Antigenen functionele rode bloedcellen die beschermd worden door de membraan enten van Compact Hypervertakte Polyglycerolen

Summary

Het celmembraan modificatie van rode bloedcellen (RBC's) met hypervertakte polyglycerol (HPG) wordt getoond. Gewijzigd RBC werden gekenmerkt door waterige twee fase partitionering, osmotische fragiliteit en complement gemedieerde lysis. De camouflage van de oppervlakte-eiwitten en antigenen werd geëvalueerd met behulp van de flowcytometrie en Micro Typing System (MTS) bloed fenotypering kaarten.

Abstract

Rode bloedcellen (RBC) transfusie is essentieel voor de behandeling van een aantal acute en chronische aandoeningen zoals thalassemie major en sikkelcelanemie ^1-3. Door de aanwezigheid van vele antigenen op het oppervlak RBC (~ 308 bekende antigenen ⁴⁾ patiënten in de chronische bloedtransfusie therapie te ontwikkelen antistoffen door de wedstrijd van miss minor antigenen op erytrocyten transfusie ^{4, 5.} Enten van hydrofiele polymeren zoals polyethyleenglycol (PEG) en hypervertakte polyglycerol (HPG) vormt een laag op uitsluiting RBC membraan dat de interactie van antilichamen met oppervlakteantigenen voorkomt zonder dat de doorgang van kleine moleculen zoals zuurstof, glucose en ionen ^3. Momenteel is er geen werkwijze beschikbaar voor het genereren van rode bloedcellen universele donorcellen mede door de ontmoedigende uitdaging door de aanwezigheid van grote aantal antigenen (eiwitten en koolhydraten zijn) op het oppervlak en de RBC dNTWIKKELING van dergelijke methoden zal een aanzienlijke verbetering transfusie veiligheid en drastisch verbeteren van de beschikbaarheid en het gebruik van RBC. In dit rapport worden de experimenten die worden gebruikt om antigen beschermde functionele RBC ontwikkelen door het membraan enten van HPG en hun karakterisatie gepresenteerd. HPGs zijn zeer biocompatibel compact polymeren ^{6, 7,} en worden naar verwachting binnen de glycocalyx dat het lipide membraan ^{8, 9} en masker RBC oppervlakteantigenen ^{10, 11} omgeeft.

Protocol

A. Hypervertakte Polyglycerol Modificatie (SS-HPG)

1. Place gevriesdroogd HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) in een rondbodemkolf en overnacht drogen onder vacuüm bij 90 ° C.
2. Koel de kolf tot kamertemperatuur en los de gedroogde HPG in watervrije pyridine (3 ml).
3. Om ongeveer acht hydroxylgroepen functionaliseren van HPG met carboxylgroepen, voeg katalytische hoeveelheid dimethylaminopyridine (een druppel van 5 mg / ml oplossing in pyridine) HPG de oplossing. Aan dit mengsel toevoegen barnsteenzuuranhydride (0,0067 g, 0,0664 mmol) opgelost in 0,5 ml pyridine druppelsgewijs over 10 minuten. Roer het mengsel overnacht bij kamertemperatuur onder argon.
4. Precipiteren het mengsel in 40 ml koude aceton (4 ° C) in een 50 ml centrifugebuis en centrifugeer met een Beckman J2-centrifuge bij 27.000 MC xg gedurende 15 minuten. Giet het supernatant en verwijder Rest aceton door spoelen met argon bij kamertemperatuur.
5. De carboxy activerenl groepen met succinimidyl succinaat (SS) groepen, los het carboxyl-gefunctionaliseerde HPG in 3 ml watervrij DMF. Voeg N-hydroxysuccinimide (0,0077 g, 0,0664 mmol) en N, N'-diisopropylcarbodiimide (0,0084 g, 0,0664 mmol) aan de oplossing en HPG nacht roeren van het mengsel bij kamertemperatuur onder argon.
6. Zuiver het SS-HPG door neerslaan in koude aceton.
7. Verwijder de resterende aceton door spoelen met argon.
8. Bepaal de zuiverheid van gemodificeerde HPG en de mate van carboxyl en SS functionalisering door proton ^(1H) - NMR analyse.

