항원은 컴팩트 Hyperbranched Polyglycerols 중 이식 막으로 기능 적혈구를 보호

Summary

hyperbranched polyglycerol (HPG)와 적혈구의 세포막 수정 (적혈구)가 제공됩니다. 수정 적혈구는 수성 2 상 분할, 삼투 취약성과 보완 매개 용해에 의해 특징되었습니다. 표면 단백질과 항원의 위장은 유동 세포 계측법 및 마이크로 타이핑 시스템 (MTS) 혈액 phenotyping 카드를 사용 평가되었습니다.

Abstract

적혈구 (RBC) 수혈은 thalassemia 전공 및 낫 세포 빈혈 ^1-3으로 급성과 만성 의료 문제의 숫자의 치료를 위해 중요합니다. RBC 표면 (~ 308 항원 ⁴⁾ 만성 수혈 요법에 환자 transfused 적혈구 ^{4, 5에} 약간의 항원의 양을 일치로 인해 alloantibodies을 개발에 대한 항원의 다양한의 존재로 인해. 이러한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)와 hyperbranched polyglycerol (HPG)와 같은 친수성 고분자로 이식하는 등 산소, 포도당 및 이온 ^세와 같은 작은 분자의 흐름에 영향을주지 않고 표면 항원과 항체의 상호 작용을 방지 RBC 막에 제외 층을 형성한다. 현재 어떤 방법 때문에 적혈구 표면 및 D에 대한 항원 큰 수 (기반 단백질과 탄수화물)의 존재에 의해 제시 발굴 과제의 일환으로 보편적 적혈구 기증자 세포의 생성에 사용할 수 없습니다이러한 방법 evelopment이 크게 수혈의 안전을 향상시키고, 극적 적혈구의 가용성 및 사용을 향상시킬 수 있습니다. 이 보고서에서 HPG 및 특성의 접목 막에 의해 항원 보호 기능 적혈구를 개발하는 데 사용되는 실험이 제공됩니다. HPGs은 매우 컴팩트 한 폴리머 ^{6, 7} biocompatible되며, 지질 막 ^{8, 9} 및 마스크 적혈구 표면 항원 ^{10, 11을} 둘러싸는 세포 glycocalyx 내에 위치 될 것으로 예상된다.

Protocol

A. Hyperbranched Polyglycerol의 변경 (SS-HPG)

1. 장소 둥근 바닥 플라스크에 60 kDa (0.5 g, 0.0083 mmol)을 HPG 동결 건조 및 90 진공 박을 건조 ° C.
2. 실내 온도에 휴대용 술병을 냉장하고, 무수 피리딘 (3 ML)에서 건조 HPG를 해산.
3. 카르 복실 그룹과 HPG에 약 여덟 수산기 그룹을 functionalize하려면 HPG 솔루션으로 dimethylaminopyridine의 촉매 금액 (피리딘 5 MG / ML 솔루션의 한 방울)을 추가합니다. 이 혼합물에 10 분 이상 현명한 0.5 ML 피리딘 드롭에 용해 (0.0067 g, 0.0664 mmol), succinic 무수물을 추가합니다. 아르곤에 따라 실온에서 하루 아침에 혼합물을 저어.
4. 50 ML의 원심 분리기 튜브의 차가운 아세톤 (4 ° C)의 40 ML에있는 혼합물을 침전, 15 분 동안 27,000 XG에서 Beckman J2-MC의 원심 분리기를 사용하여 원심 분리기. 표면에 뜨는을 가만히 따르다하고, 실온에서 아르곤과 함께 플러싱에 의해 잔류 아세톤을 제거합니다.
5. 카르복시을 활성화하려면succinimidyl 신산 (SS) 단체와 난 그룹은, 무수 DMF 3 ML에있는 카르 복실-작용 HPG를 해산. HPG 솔루션에 N-hydroxysuccinimide (0.0077 g, 0.0664 mmol) 및 N, N'-diisopropylcarbodiimide을 (0.0084 g, 0.0664 mmol)을 추가 및 아르곤 이하 실온에서 하루 아침에 혼합물을 저어.
6. 차가운 아세톤의 강수량에 의해 SS-HPG를 정화.
7. 아르곤과 함께 플러싱에 의해 잔류 아세톤을 제거합니다.
8. NMR 분석 - 수정 HPG의 순도와 양자 ⁽¹ H)의 카르 복실와 SS 작용의 정도를 결정합니다.

B. 전체 혈액 수집 및 적혈구의 분리 (적혈구)

1. 구연산의 vacutainer 관으로 건강한 인간 기증자를 동의에서 전체 혈액 (40 % 혈소판, 3 ML)를 수집합니다.
2. 4 분 1,000 XG에 시트르산 튜브를 원심 분리기.
3. 플라즈마와 혈소판을 포함하는 표면에 뜨는을 제거하고, 백혈구와 platele를 포함하는 중간 버피 코트파스퇴르 피펫을 사용하여 TS.
4. 12 ML 팔콘의 원심 분리기 튜브에 포장 적혈구 (80 % 혈소판, 1.2 ML)를 전송하고, 적혈구를 씻어 PBS 버퍼를 (8 ML, 산도 = 8.0)를 추가합니다.
5. 균일 한 세포 분포를 얻기 위해 반전하여 적혈구를 섞는다.
6. 4 분 1,000 XG에서 매 튜브를 원심 분리기하고, 표면에 뜨는을 제거합니다.
7. 단계 5와 6을 반복하여 PBS 두 번으로 적혈구를 씻으십시오.
8. 장소 1.6 ML Eppendorf 튜브에 (100 μl) 적혈구를 포장, 20 % 혈소판의 적혈구를 얻기 위해 PBS 버퍼 (300 μl, 산도는 = 8.0)을 추가합니다.

C. HPG는 적혈구로 이식

1. 즉시 단계 A6의 아세톤에 수정 HPG, 장소의 강수량 후 유리관 (1 DRAM) 및 PBS 버퍼 (300 μl, 산도는 = 8.0)에 용해에 SS-HPG (150 MG).
2. 20 % 혈소판에 SS-HPG 폴리머 솔루션을 추가하면 400 μl와 0.5 mm까지에서 3 mm까지 범위 SS-HPG 농도의 최종 볼륨을 얻기 위해 적혈구을 빨기도 했죠. 예를 들어 0.5 밀리미터로 치료 적혈구를 준비하는 SS-HPG, 세탁 RBC에서 PBS의 36 μl를 제거하고 SS-HPG 폴리머 솔루션 36 μl를 놓습니다.
3. 소용돌이 부드럽게 정지 1 시간 동안 실온에서 궤도 셰이커에 Eppendorf 튜브에 넣습니다.
4. 4 분 1,000 XG에서 Eppendorf 튜브 원심 분리기하고 표면에 뜨는을 피펫.
5. , 적혈구을 씻고 원심 분리기하고 표면에 뜨는을 제거하는 PBS 1 ML을 추가합니다.
6. 한 ML의 생리를 추가하고 배 5 단계에서 적혈구을 씻는다.
7. 20 % 혈소판의 최종 농도로 가득 적혈구의 100 μl (80 % 혈소판)에 생리 300 μl를 추가합니다.

수정일 적혈구를 HPG의 D. 특성

I.의 보수 매개의 용해

1. 건강한 사람의 기증자로부터 BD vacutainer 유리 혈청 관에 전체 혈액의 8 주변 ML를 수집하고, 30 분 동안 실온에서 응고에 혈액을 수 있습니다.
2. 10 분에 2,000 XG에서 튜브를 원심 분리기와 혈청 3 약 ML를 수집합니다.
3. seru 중 하나 밀리리터m은 열 inactivated 혈청를 준비하는 30 분에 60 ° C에서 물을 욕조에 배치되었습니다.
4. 20 % 혈소판 HPG 수정 적혈구 나 수정되지 않은 적혈구의 60 μl를 포함 Eppendorf 튜브에 신선한 혈청 또는 열 inactivated 혈청 60 μl를 추가합니다.
5. 37 1 시간에 적혈구를 품다 ° C.
6. 세포 현탁액에서 헤모글로빈의 양, 장소 96 잘 플레이트에 세중의에서 수정 적혈구 나 수정되지 않은 세포를 HPG의 20 % 혈소판의 5.9 μl을 수량화 할 수 있습니다. Drabkin의 시약 (spectrophotomerically 헤모글로빈의 양을 정량화하는 데 사용되는 시약)의 294 μl를 추가합니다. 및 아웃 pipetting하여 Drabkin의 시약으로 세포를 섞는다. 스펙트럼 MAX 190 판 리더를 사용하여 540 nm 정도의 헤모글로빈 cyanoderivati​​ve의 흡광도를 측정합니다.
7. 표면에 뜨는에서 헤모글로빈의 양을 정량화하기 위해 1 분에 13,000 XG에서 세포를 원심 분리기. 96 잘 플레이트에 세중의에 표면에 뜨는 장소 50 μl. Drabkin의 시약 250 μl를 추가합니다. Drabkin의 시약과 혼합 세포및 아웃 pipetting하여. 스펙트럼 MAX 190 판 리더를 사용하여 540 nm 정도의 헤모글로빈 cyanoderivati​​ve의 흡광도를 측정합니다.
8. 샘플의 표면에 뜨는에서 헤모글로빈의 비율 (7 단계) 및 총 헤모글로빈 (단계 6) ^{8, 11, 12에서} lysed 세포의 양을 정량화.

II. MTS 카드를 사용하여 전공 및 부전공 항원의 위장

1. 장소 50 Eppendorf 튜브에 HPG 수정 RBC (10 % 혈소판), 1 분 1,000 XG에서 원심 분리기의 μl, 그리고 표면에 뜨는을 제거합니다.
2. 세포 펠렛에 MTS 희석제의 110 μl를 추가하고 및 아웃 pipetting하여 세포 현탁액을 균질화.
3. 각 미니 겔 항목에 세포 현탁액 11 μl를 추가합니다. 또한 동안 젤을 터치하지 마십시오.
4. 원심 분리기 카드 소지자에 MTS 카드를 찾아 6 분에 156 XG에 원심 분리기.
5. 표면 항원의 보호는 제조에 따라, 미니 젤 열에서 RBC의 위치에서 결정된다R 설명입니다.

III. 수성 2 상 파티션 측정

1. Dextran 500 kDa ^13에 따라 (5 % dextran 50 만, 4% PEG 8K, 150 MM NaCl, 10 MM 인산) 구성 / PEG 8 kDa 2 상 분리 시스템을 준비합니다.
2. 두 단계 시스템 (아래의 dextran)을 얻기 위해 실온에서 10 분에 433 XG에 원심 분리기.
3. 조심스럽게 두 단계를 분리합니다.
4. 표시 관 (오목 하단에 있음)에 상부 PEG 단계의 나누어지는 1.0 ML은 flicking하여 부드럽게 20 20% 혈소판 HPG 수정 RBC의 μl와 혼합 셀을 추가 할 수 있습니다.
5. 낮은 단계의 0.5 ML로 세포를 포함하고, flicking에 의해 부드럽게 시스템을 혼합 상단 단계의 0.5 ML를 추가합니다.
6. 분리하고 시스템에서 셀의 위치를​​ 결정하는 시스템 ~ 2 분 동안 벤치에 튜브를 놓습니다. 적혈구의 국산화은 (상단 PEG 단계에서, 낮은 dextran 단계에서 또는 두 가지 모두)을 수정 및 분자의 정도 기능입니다HPG의 무게.

