Isolering och odling av Mus Kortikala Astrocyter
Summary
Astrocyter har erkänts vara mångsidiga celler som deltar i grundläggande biologiska processer som är nödvändiga för hjärnans normala utveckling och funktion, och centrala nervsystemet reparation. Här presenterar vi ett snabbt förfarande för att erhålla rena kulturer mus astrocyt att studera biologi denna viktiga klass av centrala nervsystemet celler.
Abstract
Astrocyter en riklig celltyp i däggdjurshjärnan, men mycket återstår att lära om deras molekylära och funktionella egenskaper. In vitro astrocyt cellodlingssystem kan användas för att studera de biologiska funktionerna hos dessa gliaceller i detalj. Denna video protokoll visar hur man får rena astrocyter genom isolering och odling av blandade kortikala celler mus ungar. Metoden är baserad på frånvaro av viabla neuroner och separationen av astrocyter, oligodendrocyter och mikroglia, de tre viktigaste gliala cellpopulationer i det centrala nervsystemet, i odling. Representativa bilder under de första dagarna av odling visar närvaron av en blandad cellpopulation och ange tidpunkt när astrocyter blir sammanflytande och bör skiljas från mikroglia och oligodendrocyter. Dessutom visar vi renhet och astrocytisk morfologi av odlade astrocyter med immunocytokemiska färgningar för väl etablerade ochnyligen beskrivna astrocyt markörer. Detta odlingssystem kan lätt användas för att erhålla rena mus astrocyter och astrocyt-konditionerat medium för att studera olika aspekter av astrocyt biologi.
Introduction
Astrocyter är en mycket riklig celltyp i det centrala nervsystemet (CNS). Förhållandet av astrocyter till neuroner är 1:3 i cortex hos möss och råttor, medan det finns 1,4 astrocyter per neuron i den humana hjärnbarken 1. Intresset för astrocyt funktion har ökat dramatiskt de senaste åren. En viktig funktion hos astrocyter är deras roll för att ge struktur och metabolisk stöd till nervceller 2,3. Nyupptäckta roller för astrocyter täcker ett brett spektrum av funktioner. Dessa inkluderar att styra migration av att utveckla axoner och vissa neuroblaster under utveckling 4-6, fungerar i synaptisk transmission, synaps styrka och informationsbehandling av neurala kretsar 7-9, roller i blod-hjärnbarriären (BBB) bildning 10 och integritet 11-13 och reglering av cerebrovaskulär ton 14. En annan viktig egenskap hos astrocyter är deras svar på skada. Under patologiska betingelser astrocytes bli reaktiv och vidare uppreglera uttrycket av den mellanliggande tråden gliafibrillärt surt protein (GFAP) och inhibitoriska extracellulära matrix (ECM)-proteiner 15,16. Reaktiva astrocyter avgränsa skadan webbplats från frisk vävnad genom att bilda en glial ärr, som huvudsakligen består av astrocyt utsöndrade ECM proteiner från kondroitinsulfat proteoglykan (CSPG) familj, de viktigaste faktorerna som hämmar axonal regeneration efter CNS-skada 15-17.
Astrocyter kommer från radiella gliaceller (RG) celler under sen embryogenes och tidig postnatal liv. Efter astrocyt specifikation har inträffat, astrocyt prekursorer migrera till sina slutliga positioner, där de börjar processen med terminal differentiering. In vivo astrocyter verkar vara mogen 03:57 veckor efter födseln vilket framgår av deras typiska morfologi 18,19. En subpopulation av RG celler omvandlar till subventrikulära zonen astrocyter (typ B-celler). BOTH, RG och typ B-celler fungerar som astrocyt-liknande neurala stamceller (NSC) under utvecklingen och i den vuxna, respektive. Liksom astrocyter, RG och typ B-celler också uttrycker astrocyt-specifika glutamat transportör (GLAST), hjärn lipid-protein (BLBP), och GFAP, vilket indikerar att dessa markörer inte kan enbart användas för att specifikt märka vuxna astrocyter. I motsats till vuxna parenkymala astrocyter som inte delar i den friska hjärnan, RG och typ B-celler uppvisar stamceller potential, såsom förmågan att själv förnya. Dysreglering av astrocyter har varit inblandad i ett flertal patologier, däribland Alzheimers sjukdom 20,21, Huntingtons sjukdom 22, Parkinsons sjukdom 23, Retts syndrom 24 och Alexanders sjukdom 25. Dessutom, astrocyter reagerar alla förolämpningar i CNS, vilket leder till astrocytaktivering och astrocytiska glia ärrbildning 16,26. Den astrocytiska ärr glia som bildar följande hjärnan trAUMA eller ryggmärgsskada tros vara den främsta barriären förhindrar neuronal regeneration 15.
Utvecklingen av tillförlitliga metoder för att isolera och bibehålla renade populationer av celler har varit viktigt för vår förståelse av nervsystemet. Pionjärarbete av McCarthy och de Vellis gör utredarna hittills för att förbereda nästan rena kulturer av astrocyter från neonatala råttvävnad 27. Mycket har lärt sig om astrocyt biologi med denna metod, som presenteras här i en något modifierad form för att isolera mus kortikala astrocyter. Komplettera in vivo-studier, astrocyter samt konditionerat medium som erhålls med den beskrivna in vitro-odling, är värdefulla verktyg för att ytterligare få insikter astrocyt funktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som beskrivs här baseras på astrocyt kulturen beredningen från gnagare neonatala hjärnor, som ursprungligen beskrivits av McCarthy och de Vellis 1980 27. Den modifierade metoden av isolering och odling av kortikala astrocyter från postnatal P1 till P4 mushjärna presenteras här är snabb, ger ren primära astrocyter och är mycket reproducerbar. Denna teknik kan lätt överföras till isolera astrocyter från andra arter, såsom från råtta eller gris och från andra hjärnregioner, såsom rygg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stöds av Fazit stiftelsen Graduate gemenskap SS, det federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF 01 EO 0803) till KB och Europeiska kommissionen FP7 Grant PIRG08-GA-2010 till 276.989, NEUREX, och den tyska Research Foundation SCHA 1442 / 3-1 till CS Författarna har inga motstridiga ekonomiska intressen.
Materials
| Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |
References
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation. Cell Metab. 14, 724-738 (2011).
- Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia – more than just brain glue. Nature. 457, 675-677 (2009).
- Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology. Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).
- Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression. BMC Neurosci. 11, 132 (2010).
- Kaneko, N., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Min, R., Nevian, T. Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses. Nat. Neurosci. , (2012).
- Eroglu, C., Barres, B. A. Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature. 468, 223-231 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Action-potential modulation during axonal conduction. Science. 331, 599-601 (2011).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 .
- Alvarez, J. I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science. 334, 1727-1731 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).
- Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles. Nature. 456, 745-749 (2008).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).
- Schachtrup, C., Moan, N. L. e., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).
- Schachtrup, C., et al. Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage. J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113, 221-233 (2002).
- Dabir, D. V., et al. Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes. J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).
- Wisniewski, H. M., Wegiel, J. Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components. Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).
- Shin, J. Y., et al. Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity. J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).
- Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson’s disease brains. Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).
- Lioy, D. T., et al. A role for glia in the progression of Rett’s syndrome. Nature. 475, 497-500 (2011).
- Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. GFAP and its role in Alexander disease. Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).
- Beck, K., Schachtrup, C. Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta. Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Siao, C. J., Tsirka, S. E. Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II. J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).
- Anthony, T. E., Heintz, N. The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects. J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).
- Skoff, R. P., Knapp, P. E. Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages. Glia. 4, 165-174 (1991).
- Molofsky, A. V., et al. Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective. Genes Dev. 26, 891-907 (2012).
- Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71, 799-811 (2011).
- Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60, 894-907 (2012).