B. Hele bloedafname en scheiding van rode bloedcellen (RBC's)

1. Verzamel volbloed (40% hematocriet, 3 ml) van gezonde donoren ingestemd in een citraat vacutainer buis.
2. Centrifugeer het buisje bij 1000 citraat xg gedurende 4 minuten.
3. Verwijder de bovenstaande vloeistof die plasma en bloedplaatjes bevat en de tussenliggende buffy coat dat witte bloedcellen en platele bevatts met een Pasteur pipet.
4. Breng verpakt RBC (80% hematocriet, 1,2 ml) in een 12 ml Falcon centrifugebuis en voeg PBS buffer (8 ml, pH = 8,0) om RBC wassen.
5. Meng RBC door omkeren om een ​​uniforme cel te bekomen.
6. Centrifugeer de Falcon buis bij 1.000 xg gedurende 4 min, en verwijder het supernatant.
7. RBC wassen met PBS twee keer door stap 5 en 6.
8. Place verpakt-RBC (100 ui) in 1,6 ml Eppendorf buisje en PBS buffer (300 ul, pH = 8,0) tot 20% hematocriet RBCs verkrijgen voegen.

C. HPG Enten op RBC

1. Onmiddellijk na precipitatie van gemodificeerde HPG in aceton in stap A6, place SS-HPG (150 mg) in een glazen buisje (1 dram), en oplossen in PBS buffer (300 pl, pH = 8,0).
2. Voeg SS-HPG polymeeroplossing in 20% hematocriet gewassen RBC tot een eindvolume van 400 pl en SS-HPG concentratie die varieert van 0,5 mm tot 3 mm te verkrijgen. Bijvoorbeeld om RBC behandeld met 0,5 mM bereiden SS-HPG verwijderen 36 pi PBS uit de gewassen RBC en plaats 36 ui SS-HPG polymeeroplossing.
3. Vortex de suspensie voorzichtig en plaats de Eppendorf buizen op een orbitale schudder bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
4. Centrifugeer de Eppendorf buizen bij 1.000 xg gedurende 4 min, en pipetteer de supernatant.
5. Voeg 1 ml PBS toe RBC wassen, centrifugeren en het supernatant te verwijderen.
6. Voeg 1 ml zoutoplossing en was RBC twee keer zoals in stap 5.
7. Voeg 300 ul van zoutoplossing tot 100 pi van verpakte erytrocyten (80% hematocriet) tot een eindconcentratie van 20% hematocriet.

D. Karakterisatie van HPG Gewijzigd RBC

I. Complement gemedieerde lysis

1. Verzamel ongeveer 8 ml volledig bloed van gezonde donoren in BD vacutainer glazen buis serum en laat het bloed te stollen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
2. Centrifugeer het buisje bij 2000 xg gedurende 10 min en verzamel ongeveer 3 ml serum.
3. Een milliliter van de serum werd in een waterbad van 60 ° C gedurende 30 min warmte geïnactiveerd serum bereiden.
4. Voeg 60 pl vers serum of warmte geïnactiveerd serum in een Eppendorf buis die 60 pl 20% hematocriet HPG gemodificeerde of ongemodificeerde RBC RBC bevatten.
5. Incubeer RBC gedurende 1 uur bij 37 ° C.
6. Om de hoeveelheid hemoglobine in de celsuspensie, plaats 5,9 pi van 20% hematocriet van HPG gewijzigd RBC's of niet-gemodificeerde cellen in drievoud in 96 well plaat te kwantificeren. Voeg 294 pl reagens Drabkin's (een reagens dat wordt gebruikt om de hoeveelheid hemoglobine spectrophotomerically kwantificeren). Meng cellen met reagens Drabkin's door pipetteren in en uit. Meet de absorbantie van de hemoglobine cyanoderivative bij 540 nm met behulp van SPECTRA MAX 190 plaatlezer.
7. De hoeveelheid hemoglobine in het supernatant kwantificeren, cellen gecentrifugeerd bij 13.000 xg gedurende 1 minuut. Plaats 50 pl supernatant in drievoud in een plaat met 96 putjes. Voeg 250 ul van reagens Drabkin's. Mix cellen met reagens Drabkin'sdoor pipetteren in en uit. Meet de absorbantie van de hemoglobine cyanoderivative bij 540 nm met behulp van SPECTRA MAX 190 plaatlezer.
8. Kwantificeer de hoeveelheid gelyseerde cellen uit de verhouding van hemoglobine in het supernatant (stap 7) en de totale hemoglobine in het monster (stap 6) ^{8, 11, 12.}

II. De camouflage van grote en kleine antigenen met behulp van MTS-kaarten

1. Plaats 50 gl van HPG gemodificeerde RBC (10% hematocriet) in een Eppendorf buis centrifuge bij 1000 xg gedurende 1 min en de bovenstaande vloeistof.
2. Voeg 110 ul van MTS verdunningsmiddel aan de celpellet en homogeniseer de celsuspensie door het pipetteren in en uit.
3. Voeg 11 ul celsuspensie aan elk mini-kolom. Vermijd het aanraken van de gel gedurende de toevoeging.
4. Zoek MTS kaarten in een centrifuge kaarthouder, en centrifugeer bij 156 xg gedurende 6 minuten.
5. Bescherming van oppervlakteantigenen wordt bepaald door de plaats van RBC in de mini gel column, gebaseerd op de productier beschrijving.

III. Waterige tweefasensysteem partitie metingen

1. Bereid Dextran 500 kDa / 8 kDa PEG twee fasescheiding systeem bestaande uit (5% dextran 500k, 4% PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM fosfaat) volgens conclusie ^13.
2. Centrifugeer bij 433 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om een ​​tweefasensysteem (dextran in de bodem) te verkrijgen.
3. Haal voorzichtig de twee fasen.
4. Aliquot 1,0 ml van de PEG bovenste fase in een gemerkte buis (met holle bodem), voorzichtig toevoegen van 20 pi 20% hematocriet HPG gewijzigd RBC en meng cellen door vegen.
5. Voeg 0,5 ml van de bovenste fase die cellen bevatten 0,5 ml van een onderste fase, en meng het systeem tikken.
6. Plaats de buis op de bank tot 2 minuten om het systeem te scheiden, en bepalen de locatie van cellen in het systeem. Lokalisatie van RBC (in de bovenste PEG fase, in de onderste dextranfase of beiden) functie de mate van modificatie en moleculairegewicht van de HPG.

IV. Osmotische fragiliteit metingen

1. Bereid NaCl met concentraties die variëren van 0 tot 0,9 (w / v)%.
2. Plaats 0,4 ml NaCl oplossingen in 1,5 ml Eppendorf buisjes.
3. Voeg 20 ul van erytrocyten (20% hematocriet) in de NaCl oplossingen.
4. Mix cellen zorgvuldig door omkeren en plaats ze in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
5. Zorgvuldig te schorten cellen door inversie. Neem 50 pi van RBC schorsing en voeg deze toe aan een 1 reagens ml Drabkin's, geplaatst in een cuvet. Meng cellen met reagens Drabkin's door pipetteren in en uit. Meet de absorbantie van de hemoglobine cyanoderivative bij 540 nm met behulp van BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lezer.
6. De hoeveelheid hemoglobine in het supernatant kwantificeren, cellen gecentrifugeerd bij 1.000 xg gedurende 1 minuut. Voeg 200 ul supernatant aan 1 ml reagens Drabkin's in een cuvet. Meng cellen met reagens Drabkin's door pipetteren in en uit. Meet de absorbantie van de hemoglOBiN cyanoderivative bij 540 nm met behulp van BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS lezer.
7. Bereken de hoeveelheid cellen gelyseerd in verschillende NaCl-oplossing uit de verhouding van de hoeveelheid hemoglobine in het supernatant (stap 6) de totale hoeveelheid hemoglobine in de celsuspensie (stap 5).

V. Flowcytometrie metingen - Bescherming van Rhesus-D (RhD) antigeen

1. Voeg 5 gl controle of HPG gemodificeerde RBC (20% hematocriet) in drievoud aan PBS buffer aangevuld met 0,5% BSA tot een totaal volume van 25 ul.
2. Voeg 25 ul FITC monoklonaal anti-rhesus D (RhD) gekocht bij Quotiënt Biodiagnostics (PA, USA).
3. Incubeer het mengsel gedurende 30 min bij 37 ° C in een waterbad.
4. Was het mengsel met 1,5 ml PBS buffer tweemaal. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 min om de supernatant te verwijderen.
5. Suspend RBC in 1 ml zoutoplossing, en breng het mengsel op in 4 ml stroom BD flowcytometrie buis.
6. Analyseren met behulp van FACSCanto II flow cytometer, het verwerven van 5.000 evenementen op de RBC bediende poort, en het gebruik van hele evenementen voor analyse.

VI. Flowcytometrie metingen - Expressie van CD47

1. Voeg 1,54 ui controle of HPG gemodificeerde RBC (20% hematocriet) in drievoud aan PBS buffer aangevuld met 0,5% BSA tot een totaal volume van 44 ul.
2. Voeg 6 pl fycoerythrine (PE) gelabeld muis anti-humaan CD47 gekocht bij BD Biosciences (NJ, USA).
3. Incubeer het mengsel gedurende 30 min bij 37 ° C in een waterbad.
4. Was het mengsel met 1,5 ml PBS buffer voor twee keer. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 min om de supernatant te verwijderen.
5. Suspend RBC in 1 ml zoutoplossing, en passeren 26 G 5/8 naald naar cel klonteren te minimaliseren.
6. Spoel de suspensie in 4 ml stroom BD flowcytometrie buis.
7. Analyseren met behulp van FACSCanto II flowcytometer, het verwerven van 10.000 gebeurtenissen op de RBC controle poort.

Representative Results

Camoufleren van Rhesus D antigeen en CD47 RBC oppervlakte-eiwit werden gekwantificeerd door flowcytometrie met fluorescent gelabelde monoklonale antilichamen en een representatief resultaat is weergegeven in figuur 1. Bij HPG-geënte RBC (grijs) de intensiteit van het signaal af (piek verschoven naar links) vergeleken met de controle RBC (rode en groen) voor een vermindering van binding aan antilichamen celoppervlak die het maskeren van manteleiwitten dan .

Figuur 1. Evaluatie van de camouflage oppervlakte antigenen en proteïnen met behulp van flowcytometrie. A) Rhesus D (RhD) bescherming: Black shaded piek geeft de negatieve controle (niet-gemodificeerd RBCs behandeld met PE-gelabelde IgG1), de groene piek vertegenwoordigen de positieve control (ongemodificeerde RBCs behandeld met anti-RhD fluorescent antilichaam) en de grijze piek geeft HPG gemodificeerd RBCs behandeld met dezelfde hoeveelheid anti-RhD fluorescent antilichaam. B) CD47: Black shaded piek geeft de negatieve controle (niet-gemodificeerd RBCs behandeld met PE-gelabelde IgG1), rode piek vertegenwoordigt de positieve controle (ongemodificeerde RBCs behandeld met anti-CD47 fluorescent antilichaam), en de grijze piek geeft HPG gewijzigd RBC behandeld met dezelfde hoeveelheid anti-CD47 antilichaam fluorescerende. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

