska egenskaper, men de allmänna principerna för leverans av läkemedel till hjärtat är tillämpliga.
Bevarandet av den nativa tredimensionella strukturen av hjärtat tillskrevs flera förfaranden utförs hela protokollet decellulariseringen. Först vävnaden trimmas och fryst vid ankomsten. Frysning främjat cellys och var viktig för pre-konditionering vävnaden för perfusionen cykler. Vävnaden var noggrant inspekteras för nedskärningar och 2 cm intakta intakt aorta överlägsna aortaklaffen. Om någon hjärtsäcken eller epikardium skars var orgeln bort eftersom perfusatet inte nådde nedströms regioner i hjärtat, och hjärtat var inte helt decellulariserade.Därefter tillsattes vävnaden helt tinas i typ I vatten före användning. Vattnet tilläts vävnaden att koppla av som det tinas och även understödda avlägsnande av kvarvarande blodproppar i hjärtat. Slutligen, eftersom slangen infördes, såg man att se till att aortaklaffen förblev intakt, så att det bildade en vattentät tätning runt röret, så att en ordentlig trycket upprätthålls och att lösningen in kransartärerna.
Efter varje decellularisering protokoll slutfördes, genomfördes en rad åtgärder för kvalitetskontroll kompletteras för att säkerställa fullständig borttagning av cellmaterial. Den aktuella studien kontrollerade att protokollet eliminerade histologisk färgning för cellkärnor, visade att mindre än 50 ng DNA var närvarande per mg torrvikt av vävnaden, och att alla DNA var mindre än 200 bp i storlek 6. Tidigare publicerade metoder för hjärt decellularisering visade liknande nivåer av decellularisering i DNA färgning och kvantifiering2,5,9,10. Komplett decellularisering genomfördes i dessa studier med liknande behandling av enzymer och rengöringsmedel. I den aktuella studien har längden av exponering för varje kemikalie ökat, fanns det fler lösningar förändringar och flöden ökades. Det nuvarande protokollet ökade också längden av kemiska sköljningar, vilket kan leda till en mer effektiv borttagning av kemiska rester från den extracellulära matrisen.
Recellularization av decellulariserade råtthjärtan med hjärt specifika celler har gett lovande resultat in vitro 2,5. Hel organperfusion decellularisering tillåten för underhåll av den nativa vaskulaturen, vilket är kritiskt i recellularization av vävnaden. De inneboende tillväxtfaktorer, proteiner matris och tredimensionella fiber arkitektur främjas också rätt cellvidhäftning, migration och signalering att rekonstruera kontraktila myokardvävnaden. Svin hjärt extracellunande matris kommer att bli svårare att recellularize grund av storleken på ställningen och antalet celler som krävs för korrekt cellkommunikation och näringsämnen transporter. Emellertid kan plåster utskurna från hjärt matrisen vara användbar för in vivo applikationer. Flera studier har visat den potentiella fördelen med att använda en platsspecifik matris för rekonstruktion av skadad vävnad i djurmodeller 11-13. Sålunda, är en extracellulär matris byggnadsställning härrörande från hjärtvävnad önskvärd för myokardiala återuppbyggnad applikationer. Den inneboende arkitektur hjärtvävnaden kan medföra fördelar över ett ECM byggnadsställning härledd från annat organ eller en konstgjord biomaterialet. En platsspecifik byggnadsställning kan stödja infiltration värdcell och främja en konstruktiv ombyggnad svar, i motsats till ärrvävnad bildas. Hittills har hjärt ECM plåster undersökts in vivo för att rekonstruera en defekt som skapats i den myokardiala väggen 14. Framtida stuformarna kommer att utföras in vitro för att undersöka förmågan hos ställningen att stödja hjärtceller ympats och odlades på matrisen. De metoder som beskrivs häri kan också tillämpas på decellularisering av mänskliga hjärtan.
Sammanfattningsvis är grishjärta decellularisering möjligt och metoderna är enkel. Fortsatt undersökning av detta material kommer att ge insikt i dess potential för klinisk användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Gilbert var på Scientific Advisory Board vid Acell, Inc. under studien som gjordes, och nyligen blev VP för forskning och utveckling. Acell, Inc. säljer urinblåsan matris och har inget kommersiellt intresse i föreliggande studie.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Brogan Guest, Michelle Weaver, och Kristen Lippert. Finansiering för denna studie gavs av NIH Grant R03EB009237, liksom NIH utbildningsstipendier T32EB001026-06 från National Institute of Biomedical Imaging och bioteknik och T32HL076124-05.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
