Summary
A modificação da membrana celular das células vermelhas do sangue (RBC) com poliglicerol hiper-ramificado (HPG) é apresentada. Hemácias modificadas foram caracterizadas por partição de fase aquosa dois, fragilidade osmótica e lise mediada pelo complemento. A camuflagem de proteínas de superfície e antígenos foi avaliada usando a citometria de fluxo e Sistema de Digitação Micro (MTS) cartões de fenotipagem de sangue.
Abstract
Transfusão de células vermelhas do sangue (RBC) é vital para o tratamento de um certo número de agudos e crónicos problemas médicos, tais como a talassemia major e anemia falciforme 1-3. Devido à presença de grande número de antigénios na superfície de RBC (~ 308 antigénios conhecidos 4), os pacientes no tratamento crónico de transfusão de sangue desenvolvem aloanticorpos devido à falta de correspondência antigénios menores sobre os glóbulos vermelhos transfundidos 4, 5. A enxertia de polímeros hidrofílicos tais como polietileno glicol (PEG) e hiper-ramificado de poliglicerol (HPG) forma uma camada de exclusão da membrana de RBC que impede a interacção dos anticorpos com antigénios de superfície, sem afectar a passagem de moléculas pequenas, tais como o oxigénio, a glucose, e os iões de 3. Actualmente, nenhum método disponível para a geração de células de dador universal vermelhas do sangue, em parte, por causa da grande desafio apresentado pela presença de um grande número de antigénios (proteínas e hidratos de carbono com base) sobre a superfície e o RBC desenvolvimento de tais métodos irá melhorar significativamente a segurança das transfusões, e melhorar drasticamente a disponibilidade eo uso de hemácias. Neste relatório, as experiências que são usados para desenvolver antigénios protegidas RBCs funcionais pela membrana de enxerto de HPG e sua caracterização são apresentados. HPGs são altamente biocompatíveis polímeros compactas 6, 7, e espera-se estar situado no glicocálice celular que rodeia a membrana lipídica 8, 9 e os antigénios de superfície da máscara 10, 11 de RBC.
Protocol
A. Modificação poliglicerol hiper (SS-HPG)
- Lugar liofilizado HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) em um balão de fundo redondo e secar durante a noite sob vácuo a 90 ° C.
- Refrigerar o balão até à temperatura ambiente e dissolve-se o HPG secas em piridina anidra (3 ml).
- Para funcionalizar aproximadamente oito grupos hidroxilo em grupos carboxilo com HPG, adicionar uma quantidade catalítica de dimetilaminopiridina (uma gota de 5 mg / ml de solução em piridina) para a solução de HPG. A esta mistura, adiciona-se anidrido succínico (0,0067 g, 0,0664 mmol) dissolvido em 0,5 ml de piridina gota sábio, durante 10 min. Agita-se a mistura durante a noite à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon.
- Precipitar a mistura em 40 ml de acetona fria (4 ° C) num tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugar utilizando uma centrífuga Beckman J2-MC a 27.000 xg durante 15 min. Decantar o sobrenadante, e remover a acetona residual por lavagem com árgon à temperatura ambiente.
- Para ativar a carboxigrupos l com succinato succinimidilo (SS), grupos carboxilo dissolver o HPG-funcionalizado, em 3 ml de DMF anidra. Adicionar N-hidroxissuccinimida (0,0077 g, 0,0664 mmol) e N, N'-diisopropilcarbodiimida (0,0084 g, 0,0664 mmol) à solução de HPG e agitar a mistura durante a noite à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon.
- Purifica-se o SS-HPG por precipitação em acetona fria.
- Remover a acetona residual por lavagem com árgon.
- Determinar a pureza das HPG modificado e o grau de funcionalização carboxilo e SS por protões (1H) - A análise por RMN.
B. Recolha de Sangue Total e Separação de glóbulos vermelhos (hemácias)
- Recolha de sangue total (hematócrito de 40%, 3 ml) a partir de dadores humanos saudáveis consentido em um tubo vacutainer citrato.
- Centrifugar o tubo de citrato a 1000 xg, durante 4 min.
- Remover o sobrenadante que contém o plasma e plaquetas, e o intermediário buffy coat que contém as células brancas do sangue e platelets, utilizando uma pipeta Pasteur.
- Transferir RBCs embalados (80% de hematócrito, 1,2 ml) para um tubo de centrífuga de 12 ml Falcon, e adicionar o tampão PBS (8 ml, pH = 8,0) para lavar os glóbulos vermelhos.
- Misturar por inversão RBCs para obter uma distribuição uniforme de células.
- Centrifugar o tubo Falcon de 1.000 xg durante 4 min, e remover o sobrenadante.
- Lavar com PBS RBCs duas vezes mais, repetindo os passos 5 e 6.
- Colocar-embalado RBCs (100 ul) em 1,6 ml de tubo Eppendorf, e adicionar o tampão PBS (300 ul, pH = 8,0) para se obter 20% de hematócrito RBCs.
C. HPG Enxertia de hemácias
- Imediatamente após a precipitação de HPG modificado em acetona em A6 passo, SS-HPG lugar (150 mg) num frasco de vidro (1 dram), e dissolvê-lo em tampão PBS (300 ul, pH = 8,0).
- Adicionar SS-HPG em solução de polímero a 20% de hematócrito RBCs lavados para se obter um volume final de 400 uL e SS-HPG concentração que varia de 0,5 mm a 3 mm. Por exemplo, para preparar RBCs tratados com 0,5 mM de SS-HPG, remover 36 ul de PBS a partir do RBC lavados e colocar 36 ul de SS-HPG solução de polímero.
- Vortex a suspensão suavemente e coloque os tubos Eppendorf num agitador orbital à temperatura ambiente durante 1 hr.
- Centrifuga-se o tubo de Eppendorf a 1000 xg, durante 4 min, e pipetar para fora o sobrenadante.
- Adicionar 1 ml de PBS para lavar os glóbulos vermelhos, centrifugar e remover o sobrenadante.
- Adicionar 1 ml de solução salina e lavar os glóbulos vermelhos duas vezes como no passo 5.
- Adicionar 300 ul de solução salina a 100 ul de RBCs embalados (80 Hematócrito%) para uma concentração final de 20% de hematócrito.
D. Caracterização da HPG Modificado RBCs
I. lise mediada por complemento
- Recolher cerca de 8 ml de sangue completo de dadores humanos saudáveis em BD vacutainer tubo de soro de vidro, e permitir que o sangue coagular à temperatura ambiente durante 30 min.
- Centrifuga-se o tubo a 2.000 xg durante 10 minutos e recolher cerca de 3 ml de soro.
- Um mililitro da serum foi colocado num banho de água a 60 ° C durante 30 minutos para se preparar soro inactivado pelo calor.
- Adicionar 60 ul de soro fresco ou de soro inactivado pelo calor para um tubo Eppendorf que contêm 60 ul de 20% de hematócrito HPG RBCs modificados ou não modificados RBCs.
- Incubar RBCs de 1 hora a 37 ° C.
- Para quantificar a quantidade de hemoglobina na suspensão de células, lugar 5,9 ul de hematócrito de 20% de HPG RBCs modificados ou não modificados, em triplicado, as células em placa de 96 poços. Adicionar 294 ul de reagente de Drabkin (um reagente que é usado para quantificar a quantidade de hemoglobina spectrophotomerically). Misture células com reagente Drabkin de pipetando dentro e para fora. Medir a absorvância da cyanoderivative hemoglobina a 540 nm utilizando SPECTRA MAX leitor de placas 190.
- Para quantificar a quantidade de hemoglobina no sobrenadante, centrifugar as células a 13.000 xg durante 1 min. Colocar 50 ul de sobrenadante, em triplicado, numa placa de 96 poços. Adicionar 250 ul de reagente de Drabkin do. Células misture com reagente de Drabkinpipetando dentro e para fora. Medir a absorvância da cyanoderivative hemoglobina a 540 nm utilizando SPECTRA MAX leitor de placas 190.
- Quantificar a quantidade de células lisadas a partir da razão de hemoglobina no sobrenadante (etapa 7) e a hemoglobina total na amostra (passo 6) 8, 11, 12.
II. A camuflagem de antígenos maiores e menores usando MTS cartões
- Ul local 50 de HPG modificado RBC (10% hematócrito) num tubo de Eppendorf, centrifugar a 1000 g durante 1 min, e remover o sobrenadante.
- Adicionar 110 ul de diluente MTS para o pellet celular e homogeneizar a suspensão de células por pipetagem dentro e para fora.
- Adicionar 11 ul de suspensão de célula para cada coluna de gel de mini. Evitar tocar o gel durante a adição.
- Localizar cartas MTS em um suporte de cartão, centrifugue e centrifugar a 156 xg durante 6 min.
- Protecção dos antigénios de superfície é determinada a partir da localização de RBC na mini-coluna de gel, com base na produçãor descrição.
III. Aquosas duas medições de fase de partição
- Prepare Dextran 500 kDa / PEG 8 kDa dois sistemas de separação de fases composto por (de 5% de dextrano 500k, 4% de PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM de fosfato), de acordo com 13.
- Centrifugar a 433 xg durante 10 min à temperatura ambiente para se obter um sistema de duas fases (o dextrano na parte inferior).
- Separar as duas fases cuidadosamente.
- Ml 1,0 alíquota da fase PEG superior para um tubo rotulado (com fundo côncavo), adicionar 20 ul de 20% hematócrito HPG modificado RBC, e as células misture suavemente por um movimento súbito.
- Adicionar 0,5 ml da fase superior que contém células a 0,5 ml de uma fase inferior, e misturar o sistema suavemente passando rapidamente.
- Colocar o tubo no banco de ~ 2 minutos para que o sistema de separar, e determinar a localização das células no sistema. Localização de RBCs (na fase de PEG superior, na fase de dextrano inferior ou em ambos) é função do grau de modificação e molecularpeso do HPG.
IV. Osmóticos medições fragilidade
- Preparar soluções de NaCl com concentrações que variam de 0 a 0,9 (w / v)%.
- Colocar 0,4 ml de soluções de NaCl em tubos de 1,5 ml de Eppendorf.
- Adicionar 20 pi de glóbulos vermelhos (hematócrito de 20%) para as soluções de NaCl.
- Mistura-se cuidadosamente as células por inversão e coloque-os num banho de água a 37 ° C durante 30 min.
- Suspender as células cuidadosamente por inversão. Tomar 50 ul de suspensão de RBC e adicioná-lo para um 1 ml de reagente de Drabkin, colocada numa cuvete. Misture células com reagente Drabkin de pipetando dentro e para fora. Meça a absorbância da hemoglobina cyanoderivative a 540 nm usando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS leitor.
- Para quantificar a quantidade de hemoglobina no sobrenadante, centrifugar as células a 1.000 xg durante 1 min. Adicionar 200 ul de sobrenadante de 1 ml de reagente de Drabkin, numa cuvete. Misture células com reagente Drabkin de pipetando dentro e para fora. Medir a absorvância da hemoglObin cyanoderivative a 540 nm usando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS leitor.
- Calcula-se a quantidade de células lisadas em solução de NaCl diferente da proporção da quantidade de hemoglobina no sobrenadante (passo 6) para a quantidade total de hemoglobina em suspensão de células (passo 5).
Fluxo V. medições citometria - Proteção de Rhesus-D (Rh) antígeno
- Adicionar 5 uL de controlo ou de HPG RBCs modificados (hematócrito de 20%), em triplicado, para tampão de PBS suplementado com BSA a 0,5% para um volume total de 25 ul.
- Adicionar 25 uL de FITC monoclonal anti-Rhesus D (Rh) comprado de Biodiagnostics Quociente (PA, EUA).
- Incubar a mistura durante 30 min a 37 ° C num banho de água.
- Lava-se a mistura com 1,5 ml de tampão PBS duas vezes. Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para remover o sobrenadante.
- Suspender RBCs em 1 ml de solução salina, e transferir a suspensão para 4 ml de fluxo BD tubo de citometria de fluxo.
- Analisar usando FACSCanto II flow citómetro, a aquisição de 5.000 eventos no portão de controle RBC, e usar os eventos inteiros para análise.
VI. Fluxo de medições de citometria - expressão de CD47
- Adicionar 1,54 uL de controlo ou de HPG RBCs modificados (hematócrito de 20%), em triplicado, para tampão de PBS suplementado com BSA a 0,5% para um volume total de 44 ul.
- Adicionar 6 ul de ficoeritrina (PE) anti-rato marcado humanos CD47 adquiridas da BD Biosciences (NJ, EUA).
- Incubar a mistura durante 30 min a 37 ° C num banho de água.
- Lava-se a mistura com 1,5 ml de tampão PBS por duas vezes. Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para remover o sobrenadante.
- Suspender RBCs em 1 ml de solução salina, e passar através de 26 G 5/8 de agulha para minimizar a aglutinação de células.
- Transferir a suspensão em 4 de fluxo BD ml tubo de citometria de fluxo.
- Analisar usando FACSCanto citômetro de fluxo II, adquirindo 10.000 eventos no portão de controle RBC.
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Representative Results
Camuflagem de antígeno Rhesus D e proteína de superfície CD47 RBC foram quantificadas por citometria de fluxo utilizando anticorpos marcados fluorescentes monoclonais, e um resultado representativo é apresentado na Figura 1. Em caso de HPG-enxertadas RBCs (cinzento), a intensidade do sinal de diminuição (pico deslocado para a esquerda) em comparação com o controle de RBCs (vermelho e verde), indicando uma diminuição na ligação de anticorpos à superfície celular, que indicam o mascaramento de proteínas de superfície .
Figura 1. Avaliação da camuflagem de antigénios de superfície e proteínas, utilizando citometria de fluxo. A) Rhesus D protecção (Rh): pico sombreado preto representa o controlo negativo (não modificados RBCs tratados com PE-rotulado IgG1), o pico de verde representa o co positivontrol (não modificados RBCs tratados com anti-Rh anticorpo fluorescente), e o pico cinzenta representa HPG RBCs modificados tratados com a mesma quantidade de anticorpo anti-RhD fluorescente. B) CD47: pico sombreado preto representa o controlo negativo (não modificados RBCs tratados com PE-rotulado IgG1), o pico de vermelho representam o controlo positivo (não modificados RBCs tratados com anti-CD47 anticorpo fluorescente), e o pico cinzenta representa HPG hemácias modificadas tratados com a mesma quantidade de anti-CD47 anticorpo fluorescente. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Hemácias de doadores universais têm um grande potencial na disponibilidade de sangue e segurança para melhorar a terapia de transfusão de sangue. RBCs também são considerados veículos de entrega de drogas promissoras, devido à sua circulação longa e biocompatibilidade inerente 14, 15. Experiências apresentadas neste trabalho avaliar in vitro as características de HPG RBCs modificados. A propriedades in vitro e in vivo em circulação de RBCs HPG modificados têm sido investigados em nosso grupo recentemente 8, 11. A partição do sistema Dextran500K/PEG8K RBCs na fase aquosa duas, suplementado com NaCl e fosfato de sódio, depende da carga de superfície de eritrócitos e de composição da superfície da glicoproteína 16. Dependendo da extensão da modificação com RBC glicocálice HPGs, RBCs modificadas tendem a partição do dextrano inferior para a fase de PEG superior. O sistema de duas fases proporciona uma avaliação fácil do ponto de RBC por modificação da superfície. Lise of hemácias no soro autólogo é teste significativo de investigar-se HPG hemácias modificadas desencadeia a ativação do complemento, uma vez que a introdução de novos materiais para as células e superfícies biológicas torna estrangeira e sujeitos a lise mediada pelo sistema imunológico e desembaraço 17. O experimento de fragilidade osmótica, por outro lado, indica se as propriedades mecânicas e de deformabilidade da membrana de glóbulos vermelhos foi comprometida como resultado de HPG enxertia. A deformabilidade dos eritrócitos é importante para a função fisiológica de O 2 para a entrega de diferentes partes do corpo. Nesta experiência RBCs modificados são expostos a stress de deformação por tratamento com diferentes concentrações de NaCl, e quantificando por cento de células lisadas.
A citometria de fluxo é utilizada para avaliar a extensão da protecção e o antigénio de superfície da proteína de superfície (Figura 1) por reacção de um antigénio particular, sobre a superfície dos glóbulos vermelhos com o seu correspondente fluorescente-labelled anticorpo. A extensão da protecção antígeno Rhesus D é avaliada por citometria de fluxo. O mascaramento de antigénios é evidente a partir da diminuição na ligação do anticorpo às células vermelhas. Mascaramento antígeno Rh D também é avaliada pelos cartões MTS. MTS placas são largamente utilizados em laboratórios de hematologia em hospitais para fenotipagem de hemácias. Por exemplo, quando o grupo A-RBC está localizado na placa de tipo A-MTS, aglutinar células como resultado de uma reacção com o anticorpo monoclonal correspondente. Contudo, B-grupo sanguíneo não aglutina e viaja para o fundo do gel mini. O conceito de aglutinação foi utilizado para avaliar o nível de protecção que provê a enxertia HPG RBCs. RBCs HPG-enxertadas penetra a coluna de gel de mini, dependendo do nível de protecção de antigénio de superfície.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelos Serviços de Sangue canadenses (CBS) e da Canadian Institutes of Health Science Partnership Fund (CIHR) Research. Os autores agradecem o Hub LMB Macromoléculas no Centro UBC para a pesquisa de sangue para o uso de suas instalações de pesquisa. A instalação de infra-estrutura é apoiada pela Fundação Canadense para Inovação (CFI) e do Michael Smith Fundação para a Pesquisa em Saúde (MSFHR). R. Chapanian é um receptor de (CIHR / CBS) bolsas de pós-doutorado em Ciências de Transfusão e um destinatário de MSFHR comunhão pós estagiário pesquisa de doutorado. JN Kizhakkedathu é um receptor de MSFHR Prêmio Acadêmico Carreira Investigador.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycidol | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Trimethylolpropane | Fluka | (ON, Canada) | |
| Potassium methylate | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Anhydrous pyridine | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| 4-Dimethylaminopyridine | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Succinic anhydride | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Acetone | Fisher Scientific | (ON, Canada) | |
| Anhydrous dimethyl formamide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| MTS cards | Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA) | ||
| Dextran 500 kDa | Pharmacia Fine Chemicals | (Sweden) | |
| PEG 8 kDa | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD) | Quotient Biodiagnostics | (PA, USA) | |
| PE monoclonal anti-CD47 | BD Biosciences | (NJ, USA) | |
| Drabkin's reagent | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis. | |||
References
- Bradley, A. J., Murad, K. L., Regan, K. L., Scott, M. D. Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter. Biochim. Biophys. Acta. 1561 (2), 147-158 (2002).
- Murad, K. T., Mahany, K. L., Brugnara, C., Kuypers, F. A., Eaton, J. W., Scott, M. D. Structural and functional consequences of antigenic modulation of red blood cells with methoxypoly(ethylene glycol. Blood. 93 (6), 2121-2127 (1999).
- Scott, M. D., Murad, K. L., Koumpouras, F., Talbot, M., Eaton, J. W. Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (14), 7566-7571 (1997).
- Daniels, G., Reid, M. E. Blood groups: the past 50 years. Transfusion. 50 (2), 281-289 (2010).
- Murad, K. L., Gosselin, E. J., Eaton, J. W., Scott, M. D. Stealth cells: Prevention of major histocompatibility complex class II-mediated T-cell activation by cell surface modification. Blood. 94 (6), 2135-2141 (1999).
- Kainthan, R. K., Hester, S. R., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. In vitro biological evaluation of high molecular weight hyperbranched polyglycerols. Biomaterials. 28 (31), 4581-4590 (2007).
- Kainthan, R. K., Janzen, J., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. Biocompatibility testing of branched and linear polyglycidol. Biomacromolecules. 7 (3), 703-709 (2006).
- Chapanian, R., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. In vivo circulation, clearance, and biodistribution of polyglycerol grafted functional red blood cells. Biomaterials. 33 (10), 3047-3057 (2012).
- Chapanian, R., Constantinescu, I., Rossi, N. A. A., Medvedev, N., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. Influence of polymer architecture on antigens Camouflage, CD47 protection and complement mediated lysis of surface grafted red blood cells. Biomaterials. 33 (31), 7871-7883 (2012).
- Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. Enhanced cell surface polymer grafting in concentrated and nonreactive aqueous polymer solutions. J. Am. Chem. Soc. 132 (10), 3423-3430 (2010).
- Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Kainthan, R. K., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. Red blood cell membrane grafting of multi-functional hyperbranched polyglycerols. Biomaterials. 31 (14), 4167-4178 (2010).
- Muzykantov, V. R., Smirnov, M. D., Domogatsky, S. P. Hemolytic complement activity assay in microtitration plates. J. App. Biochem. 7 (3), 223-227 (1985).
- Walter, H., Brooks, D. E., Fisher, D. Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses, and applications to biotechnology. , Academic Press Inc. London. (1985).
- Rossi, L., Serafini, S., Pierige, F., Antonelli, A., Cerasi, A., Franternale, A., et al.
- Walter, H., Krob, E. J., Brooks, D. E. Membrane surface properties other than charge involved in cell separation by partition in polymer, aqueous 2-phase systems. Biochemistry. 15 (14), 2959-2964 (1976).
- Muzykantov, V. R., Murciano, J. C., Taylor, R. P., Atochina, E. N., Herraez, A. Regulation of the complement-mediated elimination of red blood cells modified with biotin and streptavidin. Anal Biochem. 241 (1), 109-119 (1996).
