Summary
التصاميم التجريبية المقترحة هنا التركيز على دراسة آثار التعرض للكحول في موت الخلايا المبرمج وتطبيق الببتيد العصبي أثناء فترة الحمل في دماغ الجنين. يوصف وصفا مفصلا من تربية لجمع العقول الجنين. موصوفة تقنيات لتحديد الخلايا أيضا بالتفصيل.
Abstract
تصاميم تجريبية للتحقيق في الآثار المترتبة على التعرض للكحول قبل الولادة خلال المراحل الجنينية المبكرة في نمو دماغ الجنين تشكل تحديا. هذا يرجع في معظمه إلى صعوبة تسليخ مجهري من أدمغة الأجنة وباجتزاء من أجل تحديد الخلايا أفكارك التي يسببها التعرض قبل الولادة للكحول. التجارب الموصوفة هنا توفر تقنيات تصور من الفئران تربية لتحديد موت الخلايا في الجنين أنسجة المخ. استخدمت في هذه الدراسة C57BL / 6 الفئران كنموذج حيواني لدراسة التعرض للكحول الجنين ودور الببتيد الغذائية ضد الخلايا الناجم عن الكحول. يتكون تربية نافذة حصيرة 2 ساعة لتحديد المرحلة الدقيقة من عمر الجنين. وقد استخدم الجنين نموذج التعرض للكحول التي أنشئت في هذه الدراسة إلى تحديد آثار التعرض للكحول قبل الولادة في أدمغة الأجنة. وهذا ينطوي على حرية الوصول إلى الكحول أو الزوج التي تغذيها النظم الغذائية السائلة كمصدر وحيد من المواد المغذية للفئران الحوامل.
ق = "jove_content"> موصوفة التقنيات التي تنطوي على تشريح الأجنة وتسليخ مجهري من أدمغة الأجنة بعناية، لأن هذا الأخير يمكن أن يكون تحديا. تسليخ مجهري يتطلب stereomicroscope ملقط وغاية في الدقة. يتم توفير إجراءات خطوة بخطوة لتشريح أدمغة الأجنة بصريا. يتم تشريح أدمغة الجنين من قاعدة البصلة الشمية منشم إلى قاعدة الدماغ التالي.
للتحقيق في موت الخلايا المبرمج، هي جزء لا يتجزأ أدمغة الأجنة لأول مرة في الجيلاتين باستخدام قالب التقشير بعيدا لتسهيل باجتزاء مع جهاز vibratome. أدمغة الأجنة جزءا لا يتجزأ من وثابتة في بارافورمالدهيد هي مقطوع بسهولة، ويمكن تركيبه المقاطع التعويم الحر في superfrost الشرائح بالإضافة لتحديد الخلايا أو موت الخلية.
وقد استخدمت مقايسة لتحديد موت الخلية أو الخلايا أفكارك:؛ TUNEL (محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز TDT TDT بوساطة dUTP نيك نهاية وصفها). ومن الجدير بالذكر أن APوتتميز optosis والسمسة الخلية بوساطة من قبل تفتيت الحمض النووي. وهكذا، فإن إيجابية الخلايا TUNEL تصور تدل على موت الخلية أو الخلايا أفكارك.
التصاميم التجريبية هنا تقديم معلومات حول استخدام نظام غذائي السائلة التي أنشئت لدراسة آثار الكحول ودور الببتيد العصبي أثناء فترة الحمل في أدمغة الأجنة. وهذا ينطوي على تربية وتغذية الفئران الحوامل، microdissecting أدمغة الأجنة، وتحديد موت الخلايا المبرمج. معا، قد تكون هذه التقنيات البصرية والنصية مصدر للتحقيق التعرض قبل الولادة لعوامل ضارة في أدمغة الأجنة.
Introduction
الهدف من الطرق التجريبية وصفها هنا هو تقييم آثار اعصاب من الببتيدات الغذائية في نموذج التعرض للكحول الجنين باستخدام العديد من التقنيات التي تنطوي على تربية، تغذية، microdissecting، وكشف عن موت الخلايا. العمل من مختبرنا قد ينطوي على حمية سائلة مختلطة مع الكحول كنموذج للشرب الكحول المعتدل، والتي قد تكون مشابهة لنموذج الشرب الإنسان في فترة من كمية الكحول المستهلكة 1-5. وقد حددت نحن وآخرون ثلاثة المشتقات الببتيد التي هي اعصاب ضد الآثار الضارة للتعرض الكحول الجنينية. دراسات التحقيق التعرض للكحول خلال المراحل الجنينية باستخدام نماذج حيوانية قد يؤدي إلى تحديد الآليات المحتملة من العصبية وتسمح للوضع إجراءات التدخل. قد توفر هذه المعلومات وافرة حول الآثار اعصاب والتوهين من الآثار الضارة من التعرض للكحول خلال الحمل.
الوقاية الممكنة من آثار التعرض للكحول قبل الولادة قد تنطوي على معاملة الفئران الحوامل مع الببتيدات التي ثبت أن تشارك في الحماية العصبية في المختبر والمجراة 6،7 1،2،4،8،9. ومن بين هذه الببتيدات، SALLRSIPA، والمعروفة باسم ADNF-9 أو SAL، مشتق من النشاط التي تعتمد على عامل التغذية العصبية (ADNF) 7،10. الببتيد آخر مع تسلسل NAPVSIPQ الببتيد، برنامج العمل الوطني يطلق عليه، والمستمدة من البروتين اعصاب التي تعتمد على النشاط (ADNP) 6،11، أظهرت تأثير وقائي قوي ضد الاكسدة المرتبطة بالتعرض الكحول 12،13. وبالإضافة إلى ذلك، حددنا مؤخرا الجديدة توليفها الببتيد، colivelin الذي يظهر أن تلعب دورا رئيسيا في اعصاب الجنين الكحول نموذج التعرض 2. وتتألف Colivelin من ADNF-9 وAGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). أهمية استخدام هذه الببتيدات هو أن لديهم القدرة علىعبور حاجز الدم في الدماغ لمنع آثار موت الخلايا المبرمج الناجم عن الكحول والعجز نمو الدماغ.
الطرق التجريبية المستخدمة C57BL / 6 الفئران لاختبار آثار اعصاب ضد الخلايا الناجم عن الكحول. اعتمدنا نافذة 2 ساعة بدلا من تربية ليلة وضحاها من أجل تقدير دقيق ليوم الجنينية 0 (E0)، كما أنه يمكن أن يكشف عنها الكشف عن المكونات الحيوانات المنوية ومسحة مهبلية 1-5. وقد استخدمنا نظام غذائي السائل مع أنابيب التغذية، لأن هذا يعتبر وصول الحرة بدلا من تقديم الكحول من خلال مسار أنبوب تغذية، والتي ربما تتسبب في الضغط على الفئران الحوامل. من ناحية أخرى، تسليخ مجهري يمكن أن يكون تحديا بسبب ليونة الأنسجة دماغ الجنين، التي قد تواجهها عند تشريح أدمغة الأجنة في المراحل الجنينية المبكرة. هنا، وتبين لنا تقنيات تصور للتعامل مع جميع التحديات التي تنطوي تسليخ مجهري. وعلاوة على ذلك، منذ باجتزاء دماغ الجنين ويمكن أيضا أن يكون تحديا، الذي اعتمدناهالاسلوب الذي ينطوي على تضمين أدمغة الأجنة في الجيلاتين باستخدام قشر بعيدا تضمين القوالب. وقد نجحنا في خفض أدمغة الأجنة في أقسام التعويم الحر في 50 ميكرون سماكة. وهذا يسمح لنا لتحقيق أي تعديلات من محتوى البروتين في أقسام دماغ الجنين، بما في ذلك تحديد موت الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تربية الحيوانات ومعالجة اغتذائية الببتيد
- C57BL/mice تولد عن طريق وضع الفئران الإناث (~ 6 أسابيع من العمر، ومتوسط الوزن 20 غ) في أقفاص المنزل الذكور لمدة 2 ساعة.
- تحقق من وجود المكونات الحيوانات المنوية و / أو اللطاخة المهبلية بعد ذلك على الفور.
- إذا إيجابية، تعين هذه النقطة الوقت الذي الجنينية اليوم 0 (E0).
- على E7، وزن مباراة الإناث الحوامل لمجموعات العلاج السيطرة و(3 مجموعات) يتم تعيين كما هو موضح مؤخرا 4: 1) الكحول (الإيثانول) السائل مجموعة الحمية (ALC)، 2) الزوج التي تغذيها مجموعة المراقبة (PF)، 3) مجموعة العلاج الببتيد، والتي ينبغي أن يحصل داخل الصفاق حقن (IP) من ADNF-9 الببتيد جنبا إلى جنب مع الكحول التعرض حمية سائلة (ALC/ADNF-9). تفاصيل إعداد ALC والوجبات الغذائية PF وإجراءات الحقن IP يمكن العثور عليها في أجريناها مؤخرا العمل 4.
- قياس الكحول يوميا الحمية السائلة التي يمكن تقديمها إلى الدخول المجاني كمصدر وحيد من المواد المغذية. حمية سائلة PF يربطها بشكل فردي رس على سد ALC يمكن قياسها يوميا كذلك.
- حجم الحمية السائلة المستهلكة خلال ساعة السابقة 24 يمكن تسجيلها من تخرج 30 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى وينبغي توفير نظام غذائي طازج يوميا من E7 إلى E13.
2. تشريح الأجنة وتسليخ مجهري من العقول الجنين
- التضحية الفئران الحوامل على E13 بواسطة القتل الرحيم عميق الفئران مع إجراء CO 2 تليها خلع عنق الرحم.
- تنظيف الموقع من شق في البطن مع الايثانول 70٪.
- إجراء شق في البطن باستخدام مقص العقيمة وملقط.
- مرة واحدة في البطن مفتوح، تشريح خارج الرحم من خلال عقد مع واحد ملقط واستخدام ملقط أخرى لتمزيق مسراق الرحم بعيدا عن الرحم. تأكد من أن تفعل هذا الإجراء ببطء من أجل تجنب ثقب الأجنة.
- إزالة الأجنة من الرحم ونقلها إلى طبق خلية ثقافة (60 ملم × 15 ملم) التي تحتوي على هانكس "محلول الملح المتوازن (HBSS) في الماء البارد الجليد.
- تشريح أدمغة الأجنة من الأجنة كلها تحت stereomicroscope لتسليخ مجهري.
- باستخدام ملقط غاية في الدقة لتسليخ مجهري، سحب قبالة الجلد من الأجنة في الجزء العلوي من الرأس لفضح الجمجمة.
- مرة واحدة يتعرض الجمجمة وتصور بوضوح تحت stereomicroscope تسليخ مجهري، ثم تقشر الجمجمة بدءا من الجزء الخلفي من الدماغ في الحبل الشوكي ومناطق الدماغ.
- ومن المؤكد أن تقشر قطعة الجمجمة عن طريق قطعة من الخلفية إلى أجزاء الأمامي من الرأس.
- مرة واحدة يتم كشفها بصريا أدمغة الأجنة، والمضي قدما مع استخراج لهم.
- تشريح أدمغة الجنين من قاعدة البصلة الشمية منشم إلى قاعدة الدماغ التالي.
- POSTFIX تشريح أدمغة جميع الجنين في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 2-3 أيام. يمكنك أيضا تجميد الأخرى أدمغة الأجنة من كل السدود إذا كنت اختبارها لطخة غربية أو المقايسات الأنزيمية.
3. تضمين الأمخاخ الجنين في الجيلاتين لباجتزاء
- إعداد 10٪ من الجيلاتين الصف أ.
- ملء القالب تضمين التقشير بعيدا في منتصف الطريق وانتظر حتى يتصلب الجيلاتين.
- مراقبة مكان وعلاجها قبل الولادة الجنين العقول جنبا إلى جنب على أعلى عزز الجيلاتين. هذا هو الحفاظ على الظروف ثابت من مناعي من موت الخلايا بين كل من المجموعتين الضابطة والتجريبية.
- إضافة الجيلاتين السائل على الجزء العلوي من أدمغة الأجنة لجعل قالب كاملة (تأكد من الجيلاتين ليست ساخنة جدا).
- بردت قالب الجيلاتين المعد الذي يحمل أدمغة الأجنة لمدة 15 دقيقة.
- إنحرف للهبوطالبلاستيك العفن التضمين ومن ثم نقل مسبقة الصنع الجيلاتين تحتوي على أدمغة الأجنة في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة يومين.
- مكان وقسم إصلاح أدمغة الأجنة في الجيلاتين باستخدام آلة vibratome باجتزاء (لايكا VT 1000S) في 50 ميكرون سماكة لباجتزاء الاكليلية. يتم اختبار هذا سمك في دراساتنا لأنه يوفر ميزات التشريحية أفضل. وبالإضافة إلى ذلك، سمك 25 ميكرون وأعلى ويمكن أيضا أن اختبار مع هذه التقنية تنطوي جزءا لا يتجزأ من أدمغة الأجنة في 10٪ الجيلاتين. لاحظ أن قطعت المقاطع الاكليلية باستخدام vibratome في القاعدية مستوى سماحة العقد على الدماغ الأمامي
- جمع المقاطع دماغ الجنين في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) حل.
- تحميل المقاطع دماغ الجنين في Superfrost الشرائح زائد في الماء.
- يجف المقاطع التي شنت لمدة 15 دقيقة.
- ضع الشرائح (التي شنت مع المقاطع دماغ الجنين) في برنامج تلفزيوني لاختبار القادم يوم من رد فعل النفق.
4. TUNEL رد فعل لديبحماية المناخ موت الخلايا أو موت الخلايا المبرمج
(TUNEL: TDT بوساطة dUTP نيك نهاية وصفها؛ TDT: محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز). ويهدف هذا الاختبار إلى تحديد موت الخلية.
- علاج الجنين أقسام الدماغ التي شنت في Superfrost زائد الشرائح مع بروتين K (20 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية (300 ميكرولتر من بروتين K مختلطة في 20 مل PBS). ويتم تجميع الشرائح في 5 Plend مفتوحة MAILE).
- شطف المقاطع دماغ الجنين (التي شنت في الشرائح) مع PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق تحت شاكر المداري.
- احتضان المقاطع مع 3٪ H 2 O 2 في الميثانول لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (3 مل 30٪ H 2 O 2 في 27 مل الميثانول بنسبة 100٪) (الشرائح لا ينبغي أن يكون في شاكر).
- شطف المقاطع مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في شاكر المداري.
- احتضان المقاطع في حل permeabilization (0.1٪ TritonX-100 في 0.1٪ سيترات الصوديوم) لمدة 2 دقيقة على الجليد (4 ° C) (100 ميكرولتر TritonX + 0.1 ز سترات الصوديوم + 99.9 مل مقطرالماء د).
- شطف المقاطع في برنامج تلفزيوني مرتين لمدة 5 دقائق في شاكر المداري.
- منطقة جافة حول المقاطع في الشرائح.
- رسم على الجدار Superfrost الشرائح بالإضافة إلى استخدام القلم PAP. ويهدف هذا إلى منع أي تسرب من الحل الذي يستخدم لعلاج المقاطع للكشف عن الخلايا إيجابية النفق.
- احتضان المقاطع مع TUNEL خليط التفاعل (50 ميكرولتر من زجاجة 1 و 450 ميكرولتر من زجاجة 2) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وسوف تستخدم عنصر التحكم عن طريق الحضانة في حل من زجاجة 2.
- شطف مع PBS ثلاث مرات 5 دقائق تحت أوربت شاكر.
- منطقة جافة حول الأنسجة.
- احتضان المقاطع مع تحويل-POD لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- شطف المقاطع ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع تريس حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5، 0.05 M).
- احتضان المقاطع لمدة 7 دقائق في 0.05٪ tetrahydrochloride 3'-3'-diaminobenzidine (DAB) و0.003٪ H 2 O 2 (25 مل تريس حمض الهيدروكلوريك، pH7.5، 0.05 M + 25 ميكرولتر 3٪ H 2 0 2 + 500 DAB ميكرولتر) تحت Oribtal شاكر في 4 درجات مئوية (في الجليد) والظلام (تأكد من تنفيذ هذا الإجراء في نيو 5 Plend فتح الظرف البريدي).
- شطف المقاطع مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات 5 دقائق تحت شاكر المداري.
- الحفاظ على أقسام الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة لا تزيد عن 24 ساعة في برنامج تلفزيوني، ثم معالجتها لتلطيخ نيسل كما هو مفصل في البروتوكول المقطع التالي.
ملاحظة: DAB هو مادة مسرطنة. استخدام القفازات وتنظيف جميع الأطباق المستخدمة مع التبييض الانتهاء مرة واحدة مع جميع التجارب.
5. تلطيخ نيسل لإعداد الجنين الدماغ أقسام لمراقبة مجهرية
- وينبغي أن يتم إجراء تلطيخ نيسل في غطاء السلامة البيولوجية.
- شطف المقاطع الشريحة مع الماء منزوع الأيونات لمدة 2 دقيقة.
- احتضان المقاطع في الإيثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة.
- احتضان المقاطع في الإيثانول 95٪ لمدة 6 دقائق.
- احتضان المقاطع في الإيثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة.
- شطف المقاطع في وات منزوع الأيوناتإيه لمدة 2 دقيقة.
- احتضان المقاطع في البنفسج الكريزيل وصمة عار لمدة 3 دقائق.
- شطف المقاطع في الماء منزوع الأيونات لمدة 2 دقيقة.
- احتضان المقاطع في الإيثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة.
- احتضان المقاطع في الايثانول 95٪ + 3 مل حمض الخليك الجليدي لمدة 3 دقائق.
- احتضان المقاطع في الإيثانول 95٪ لمدة 2 دقيقة.
- احتضان المقاطع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة ثلاث مرات.
- احتضان المقاطع في الزيلين لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات.
- الشرائح عقد أقسام دماغ الجنين يمكن تركيبه باستخدام Permount وغطاء الشرائح الزجاجية زلة.
- ترك محمولة على الشرائح بين عشية وضحاها قبل الملاحظة المجهرية والتحاليل.
- الملاحظة المجهرية وphotomicrographs لا يمكن أن يؤديها تحت المجهر لايكا تستقيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الطرق التجريبية وصفها هنا تبين أن نافذة تربية 2 ساعة أمر ضروري لتقدير مرحلة الحمل دقيقة. لقد أظهر تشريح الأجنة في سن ال E13. أثبتنا أيضا تسليخ مجهري من أدمغة الأجنة في E13. الإجراء ينطوي على عدة مراحل (AC)، كما هو موضح في الشكل رقم 1. يتم تشريح أدمغة الجنين من قاعدة البصلة الشمية منشم إلى قاعدة الدماغ التالي (الشكل 1). ثم يتم إصلاح أدمغة الأجنة في بارافورمالدهيد 4٪ للكشف immunochemical. بعد التثبيت، هي جزء لا يتجزأ أدمغة الأجنة في 10٪ الجيلاتين وإعدادها للvibratome باجتزاء كما هو موضح في الشكل 2. لاحظ أن التضمين خطوة بخطوة من أدمغة الأجنة أجريت في انخفاض التكبير. أدمغة الأجنة جزءا لا يتجزأ من يمكن تصور في أعلى التكبير في الشكل 1. وعلاوة على ذلك، يمكن الاكليلية أقسام دماغ الجنين على مستوى سماحة العقدية على الدماغ الأمامييمكن الحصول عليها باستخدام vibratome والتي شنت في الشرائح للكشف المناعى. وهذا ينطوي على عدد من الخلايا إيجابية TUNEL (الشكل 3). نعرض هنا إلى أن التعرض للكحول قبل الولادة يتسبب في زيادة إيجابية الخلايا TUNEL في فضيلة العقدية (الشكل 3B) مقارنة PF المجموعة الضابطة (الشكل 3A). ADNF-9 الإدارة خفضت بشكل ملحوظ زيادة الكحول التي يسببها في خلايا إيجابية TUNEL (الشكل 3C و 3D) مقارنة ALC المجموعة.
الشكل 1. تسليخ مجهري من أدمغة الأجنة في E13. مراحل AC المعرض خطوة بخطوة الإجراء S من الأجنة لتشريح أدمغة الأجنة. أ) التحكم في تشريح (PF) والكحول (ALC) التي تعرضت قبل الولادة الأجنة. ب) ج) تشريح أدمغة الأجنة من PF والجماعات ALC.
الشكل 2. طريقة لتضمين أدمغة الأجنة لباجتزاء. مراحل (AE) عرض إجراءات خطوة بخطوة من إعداد التضمين من أدمغة الأجنة إلى الإعداد للكتلة الجيلاتين في كائن لقطع vibratome. أ) التقشير بعيدا تضمين قالب ملأت في منتصف الطريق مع الجيلاتين؛ ب) يتم وضع الجنين العقول من سيطرة PF والجماعات ALC جنبا إلى جنب في قالب ومغطاة الجيلاتين؛ ج) التقشير بعيدا تضمين قالب قطع في أربعة جوانب؛ د) أدمغة الأجنة جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين وجاهزة أن تكون ثابتة في بارافورمالدهيد؛ ه) جنرال الكتريكقالب اللاتينية تحتوي على أدمغة الأجنة يتم وضعها في الكائن لvibratome باجتزاء.
الشكل (3). آثار الببتيد العصبي، ADNF-9، ضد الكحول التي يسببها موت الخلايا المبرمج باستخدام مقايسة النفق في فضيلة العقدية في E13 المرحلة. التعرض للكحول قبل الولادة التي يسببها زيادة في موت الخلايا كما يتبين من السهام في ALC المجموعة (ب) مقارنة PF المجموعة (أ). وأظهرت ADNF-9 الإدارة جنبا إلى جنب مع التعرض للكحول قبل الولادة انخفاضا في خلايا إيجابية TUNEL (ج). التحليلات الإحصائية أظهرت أن ADNF-9 الإدارة منعت الزيادات التي يسببها الكحول في الخلايا إيجابية TUNEL (د). يتم عرض القيم كوسيلة ± SEM. * P <0.05؛ ** P <0.01 (آخر مخصص اختبار نيومان Keul لل). N = 4 لكل مجموعة. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. نقلا عن نشرة (4)، بإذن من شسفير] (رخصة # 2904310752995).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المنهجية والتكنولوجيا المقدمة في هذه الدراسة تثبت آثار التعرض قبل الولادة للكحول في أدمغة الأجنة ودور الببتيد التغذية في الوقاية من هذه الآثار. قد توفر هذه المعلومات على كيفية دراسة أدوية أخرى من سوء المعاملة أو المواد الكيميائية السامة الأخرى في أدمغة الجنين خلال مراحل الحمل المختلفة.
في ما يخص نموذج التربية، في بعض الحالات قد لا يكون ملحوظا في الكشف عن المكونات الحيوانات المنوية. في هذه المرحلة، من المهم لاختبار مسحة مهبلية في شريحة تحت الملاحظة المجهرية، التي يمكن أن توفر ممكن الحيوانات المنوية الكشف إيجابية.
وجاء في هذه الدراسة أن التغذية ينطوي الوصول الحر للحمية سائلة تحتوي على التحكم PF والكحول. لا يقل عن 30٪ من الرطوبة ودرجة حرارة لا تزيد عن 22-24 درجة مئوية مطلوبة لرصد نوعية النظام الغذائي خلال ال 24 ساعة حرية الوصول إلى النظام الغذائي 1،2. مطلوب أيضا أنتكون على استعداد حمية الطازجة يوميا. يجب تنظيف أنابيب التغذية بعد كل استخدام.
هناك صعوبات في تسليخ مجهري من أدمغة الأجنة. هذه تعتمد على المرحلة الجنينية التي تم اختبارها. على سبيل المثال، يمكن أن أدمغة الأجنة تشريح في سن E13 يكون من الصعب التعامل مع مقارنة أدمغة الأجنة تشريح في E18. ويرجع في حقيقة أنه في E18، يتم تطويرها بشكل جيد أدمغة الأجنة والجمجمة يصبح من السهل لسحب قبالة مقارنة E13، عندما الجمجمة لا تزال لينة وصعبة لسحب قبالة هذا. عند هذه النقطة، عندما تشريح أدمغة الأجنة في E13، فمن المهم لسحب قبالة الجمجمة قطعة تلو قطعة كما هو موضح في الفيديو المرفق مع هذا المخطوط.
في ما يخص تضمين أدمغة الأجنة في الجيلاتين، وجدنا أن هذا هو أفضل أسلوب للحصول على المقاطع التي هي على استعداد لاستخدامها في تحليل المناعى. من أجل الحصول على أفضل القطع من دماغ الجنين، فمن المهم أن التثبيت في بارافورمالدهيد 4٪ منكتلة الجيلاتين تحتوي على أدمغة الأجنة كاملة. وهكذا، وهذا قد يستغرق يومين على الأقل، وكتلة الجيلاتين قد تكون على استعداد لقطع في اليوم الثالث. سمك من الأقسام هو أيضا عامل؛ يتم اختبار سمك 50 ميكرون عادة للكشف immunochemical مثل TUNEL مقايسة 1،2،4. ومع ذلك، سمك 25 ميكرون وأعلى ويمكن أيضا أن تختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا الإفصاحات في هذا الشأن.
Acknowledgments
وأيد هذا المشروع البحثي من قبل جائزة عدد R21AA017735 (يس) من المعاهد الوطنية لتعاطي الكحول والإدمان على الكحول. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكاتب ولا تعبر بالضرورة عن وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني لتعاطي الكحول والإدمان على الكحول أو المعاهد الوطنية للصحة. ويود الكاتب أيضا أن أشكر تشاريس مونتغمري لتحرير هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations. Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).
- Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).
- Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 202, 465-473 (2012).
- Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation. Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).
- Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide. J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).
- Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).
- Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).
- Sari, Y., Gozes, I. Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein. Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).
- Brenneman, D. E., Gozes, I. A femtomolar-acting neuroprotective peptide. J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).
- Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein. J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).
- Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease. Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).
- Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress. J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).