IV. 삼투 취약성 측정

1. 0에서 0.9 (w / V) %로 다양 농도와 NaCl 솔루션을 준비합니다.
2. 1.5 ML Eppendorf 튜브에 NaCl 솔루션의 장소 0.4은 ML.
3. NaCl 솔루션으로 적혈구 (20 % 혈소판)의 20 μl를 추가합니다.
4. 반전 30 분 동안 37 ° C에서 물이 욕조에 넣어하여 신중하게 믹스 세포.
5. 반전으로 조심스럽게 세포를 일시 중지합니다. RBC 서스펜션의 50 μl를 타고 큐벳에 배치 한 ML Drabkin의 시약,에 추가 할 수 있습니다. 및 아웃 pipetting하여 Drabkin의 시약으로 세포를 섞는다. BECKMAN 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 DU 730 UV / VIS 리더를 사용하여 540 nm 정도의 헤모글로빈 cyanoderivati​​ve의 흡광도를 측정합니다.
6. 표면에 뜨는에서 헤모글로빈의 양을 정량화하기 위해 1 분 1,000 XG에서 세포를 원심 분리기. 큐벳에서 Drabkin의 시약 1 ML에 표면에 뜨는 200 μl를 추가합니다. 및 아웃 pipetting하여 Drabkin의 시약으로 세포를 섞는다. hemogl의 흡광도를 측정BECKMAN 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 DU 730 UV / VIS 리더를 사용하여 540 nm의에서 obin cyanoderivati​​ve.
7. 세포 현탁액 (5 단계)에서 헤모글로빈의 총 금액에 표면에 뜨는에있는 금액 헤모글로빈의 비율 (6 단계)에서 다른 NaCl 용액에 lysed 세포의 양을 계산할 수 있습니다.

V. 흐름 세포 계측법 측정 - 리 서스-D의 보호 (RhD)는 항원

1. 5 제어 μl 25 μl의 총 볼륨에 0.5 % BSA와 보충 PBS 버퍼로 세중의에 HPG 수정 적혈구 (20 % 혈소판)을 추가합니다.
2. 지수 Biodiagnostics (PA, USA)에서 구입 한 FITC 단클론 항 리 서스 D (RhD)의 25 μl를 추가합니다.
3. 물 욕조에 37 ° C에서 30 분의 혼합물을 품다.
4. 1.5 ML PBS 버퍼를 두 번으로 혼합물을 씻으십시오. 표면에 뜨는을 제거하려면 1 분 1,000 XG에 원심 분리기.
5. 한 ML의 생리에 적혈구를 일시 중지, 4 ML 흐름 BD의 유동 세포 계측법 관에 정지를 전송합니다.
6. FACSCanto II FLO를 사용하여 분석w cytometer는 RBC 제어 게이트에 5000 이벤트를 수집하고, 분석을 위해 전체 이벤트를 사용합니다.

VI. 유동 세포 계측법 측정 - CD47의 표현

1. 1.54 제어 μl 또는 44 μl의 총 볼륨에 0.5 % BSA와 보충 PBS 버퍼로 세중의에 HPG 수정 적혈구 (20 % 혈소판)을 추가합니다.
2. BD Biosciences (NJ, USA)에서 구입 한 마우스 반 인간 CD47이라는 phycoerythrin (PE) 6 μl를 추가합니다.
3. 물 욕조에 37 ° C에서 30 분의 혼합물을 품다.
4. 두 배에 1.5 ML PBS 버퍼로 혼합물을 씻으십시오. 표면에 뜨는을 제거하려면 1 분 1,000 XG에 원심 분리기.
5. 한 ML의 생리에 적혈구를 일시 중지하고, 세포 거리며 걷게을 최소화하기 위해 26 G 8분의 5 바늘을 통과.
6. 4 ML 흐름 BD의 유동 세포 계측법 관에 정지를 전송합니다.
7. RBC 제어 게이트 만 이벤트를 인수, FACSCanto II 흐름 cytometer를 사용하여 분석합니다.

Representative Results

리 서스 D 항원과 CD47 RBC 표면 단백질의 위장복은 형광 표시 단클론 항체를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 정량화했고, 대표 결과는 그림 1에 있습니다. HPG - 이식 적혈구의 경우 (회색), 신호의 강도는 표면 단백질의 마스킹을 나타내는 세포 표면에 항체에 바인딩의 감소를 나타내는 컨트롤 적혈구 (적색 및 녹색)에 비해 (왼쪽으로 이동 피크) 감소 .

그림 1. 유동 세포 계측법을 사용하여 표면 항원과 단백질의 위장에 대한 평가. )는 붉은 털 원숭이 D (RhD) 보호 : 검은 색 음영 정상이 대조군 (비 수정 적혈구는 IgG1 PE-라벨로 치료)을 나타내는 녹색 정상은 긍정적 인 공동 대표ntrol (비 수정 적혈구는 안티 RhD 형광 항체로 치료), 그리고 회색 피크 안티 RhD 형광 항체의 동일한 양의 치료를 HPG 수정 적혈구를 나타냅니다. B) CD47 : 검은 색 음영 정상이 대조군 (비 수정 적혈구는 PE-라벨 IgG1로 치료)을 나타내는 빨간색 정상은 긍정적 인 제어 (비 수정 적혈구 항 CD47 형광 항체로 치료)를 대표하고, 회색 피크를 나타냅니다 안티 CD47 항체 형광 같은 양의 치료를 HPG 수정 적혈구는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Discussion

유니버설 기증 적혈구는 수혈 치료를위한 강화 혈액 가용성 및 안전에 큰 잠재력을 지니고 있습니다. 적혈구는 오랜 순환 고유 biocompatibility ^{14, 15로} 인해 유망 약물 투여 차량을 간주됩니다. 본 논문에서 제시 실험이 수정 적혈구를 HPG의 체외 특성에를 평가합니다. 체외의 속성과 HPG 수정 적혈구의 생체 유통은 최근 ^{8, 11의} 그룹에 조사되었습니다. NaCl과 인산 나트륨을 보충 Dextran500K/PEG8K의 수성 2 상 시스템에서 적혈구의 파티션은 적혈구 표면 전하와 표면 당 단백질 성분 ¹⁶ 따라 달라집니다. HPGs과 RBC glycocalyx 수정의 범위에 따라 수정 된 적혈구는 상단 PEG 단계로 낮은 dextran에서 파티션 경향이 있습니다. 두 단계 시스템은 RBC 표면 수정의 범위 손쉬운 평가를 제공합니다. 용해 Oautologous 혈청에서 F의 적혈구는 세포 및 생물학적 표면에 새로운 자료를 소개 이후 외국인과 면역 시스템 매개의 용해 및 정리 ^17에 따라 렌더링, 수정 적혈구를 HPG 것은 보완 활성화를 트리거하는지 여부, 조사 할 중요한 시험입니다. 삼투 취약성 실험은 반면에, 기계적 성질 및 RBC 막의 deformability가 접목를 HPG의 결과로 손상된되어 있는지 여부를 나타냅니다. 적혈구의 deformability은 신체의 다른 부분에 _O이 인도의 생리적 기능에 대한 것이 중요합니다. 이 실험에서 수정 적혈구는 NaCl의 다른 농도로 처리하고, lysed 세포의 %를 정량화하여 변형 스트레스에 노출되어있다.

유동 세포 계측법은 해당 형광등 라와 RBC의 표면에 특정 항원을 반응하여 표면 항원과 표면 단백질 보호 (그림 1)의 범위를 평가하는 데 사용됩니다항체를 같이 갈. 리 서스 D 항원의 보호 범위는 유동 세포 계측법을 사용하여 평가됩니다. 항원의 마스킹은 적혈구에 바인딩 항체의 감소에서 분명하다. 리 서스 D 항원 마스킹도 MTS 카드에 의해 평가됩니다. MTS 카드는 널리 적혈구의 phenotyping에 병원에서 혈액 연구소에 사용됩니다. 예를 들어, A-그룹 RBC는 A-타입 MTS 카드에 위치하고 때, 세포는 해당 단클론 항체와 반응의 결과로 교착. 그러나, B-그룹 피가 교착하지 않습니다와 미니 젤의 하단으로 이동. 응집의 개념이 접목를 HPG 것은 적혈구에 제공하는 보호의 수준을 평가하는 데 사용되었습니다. HPG - 이식 적혈구는 표면 항원 보호의 수준에 따라, 미니 젤 열을 투과 해 들어 갔던 것이다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycidol	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Trimethylolpropane	Fluka		(ON, Canada)
Potassium methylate	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Anhydrous pyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
4-Dimethylaminopyridine	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Succinic anhydride	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Acetone	Fisher Scientific		(ON, Canada)
Anhydrous dimethyl formamide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N-Hydroxysuccinimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
MTS cards			Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA)
Dextran 500 kDa	Pharmacia Fine Chemicals		(Sweden)
PEG 8 kDa	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD)	Quotient Biodiagnostics		(PA, USA)
PE monoclonal anti-CD47	BD Biosciences		(NJ, USA)
Drabkin's reagent	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis.