Summary

Antígenos funcionais protegidos glóbulos vermelhos pela membrana enxerto de compactos Poligliceróis hiper

Published: January 02, 2013
doi:

Summary

A modificação da membrana celular das células vermelhas do sangue (RBC) com poliglicerol hiper-ramificado (HPG) é apresentada. Hemácias modificadas foram caracterizadas por partição de fase aquosa dois, fragilidade osmótica e lise mediada pelo complemento. A camuflagem de proteínas de superfície e antígenos foi avaliada usando a citometria de fluxo e Sistema de Digitação Micro (MTS) cartões de fenotipagem de sangue.

Abstract

Transfusão de células vermelhas do sangue (RBC) é vital para o tratamento de um certo número de agudos e crónicos problemas médicos, tais como a talassemia major e anemia falciforme 1-3. Devido à presença de grande número de antigénios na superfície de RBC (~ 308 antigénios conhecidos 4), os pacientes no tratamento crónico de transfusão de sangue desenvolvem aloanticorpos devido à falta de correspondência antigénios menores sobre os glóbulos vermelhos transfundidos 4, 5. A enxertia de polímeros hidrofílicos tais como polietileno glicol (PEG) e hiper-ramificado de poliglicerol (HPG) forma uma camada de exclusão da membrana de RBC que impede a interacção dos anticorpos com antigénios de superfície, sem afectar a passagem de moléculas pequenas, tais como o oxigénio, a glucose, e os iões de 3. Actualmente, nenhum método disponível para a geração de células de dador universal vermelhas do sangue, em parte, por causa da grande desafio apresentado pela presença de um grande número de antigénios (proteínas e hidratos de carbono com base) sobre a superfície e o RBC desenvolvimento de tais métodos irá melhorar significativamente a segurança das transfusões, e melhorar drasticamente a disponibilidade eo uso de hemácias. Neste relatório, as experiências que são usados ​​para desenvolver antigénios protegidas RBCs funcionais pela membrana de enxerto de HPG e sua caracterização são apresentados. HPGs são altamente biocompatíveis polímeros compactas 6, 7, e espera-se estar situado no glicocálice celular que rodeia a membrana lipídica 8, 9 e os antigénios de superfície da máscara 10, 11 de RBC.

Protocol

A. Modificação poliglicerol hiper (SS-HPG) Lugar liofilizado HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) em um balão de fundo redondo e secar durante a noite sob vácuo a 90 ° C. Refrigerar o balão até à temperatura ambiente e dissolve-se o HPG secas em piridina anidra (3 ml). Para funcionalizar aproximadamente oito grupos hidroxilo em grupos carboxilo com HPG, adicionar uma quantidade catalítica de dimetilaminopiridina (uma gota de 5 mg / ml de solução em piridina) para a solução de HPG. …

Representative Results

Camuflagem de antígeno Rhesus D e proteína de superfície CD47 RBC foram quantificadas por citometria de fluxo utilizando anticorpos marcados fluorescentes monoclonais, e um resultado representativo é apresentado na Figura 1. Em caso de HPG-enxertadas RBCs (cinzento), a intensidade do sinal de diminuição (pico deslocado para a esquerda) em comparação com o controle de RBCs (vermelho e verde), indicando uma diminuição na ligação de anticorpos à superfície celular, que indicam o mascaramento …

Discussion

Hemácias de doadores universais têm um grande potencial na disponibilidade de sangue e segurança para melhorar a terapia de transfusão de sangue. RBCs também são considerados veículos de entrega de drogas promissoras, devido à sua circulação longa e biocompatibilidade inerente 14, 15. Experiências apresentadas neste trabalho avaliar in vitro as características de HPG RBCs modificados. A propriedades in vitro e in vivo em circulação de RBCs HPG modific…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi financiada pelos Serviços de Sangue canadenses (CBS) e da Canadian Institutes of Health Science Partnership Fund (CIHR) Research. Os autores agradecem o Hub LMB Macromoléculas no Centro UBC para a pesquisa de sangue para o uso de suas instalações de pesquisa. A instalação de infra-estrutura é apoiada pela Fundação Canadense para Inovação (CFI) e do Michael Smith Fundação para a Pesquisa em Saúde (MSFHR). R. Chapanian é um receptor de (CIHR / CBS) bolsas de pós-doutorado em Ciências de Transfusão e um destinatário de MSFHR comunhão pós estagiário pesquisa de doutorado. JN Kizhakkedathu é um receptor de MSFHR Prêmio Acadêmico Carreira Investigador.

Materials

Glycidol Sigma Aldrich (ON, Canada)
Trimethylolpropane Fluka (ON, Canada)
Potassium methylate Sigma Aldrich (ON, Canada)
Anhydrous pyridine Sigma Aldrich (ON, Canada)
4-Dimethylaminopyridine Sigma Aldrich (ON, Canada)
Succinic anhydride Sigma Aldrich (ON, Canada)
Acetone Fisher Scientific (ON, Canada)
Anhydrous dimethyl formamide Sigma Aldrich (ON, Canada)
N-Hydroxysuccinimide Sigma Aldrich (ON, Canada)
N,N’-Diisopropylcarbodiimide Sigma Aldrich (ON, Canada)
MTS cards Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA)
Dextran 500 kDa Pharmacia Fine Chemicals (Sweden)
PEG 8 kDa Sigma Aldrich (ON, Canada)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD) Quotient Biodiagnostics (PA, USA)
PE monoclonal anti-CD47 BD Biosciences (NJ, USA)
Drabkin’s reagent Sigma Aldrich (ON, Canada)
Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis.

References

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Chapanian, R., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols. J. Vis. Exp. (71), e50075, doi:10.3791/50075 (2013).

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