Universele donor RBC hebben een groot potentieel bij het verbeteren van het bloed beschikbaarheid en veiligheid van bloed transfusie therapie. RBC worden ook beschouwd als veelbelovend drug delivery voertuigen vanwege hun lange omloop en die inherent zijn biocompatibiliteit ^{14, 15.} Experimenten die in dit paper evalueren van de in vitro eigenschappen van HPG gewijzigd RBC. De in vitro eigenschappen en in vivo circulatie van HPG gemodificeerde RBCs werden onderzocht in onze groep recent ^{8, 11.} De verdeling van erytrocyten in Dextran500K/PEG8K waterige tweefasensysteem, aangevuld met NaCl en natriumfosfaat, afhankelijk van de erytrocyten oppervlaktelading en oppervlakte glycoproteïne samenstelling ^16. Afhankelijk van de mate van RBC glycocalyx modificatie met HPGs, bewerkt RBC vaak partitie de onderste naar de bovenste dextran PEG fase. Het tweefasensysteem verschaft een gemakkelijke evaluatie van de mate van RBC oppervlaktemodificatie. Lysis of RBC's in autoloog serum is belangrijke test om te onderzoeken, of HPG gewijzigd RBC complement activatie veroorzaakt, omdat de introductie van nieuwe materialen aan cellen en biologische oppervlakken maakt ze vreemde en onder voorbehoud van het immuunsysteem gemedieerde lysis en de klaring ^17. De osmotische breekbaarheid experiment, anderzijds, aan of mechanische eigenschappen en vervormbaarheid van RBC membraan aangetast als gevolg van HPG enten. De vervormbaarheid van erytrocyten is belangrijk voor de fysiologische functie _van O2 levering aan verschillende delen van het lichaam. In dit experiment gemodificeerde RBC worden blootgesteld aan spanning vervorming door behandeling met verschillende concentraties NaCl en kwantificering procent van gelyseerde cellen.

Flowcytometrie wordt gebruikt om de mate van oppervlak antigeen en oppervlakte-eiwit bescherming (figuur 1) beoordelen door reactie van een bepaald antigeen op het oppervlak van RBC met bijbehorende fluorescerende lageëtiketteerd antilichaam. De mate van Rhesus D-antigeen bescherming wordt geëvalueerd met behulp van flowcytometrie. Het maskeren van antigenen blijkt uit de afname van antilichaambinding aan de RBC. Rhesus D-antigeen maskering wordt eveneens door MTS kaarten. MTS-kaarten worden op grote schaal gebruikt in de hematologie laboratoria in ziekenhuizen voor fenotypering van RBC. Wanneer bijvoorbeeld A-groep RBC ligt in A-type MTS kaart cellen agglutineren als gevolg van reactie met de overeenkomstige monoklonale antilichaam. Echter B-groep bloed niet agglutineren en reist naar de bodem van de mini gel. Het begrip agglutinatie werd gebruikt om het niveau van bescherming dat HPG enten biedt aan RBC evalueren. HPG-geënte RBC dringt de mini gel kolom afhankelijk van het niveau van oppervlakte-antigeen bescherming.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycidol	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Trimethylolpropane	Fluka		(ON, Canada)
Potassium methylate	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Anhydrous pyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
4-Dimethylaminopyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Succinic anhydride	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Acetone	Fisher Scientific		(ON, Canada)
Anhydrous dimethyl formamide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N-Hydroxysuccinimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
MTS cards			Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA)
Dextran 500 kDa	Pharmacia Fine Chemicals		(Sweden)
PEG 8 kDa	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD)	Quotient Biodiagnostics		(PA, USA)
PE monoclonal anti-CD47	BD Biosciences		(NJ, USA)
Drabkin's reagent	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis.