Summary
多分岐ポリグリセロールと赤血球（RBC）（HPG）の細胞膜修飾が提示される。修正された赤血球は、水性二相のパーティショニング、浸透圧抵抗と補体媒介細胞溶解を特徴としていた。表面タンパク質と抗原の迷彩は、フローサイトメトリーとマイクロタイピングシステム（MTS）の血液表現型カードを使用して評価した。
Abstract
赤血球（RBC）輸血は、サラセミアメジャーおよび鎌状赤血球貧血の1から3のように、急性および慢性の医学的な問題の数の治療のために不可欠です。 RBC表面上の抗原の多数の存在（〜308既知の抗原4）のために、慢性的な輸血療法の患者は、輸血赤血球4,5のマイナー抗原のミス·マッチに起因する同種抗体を開発しています。ポリエチレングリコール（PEG）およびハイパーブランチポリ（HPG）などの親水性ポリマーのグラフト化することは、酸素、ブドウ糖、イオン3のような小さな分子の通過に影響を与えることなく、表面抗原と抗体の相互作用を防止するRBC膜上の除外層を形成する。現時点では方法だとRBC表面上の抗原の数が多い（タンパク質と炭水化物ベース）の存在とdによって提示された困難な課題の一部にユニバーサル赤血球ドナー細胞の生成のため利用できませんこのような方法のevelopmentが大幅に輸血の安全性を向上させ、飛躍的に赤血球の可用性および使用を改善します。本報告では、HPGとその評価のグラフト膜によって保護された官能赤血球抗原を開発するために使用されている実験が掲載されています。 HPGsは非常にコンパクトなポリマー6,7、生体適合性であり、脂質膜8,9とマスク赤血球表面抗原10,11を囲む細胞糖衣内に配置されると予想されます。
Protocol
A.ハイパーブランチポリグリセリンの変更（SS-HPG）
- 場所は、丸底フラスコ中の60 kDaの（0.5グラム、0.0083 mmol）をHPG凍結乾燥させ、90℃で真空下で一晩乾かし℃に
- 室温にフラスコを冷蔵、無水ピリジン（3ml）中の乾燥HPGを溶かす。
- カルボキシル基とHPGで約8個のヒドロキシル基を官能基化するには、HPGの溶液に触媒量のジメチルアミノピリジン（ピリジン中5 mg / mlの溶液を1滴）を追加します。この混合物に、10分かけて0.5ミリリットルを滴下ピリジンに溶解し、無水コハク酸、（0.0067グラム、0.0664 mmol）を追加します。アルゴン下、室温で一晩混合物をかき混ぜる。
- 50 mlの遠心チューブに冷アセトン（4℃）40mlに混合物を沈殿させ、15分間27000×gでベックマンJ2-MCの遠心分離器を用いて遠心分離する。上清をデカントし、室温でアルゴンで洗浄することによって残留アセトンを除去する。
- カルボキシをアクティブにするにはスクシンイミジルスクシネート（SS）のグループとL基は、無水DMF（3ml）にカルボキシル官能HPGを溶かす。 HPG液にN-ヒドロキシスクシンイミド（0.0077グラム、0.0664 mmol）およびN、N'-ジイソプロピルカルボジイミド（0.0084グラム、0.0664 mmol）を追加し、アルゴン下、室温で一晩混合物をかき混ぜる。
- 冷アセトンで沈殿させることにより、SS-HPGを精製する。
- アルゴンで洗浄することによって残留アセトンを削除します。
- NMR分析-変更HPGの純度とプロトン（1 H）によるカルボキシルおよびSS官能化度を決定します。
B.全血採取し、赤血球の分離（赤血球）
- クエン酸バキュテイナチューブに健康なヒトのドナーを承諾から全血（40％ヘマトクリット、3ミリリットル）を採取します。
- 4分間1,000×gでクエン酸塩チューブを遠心します。
- 血漿や血小板を含む上清を取り出して、白血球やplateleを含む中間軟膜パスツールピペットを用いてTS。
- 12ミリリットルファルコンの遠心管に濃厚赤血球（80％ヘマトクリット、1.2ミリリットル）を転送し、赤血球を洗浄するために、PBSバッファー（8ミリリットル液、pH = 8.0）を追加します。
- 均一な細胞分布を得るために反転することによって赤血球を混ぜる。
- 4分間1,000×gでファルコンチューブを遠心し、上清を除去する。
- ステップ5と6を繰り返して、PBSで2回以上で赤血球を洗浄します。
- 1.6ミリリットルエッペンドルフチューブに入れ、パック-赤血球（100μl）を、20％ヘマトクリット赤血球を取得するためにPBS緩衝液（300μlの液、pH = 8.0）を追加します。
C. HPGは赤血球へのグラフト
- 直ちにステップA6のアセトン中の変性HPGの降水量、ガラスバイアル（1 DRAM）で行われ、SS-HPG（150 mg）を加え、PBS緩衝液（300μlの液、pH = 8.0）でそれを溶解した後。
- 20％ヘマトクリットにSS-HPGポリマー溶液を加えると、最終的に400μlの体積および0.5mM〜3mmの範囲で、SS-HPG濃度を得るために、赤血球を洗浄した。例えば0.5mMのSS-で処理赤血球を準備するHPG、洗浄赤血球からのPBS 36μlを削除するとSS-HPGのポリマー溶液36μlを置く。
- 渦優しくサスペンション、1時間室温でオービタルシェーカー上のエッペンドルフチューブを配置します。
- 4分間1,000×gでエッペンドルフチューブを遠心分離し、上澄みをピペットで。
- 、赤血球を洗浄し遠心分離し、上清を除去するために1mlのPBSを加える。
- 1 mlの生理食塩水を追加し、2倍のステップ5で赤血球を洗浄してください。
- 20％ヘマトクリットの最終濃度に濃厚赤血球液100μl（80％ヘマトクリット）に生理食塩水を300μlを加える。
変性赤血球をHPG】D.クタリゼーション
I.補体媒介性溶解
- 健康なヒトのドナーからBDバキュテイナガラス血清分離管に全血の約8ミリリットルを採取し、30分間室温で血液凝固を可能にします。
- 10分間2000 xgでチューブを遠心分離し、血清の約3ミリリットルを収集します。
- 出せるの1ミリリットルmは、熱不活性化血清を準備するために30分間60℃の水浴中に入れた。
- 20％ヘマトクリットHPG修正赤血球または変更されていない赤血球の60μlを含むエッペンドルフチューブに新鮮な血清または熱不活性化血清60μlを添加する。
- 37℃で1時間、赤血球をインキュベート℃に
- 場所96ウェルプレートに三重に変更された赤血球、あるいは非改変細胞をHPG 20％のヘマトクリット値の5.9μlの細胞懸濁液中のヘモグロビンの量を定量する。 Drabkin試薬（spectrophotomericallyヘモグロビンの量を定量するために使用される試薬）294μlを添加する。 inとoutペッティングによりDrabkinの試薬で細胞を混ぜる。 SPECTRA MAX 190プレートリーダーを用いて540nmでヘモグロビンcyanoderivativeの吸光度を測定します。
- 上清中のヘモグロビンの量を定量化するために、1分間13000×gで細胞を遠心分離します。 96ウェルプレートで三重に上清50μlを置きます。 Drabkinの試薬250μlを添加する。 Drabkinの試薬で細胞を混ぜるinとoutピペッティングで。 SPECTRA MAX 190プレートリーダーを用いて540nmでヘモグロビンcyanoderivativeの吸光度を測定します。
- サンプルの上清中のヘモグロビンの割合（ステップ7）、総ヘモグロビン（ステップ6）8、11、12から溶解した細胞の量を定量化する。
Ⅱ。 MTSのカードを使用してメジャーとマイナー抗原のカモフラージュ
- 場所は50エッペンドルフチューブに変更されたRBC（10％ヘマトクリット）HPGμlの、1分間1,000×gで遠心分離し、上清を除去します。
- 細胞ペレットにMTS希釈液の110μlを添加し、内と外、ピペッティングにより細胞懸濁液を均質化する。
- 各ミニゲルカラムに細胞懸濁液11μlを添加する。添加の間にゲルを触れないようにしてください。
- 遠心分離機のカードホルダーにMTSのカードを見つけて、6分間156×gで遠心分離します。
- 表面抗原の保護は製造に基づいて、ミニゲルカラムにおけるRBCの位置から決定されるrを説明。
Ⅲ。水性二相分配測定
- デキストラン500kDaの13による（5％デキストラン500K、4％PEG 8K、150mMのNaCl、10mMのリン酸）から成る/ PEG 8 kDaの2相分離システムを準備します。
- 二相系（下におけるデキストラン）を取得するために室温で10分間、433×gで遠心分離します。
- 慎重に二つの相を分離します。
- 標識されたチューブ（凹状の底付き）に上位のPEG相のアリコート1.0mlを、フリックで優しく20 20パーセントヘマトクリットHPG改変RBCの添加および混合セルを追加します。
- 下相0.5mlに細胞が含まれており、フリックで優しくシステムを混在させる上相の0.5 mlを加える。
- 分離して、システム内のセルの位置を決定するシステムのための〜2分間ベンチにチューブを置きます。 RBCのローカリゼーションは、（上部のPEG相で、低いデキストラン相または両方で）修飾の程度への関数であり、分子HPGの重量。
Ⅳ。浸透圧抵抗の測定
- 0〜0.9（W / V）％の範囲の濃度のNaCl溶液を準備します。
- 1.5mlのエッペンドルフチューブにNaCl溶液の代わりに0.4ミリリットル。
- NaCl溶液中に赤血球（20％ヘマトクリット値）の20μlを添加する。
- 反転し、30分間37℃の水浴中にそれらを置くことによって注意深くミックス細胞。
- 逆さにして慎重に細胞を一時停止します。 RBC懸濁液50μlを取り、キュベットに入れ、1ミリリットルDrabkinの試薬に追加します。 inとoutペッティングによりDrabkinの試薬で細胞を混ぜる。ベックマン·コールターのDU 730 UV / VISリーダーを用いて540nmでヘモグロビンcyanoderivativeの吸光度を測定します。
- 上清中のヘモグロビンの量を定量化するために、1分間、1,000×gで細胞を遠心分離します。キュベット内のDrabkinの試薬1mlに上清を200μl加え。 inとoutペッティングによりDrabkinの試薬で細胞を混ぜる。 hemoglの吸光度を測定するベックマン·コールターのDU 730 UV / VISリーダーを用いて540nmにおけるobin cyanoderivative。
- 上清中のヘモグロビン量の比（ステップ6）からの細胞懸濁液（ステップ5）中のヘモグロビンの総量に対して異なるNaCl溶液中に溶解した細胞の量を計算します。
Vのフローサイトメトリー測定 - アカゲザル-D（RHD）抗原の保護
- 5コントロールのμlまたは25μlの全体積の0.5％BSA添加PBSバッファへの三連でHPG修正された赤血球（20％ヘマトクリット）を追加します。
- 商Biodiagnostics（PA、USA）から購入したFITCモノクローナル抗アカゲザルD（RHD）の25μlを添加する。
- 水浴中で37℃で30分間混合物をインキュベートする。
- 1.5ミリリットルのPBS緩衝液と混合して2回洗浄する。上清を除去するために、1分間1,000×gで遠心分離します。
- 1mlの生理食塩水に赤血球をサスペンドし、4mlのフローBDのフローサイトメトリーチューブに懸濁液を移す。
- FACSCanto II floのを使用して分析するワットメーター、RBCの制御ゲートに5000のイベントを取得し、分析のために全体のイベントを使用します。
Ⅵ。フローサイトメトリーの測定 - CD47の発現
- 44μlの全体積の0.5％BSA添加PBSバッファへ三重で1.54制御μlまたはHPG修正赤血球（20％ヘマトクリット）を追加します。
- BD Biosciences社（ニュージャージー州、米国）から購入したマウス抗ヒトCD47のラベルが付いたフィコエリトリン（PE）の6μlを添加する。
- 水浴中で37℃で30分間混合物をインキュベートする。
- 2回1.5ミリリットルPBS緩衝液で混合物を洗浄します。上清を除去するために、1分間1,000×gで遠心分離します。
- 1mlの生理食塩水に赤血球を一時停止し、細胞凝集を最小限に抑えるために26 G 5月8日針を通過。
- 4mlのフローBDのフローサイトメトリーチューブに懸濁液を移す。
- RBCの制御ゲートに10,000のイベントを取得し、FACSCanto IIフローサイトメーターを用いて分析します。
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Representative Results
アカゲザルD抗原およびCD47 RBC表面タンパク質の迷彩は、蛍光標識されたモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによって定量化した、代表的な結果を図1に示されている。 HPG-グラフト赤血球（灰色）の場合では、信号の強度は表面タンパク質のマスキングを示す細胞表面への抗体への結合の減少を示す制御赤血球（赤＆緑）に比べて（ピークが左にシフト）減少。
図1：フローサイトメトリーを用いた表面抗原およびタンパク質の迷彩の評価。 ）アカゲザルD（RHD）保護：ブラックシェーディングピークは陰性対照（非変性赤血球は、IgG1 PE標識で処理された）を表し、緑のピークは正の協調を表すntrol（抗RHD蛍光抗体で処置した非変性赤血球）、グレーピークは抗RHD蛍光抗体の同じ量で処理HPG修正された赤血球を表しています。 CD47は、B）：ブラックシェーディングピークはネガティブコントロール（PE標識IgG1ので治療非変性赤血球）を表し、赤のピークは、ポジティブコントロール（抗CD47蛍光抗体で処置した非変性赤血球）を表し、グレーのピークを表しHPG、抗CD47蛍光抗体同じ量で処理した赤血球を変更しました。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
ユニバーサルドナーの赤血球は輸血療法のための増強血液の可用性と安全性に大きな可能性を秘めている。 RBCはまた、彼らの長い循環と内在する生体適合性14、15に起因する有望な薬物送達ビヒクルと見なされます。本書で提示実験は、修正された赤血球をHPGのin vitroでの特性評価を行った。 in vitroでのプロパティと HPG修正赤血球の in vivoでの循環における最近8、11我々のグループで研究されてきた。 NaClおよびリン酸ナトリウムを補充Dextran500K/PEG8Kの水性二相系、赤血球内のパーティションには、赤血球の表面電荷にと表面糖タンパク質組成物16に依存します。 HPGsとRBC糖衣修飾の程度に応じて、修正されたRBCは低いデキストランから上部のPEG相にパーティションする傾向がある。二相系は赤血球表面改質の程度の安易な評価を提供します。溶解O自己血清のF赤血球は、細胞や生体表面に新しい材料を導入するので、彼らは外国人と免疫系媒介溶解およびクリアランス17〜件名レンダリング、修正された赤血球をHPGは補体活性化をトリガーするかどうか、調査するために重要なテストです。浸透圧抵抗試験は、他の一方で、移植をHPGの結果として侵害された機械的特性およびRBC膜の変形能かどうかを示します。赤血球の変形能は、体のさまざまな部分にO 2運搬の生理的機能のために重要である。この実験では修正されたRBCは、NaClの異なる濃度で処理し、溶解した細胞の割合を定量することにより、変形応力にさらされている。
フローサイトメトリーは、それに対応する蛍光ラと赤血球の表面上の特定の抗原を反応させることにより、表面抗原および表面タンパク質の保護（ 図1）の程度を評価するために使用されbelled抗体。アカゲザルD抗原保護の範囲は、フローサイトメトリーを用いて評価されます。抗原のマスキングは、赤血球に結合する抗体の減少から明らかである。アカゲザルD抗原のマスキングもMTSのカードで評価されます。 MTSのカードは広く赤血球の表現型解析のために病院で血液検査室で使用されています。たとえば、グループのRBCは型MTSカードに配置されている場合は、細胞が対応するモノクローナル抗体との反応の結果として凝集させる。しかし、B群の血が凝集やミニゲルの下に移動しません。凝集の概念は、赤血球へのグラフト提供をHPGする保護のレベルを評価するために使用されていました。 HPG-グラフト赤血球は表面抗原の保護のレベルに応じて、ミニゲルカラムを貫通している。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、カナダ血液サービス（CBS）と健康科学（CIHR）研究パートナーシップ基金のカナダの協会によって資金を供給された。作者は彼らの研究施設の使用のために血の研究のためにUBCのセンターでLMB高分子ハブに感謝します。インフラ施設は、イノベーションのためのカナダの基礎（CFI）と健康研究のためのマイケル·スミス財団（MSFHR）によってサポートされています。 R. Chapanianは輸血科学MSFHR研究研修生ポスドクフェローシップのレシピエントにおける（CIHR / CBS）のポスドクの受賞者です。 JN KizhakkedathuはMSFHRキャリア調査官Scholarの賞の受賞者です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycidol | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Trimethylolpropane | Fluka | (ON, Canada) | |
| Potassium methylate | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Anhydrous pyridine | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| 4-Dimethylaminopyridine | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Succinic anhydride | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Acetone | Fisher Scientific | (ON, Canada) | |
| Anhydrous dimethyl formamide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| MTS cards | Micro Typing System (MTS) cards (FL, USA) | ||
| Dextran 500 kDa | Pharmacia Fine Chemicals | (Sweden) | |
| PEG 8 kDa | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD) | Quotient Biodiagnostics | (PA, USA) | |
| PE monoclonal anti-CD47 | BD Biosciences | (NJ, USA) | |
| Drabkin's reagent | Sigma Aldrich | (ON, Canada) | |
| Table. Chemicals and reagents used for the grafting of HPG polymers to RBC membrane and their analysis. | |||
References
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