Summary
细胞膜的变形例的红血细胞（红细胞），超支化聚甘油（HPG）。修改红细胞进行了表征双水相分割，渗透脆性和补体介导的溶解。使用流式细胞仪和微的打字系统（MTS）的血液分型卡的表面蛋白抗原的伪装进行了评估。
Abstract
红细胞（RBC）输血是用于治疗急性和慢性的医疗问题，如重型地中海贫血和镰状细胞贫血1-3一些至关重要的。由于众多的RBC表面上的（〜308已知抗原4），在慢性输血治疗的患者发展由于丢失如同输血红细胞4，5的轻微上的抗原的同种抗体的抗原的存在下。接枝亲水性聚合物，如聚乙二醇（PEG）和超支化聚甘油（HPG）的形成，RBC膜排除层上防止表面抗原的抗体的相互作用，而不会影响通过小分子如氧，葡萄糖，和离子3。目前，没有一种方法是可用于普遍的红血供体细胞的产生部分是因为大量抗原（基于蛋白质和碳水化合物）的存在下对RBC表面和d提出严峻的挑战才有发展这种方法将大大提高输血的安全性，并显着提高红细胞的可用性和使用。在这份报告中，提出的实验，是用来开发抗原保护功能红细胞由HPG及其表征膜接枝。 HPGs高度生物相容性紧凑的聚合物6，7，并预期位于小区内的的糖萼围绕的脂质膜8，9和掩模RBC表面抗原10，11。
Protocol
A.超支化的聚甘油改造（SS-HPG）
- 地点冻干HPG 60 kDa的（0.5克，0.0083毫摩尔）在一个圆底烧瓶中，并真空下干燥过夜，在90℃下
- 冷藏烧瓶至室温，并溶解在无水吡啶（3ml）中的干燥的HPG。
- 若要官能约8个羟基基团与羧基基团上HPG，添加催化量的二甲基氨基吡啶（5毫克/毫升的吡啶溶液一滴）的HPG溶液。到该混合物中，加入琥珀酸酐，（0.0067克，0.0664毫摩尔）溶解在0.5毫升吡啶在10分钟内逐滴。在氩气下在室温下搅拌该混合物过夜。
- 沉淀的混合物于40毫升冷的丙酮（4℃），在50毫升的离心管中，离心使用Beckman J2-MC离心机以27,000 xg离心15分钟。滗析出上清液，并除去残留的丙酮中，在室温下用氩气冲洗。
- 要激活的羧基升用琥珀酰亚胺琥珀酸酯（SS）的基团的基团，溶解在3ml无水DMF中的羧基官能化的HPG。加入N-羟基琥珀酰亚胺（0.0077克，0.0664毫摩尔）和N，N'-二异丙基碳二亚胺（0.0084克，0.0664毫摩尔）的HPG溶液，并在氩气下在室温下搅拌该混合物过夜。
- 冷丙酮中沉淀，净化SS-HPG。
- 除去残留的丙酮中，通过用氩气冲洗。
- 改性的HPG和羧基和SS的官能化程度的质子（1 H） - NMR分析确定的纯度。
B.全血的收集和分离的红血细胞（红细胞）
- 收集全血（40％的血细胞比容，3毫升），从同意健康的人供体的成柠檬酸vacutainer管的。
- 离心柠檬酸管在1,000 xg离心4分钟。
- 除去上清液，含有血浆和血小板，和中间的血沉棕黄层，包含白血细胞和platele日ts使用巴斯德吸管。
- 转移到一个12毫升的猎鹰离心管中的填充的红细胞（血细胞比容80％，1.2毫升），并添加PBS缓冲液（8毫升，pH值= 8.0）洗红细胞。
- 通过反演获得细胞分布均匀混合的红细胞。
- Falcon管离心在1000 XG 4分钟，去除上清。
- 洗净红细胞用PBS两次通过重复步骤5和6。
- 地点包装-红细胞（100微升）在1.6 ml Eppendorf管中，添加PBS缓冲液（300微升，pH值= 8.0），得到20％的血细胞比容的红细胞。
C.红细胞HPG嫁接
- 后立即沉淀变形的HPG在丙酮中，在步骤A6中，地点SS-HPG（150毫克），在玻璃小瓶（1打兰），和溶解在PBS缓冲液（300微升，pH值= 8.0）。
- SS-HPG的聚合物溶液添加到20％的血细胞比容洗涤红细胞，得到最终体积为400μl和SS-HPG浓度，取值范围从0.5毫米到3毫米。例如，准备用0.5毫米的红细胞SS-HPG，取出36微升PBS洗涤后的红细胞和SS-HPG的聚合物溶液放置36微升。
- 涡的悬浮液轻轻Eppendorf管中放置1小时，在室温下轨道摇床。
- 离心的Eppendorf管中，以1,000×g离心4分钟，并移液上清液。
- 加入1ml的PBS洗红细胞，离心并除去上清液。
- 加入1 ml生理盐水和清洗红细胞的两倍，在步骤5中。
- 加入300μl的生理盐水100μl的包装红细胞（血细胞比容80％）至终浓度为20％的血细胞比容。
D.表征丘脑 - 垂体 - 性腺修改红细胞
一，补体介导的裂解
- 收藏报错全血的8毫升左右从健康的人供体到BD真空容器玻璃血清管，并在室温下搅拌30分钟，使血液凝块。
- 离心管在2,000 xg离心10分钟，并收集3毫升血清左右。
- 1毫升的SERU米，在60℃下在水浴中放置30分钟以制备热灭活血清。
- 新鲜血清或热灭活的血清中加入60μl到Eppendorf管中，包含60微升20％的血细胞比容的HPG改性红细胞或未修改的红细胞。
- 孵育红细胞1小时在37℃下
- 要量化的细胞悬浮液中的血红蛋白量，5.9微升20％的血细胞比容的HPG改性红细胞或未修饰的细胞在96孔板的一式三份。添加294微升德拉布坎试剂（试剂，用于量化的血红蛋白量spectrophotomerically）。德拉布坎的试剂混合细胞通过移液中出。测量使用SPECTRA MAX 190板读数器在540 nm处的吸光度的血红蛋白cyanoderivative的。
- 为了定量上清液中的血红蛋白量，离心细胞以13,000 xg离心1分钟。将50μl的上清液在96孔板的一式三份。加入250μl德拉布坎的试剂。混合细胞与德拉布坎的试剂通过移液中和了。测量使用SPECTRA MAX 190板读数器在540 nm处的吸光度的血红蛋白cyanoderivative的。
- 量化裂解细胞的量，从上清液中血红蛋白的比率（步骤7）和样品中的总的血红蛋白（步骤6），8，11，12。
II。主要和次要抗原使用MTS牌的伪装
- 将50微升的HPG改性的RBC（血细胞比容10％）在Eppendorf管中，离心机在1000×g离心1分钟，并除去上清液。
- 加入110微升的MTS稀释剂的细胞沉淀，并通过移液和细胞悬浮液均匀。
- 将11微升的细胞悬浮液添加到每个微型硅胶柱。避免接触凝胶在另外。
- 找到MTS卡，成离心机卡持有人，并在156 XG离心6分钟。
- 保护表面抗原从RBC在迷你硅胶柱的位置，测定基础上制造R描述。
III。双水相分割的测量
- 准备葡聚糖500 kDa的/ PEG 8 kDa的两相分离系统（5％葡聚糖500k的，4％PEG 8K，150mM的NaCl，10mM磷酸盐）根据13组成。
- 在433×g离心10分钟，在室温下离心，得到的两相体系（葡聚糖在底部）。
- 仔细分开的两个阶段。
- 上PEG阶段，进入一个的标记管（凹底）分装1.0毫升，加入20μl的20％HPG修饰RBC红细胞压积和混合细胞轻轻弹。
- 加入0.5毫升的上层相，包含细胞低级相0.5毫升，并轻轻地混合系统由轻拂。
- 〜2分钟的系统分离，并确定细胞的位置，在系统中的管放置在板凳上。本地化的红细胞（PEG相的上部，在下部的葡聚糖相或两个）是函数的程度的修饰和分子重量HPG。
IV。渗透的脆弱测量的
- 准备NaCl溶液的浓度范围从0到0.9（重量/体积）％。
- 地点NaCl溶液0.4毫升1.5毫升的Eppendorf管。
- 加入20μl的红细胞（血细胞比容20％）的NaCl溶液中。
- 混合细胞仔细的反转，并将其放置在37℃的水浴中30分钟。
- 仔细悬浮细胞，通过倒置。取50微升RBC悬浮液，并把它添加到1毫升德拉布坎的试剂，放置在一个反应杯中。德拉布坎的试剂混合细胞通过移液中出。测量的吸光度的血红蛋白cyanoderivative的，在540nm处，用BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS读者。
- 为了定量上清液中的血红蛋白量，离心细胞在1,000×g离心1分钟。加入200μl的上清液到1毫升德拉布坎的试剂中的比色皿。德拉布坎的试剂混合细胞通过移液中出。测量吸光度的hemogl的在540 nm处，用BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS读者的obin cyanoderivative。
- 计算从上清液中的量血红蛋白的比率（步骤6）中的细胞悬浮液（步骤5）的总的血红蛋白量不同的NaCl溶液中溶解的量的细胞。
五，流式细胞仪测量 - 保护恒河猴-D抗原（RHD）
- 添加5μl的控制或的HPG改性红细胞（20％血细胞比容）补充到总体积为25μl的0.5％BSA的PBS缓冲液，一式三份。
- 加入25μLFITC单克隆抗恒河猴D（RHD）购买商Biodiagnostics（PA，USA）。
- 在水浴中，在37℃下孵育30分钟的混合物。
- 洗净的混合物用1.5ml PBS缓冲液两次。离心1,000 xg离心1分钟，以除去上清液。
- 暂停红细胞1 ml生理盐水，暂停并转移到4毫升流BD流式细胞仪检测管。
- 分析使用FACSCanto II FLO瓦特流式细胞仪，获得5000 RBC控制栅极上的事件，并使用整个的事件进行分析。
VI。流式细胞仪测量 - CD47的表达
- 添加1.54微升的控制或的HPG改性红细胞一式三份补充到总体积为44微升的0.5％BSA的PBS缓冲液（20％血细胞比容）。
- 加入6微升藻红蛋白（PE）标记的小鼠抗人CD47购自BD Biosciences公司（新泽西州，美国）。
- 在水浴中，在37℃下孵育30分钟的混合物。
- 洗净两次用1.5ml PBS缓冲液的混合物。离心1,000 xg离心1分钟，以除去上清液。
- 暂停红细胞1 ml生理盐水，通过26 G 5/8针，以减少细胞结块。
- 暂停转移到4毫升流BD流式细胞仪检测管。
- FACSCanto II流式细胞仪分析使用，获得10000个事件的RBC控制门。
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Representative Results
迷彩恒河猴D抗原和CD47 RBC表面蛋白的流式细胞仪定量，使用荧光标记的单克隆抗体，和具有代表性的结果在图1中给出。在HPG-接枝红细胞的情况下（灰色），该信号的强度降低（峰转移至左）相比，控制红细胞（红色和绿色），表示表示掩蔽的表面蛋白的细胞表面结合的抗体减少。
图1。的伪装表面抗原和蛋白质，用流式细胞仪评价。 A）恒河猴D（RHD）保护：黑色阴影峰代表阴性对照组（非改性红细胞与PE标记IgG1的处理），绿峰代表的积极合作ntrol（与反例RhD荧光抗体治疗非改性红细胞），和灰色峰代表用相同的反例RhD荧光抗体量的的HPG改性红细胞。 B）CD47：黑色阴影峰代表阴性对照组（未改性的红细胞用PE-标记的IgG1的），红色的峰值表示阳性对照（未改性的红细胞与抗-CD47荧光抗体）处理，和灰色的峰代表丘脑-垂体-性腺红细胞与同等数量的抗CD47荧光抗体治疗。 点击此处查看大图 。
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Discussion
万能供血者红细胞有很大的潜力，在提高血液的输血治疗的有效性和安全性。红细胞也被认为是有前途的药物运输车辆，由于其长循环和固有的生物相容性，14日，15。本文提出的实验评估丘脑-垂体-性腺修改红细胞在体外的特点。 体外性能和丘脑-垂体-性腺修改红细胞在体内循环，本集团已在最近8，11。 Dextran500K/PEG8K双水相体系中，补充盐和钠磷酸盐，红细胞的分区依赖于红细胞表面电荷和表面的糖蛋白组合物16。根据HPGs RBC糖萼改性的程度，改性红细胞往往分区从下部葡聚糖上的PEG相。两相体系提供一个浅显的RBC表面改性的程度评价。裂解Øf红细胞自体血清中大量的测试，调查，是否丘脑-垂体-性腺修改红细胞触发补体激活，因为引进新材料，细胞和生物表面呈现外资和免疫系统介导的溶解和清除17。渗透脆性试验，另一方面，表示作为一个结果，HPG接枝RBC膜的机械性能和可变形性是否已经被泄漏。红细胞的变形是很重要的生理功能的O 2交付到不同的身体部位。改性在本实验中的红细胞是通过用不同浓度的NaCl，和量化％的溶解细胞暴露变形应力。
流式细胞术是用来评价表面抗原和表面蛋白保护（ 图1）的范围内，通过红细胞的表面上的一个特定的抗原反应，而其对应的荧光拉喇叭口的抗体。恒河猴D抗原保护的程度进行评估，采用流式细胞术。抗原的掩蔽是显而易见的，从减少抗体结合的RBC。恒河猴D抗原屏蔽也评价由MTS牌。 MTS卡被广泛应用于表型的红细胞在医院血液学实验室。例如，当位于A组红细胞在A型的MTS卡，细胞凝集反应的结果与相应的单克隆抗体的反应。然而，B组血液不凝集，到的迷你凝胶底部。凝集的概念被用于评估HPG接枝红细胞提供的保护级别。 HPG-接枝红细胞贯通迷你硅胶柱，根据表面抗原的保护水平。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
资助这项研究是由加拿大血液服务（CBS）和加拿大研究所（CIHR）健康科学的研究合作基金。作者感谢的LMB高分子枢纽的UBC血液研究中心的研究设施的使用。基础设施的支持，加拿大创新基金会（CFI）和迈克尔史密斯健康研究基金会（MSFHR）。河Chapanian是一个收件人（CIHR / CBS）在输血科学博士后奖学金和收件人的MSFHR研究实习生博士后奖学金。 JN Kizhakkedathu是一个收件人的MSFHR生涯研究学者奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycidol | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Trimethylolpropane | Fluka | (ON, Canada) | |
| Potassium methylate | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Anhydrous pyridine | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| 4-Dimethylaminopyridine | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Succinic anhydride | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Acetone | Fisher Scientific | (ON, Canada) | |
| Anhydrous dimethyl formamide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| MTS cards | Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA) | ||
| Dextran 500 kDa | Pharmacia Fine Chemicals | (Sweden) | |
| PEG 8 kDa | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD) | Quotient Biodiagnostics | (PA, USA) | |
| PE monoclonal anti-CD47 | BD Biosciences | (NJ, USA) | |
| Drabkin's reagent | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis. | |||
References
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