Summary
De eksperimentelle designs foreslås her fokusere på at studere virkningerne af alkohol eksponering i apoptose, og anvendelsen af neurotrofe peptid under graviditeten på fostrets hjerne. En detaljeret beskrivelse fra avl til indsamling af føtale hjerner er beskrevet. Teknikker til bestemmelse af apoptose er også beskrevet i detaljer.
Abstract
Forsøgsplaner til undersøgelse af virkningerne af prænatal alkohol eksponering under tidlige embryonale stadier fostrets hjerne vækst er udfordrende. Dette skyldes hovedsagelig, at det er vanskeligt at mikrodissektion af føtale hjerner og deres sektionering til bestemmelse af apoptotiske celler forårsaget af prænatal udsættelse for alkohol. Forsøgene beskrevet her giver visualiserede teknikker fra mus avl til identifikation af celledød i føtalt hjernevæv. Denne undersøgelse anvendte C57BL / 6 mus som dyremodel for at studere føtal alkohol eksponering og den rolle trofisk peptid mod alkohol-induceret apoptose. Avl består af en 2-timers måtter vinduet for at fastslå den nøjagtige fase af embryonale alder. En etableret føtal alkohol eksponering model er blevet anvendt i denne undersøgelse for at bestemme virkningerne af prænatal alkohol eksponering i føtale hjerner. Dette indebærer fri adgang til alkohol eller pair-fed flydende kost som den eneste kilde til næringsstoffer til drægtige mus.
For at undersøge apoptose er føtale hjerner først indlejret i gelatine med en peel-away skimmel til at lette deres sektionering med en vibratome apparat. Føtal hjerner indlejret og fikseret i paraformaldehyd er let sektioneret, og de frie flydende sektioner kan monteres i SuperFrost plus slides til bestemmelse af apoptose eller celledød.
TUNEL (TdT-medieret dUTP nick-endemærkning, TdT: terminal deoxynucleotidyltransferase) assay er blevet anvendt til at identificere celledød eller apoptotiske celler. Det er bemærkelsesværdigt, at APoptosis og cellemedieret cytotoksicitet er karakteriseret ved DNA-fragmentering. Således visualiserede TUNEL-positive celler er indikativ for celledød eller apoptotiske celler.
De eksperimentelle designs her give oplysninger om brugen af et etableret flydende kost for at studere virkningerne af alkohol og den rolle, neurotrofiske peptider under graviditeten på føtale hjerner. Dette indebærer avl og fodring drægtige mus, microdissecting føtale hjerne og bestemme apoptose. Tilsammen kan disse visuelle og tekstuelle teknikker være en kilde til at undersøge prænatal eksponering af skadelige stoffer i føtale hjerner.
Introduction
Målet for de eksperimentelle metoder beskrevet her er at vurdere de neuroprotektive virkninger af trofiske peptider i en føtal alkohol eksponering model ved hjælp af forskellige teknikker, der involverer avl, fodring, microdissecting, og afsløre celledød. Arbejde fra vores laboratorium har involveret en flydende kost blandet med alkohol som en model for moderat alkoholindtagelse, der kunne svare til en menneskelig drikke paradigme på sigt af mængden af alkohol indtages 1-5. Vi og andre har identificeret tre peptidderivater, der er neurobeskyttende mod de skadelige virkninger af føtal alkohol eksponering. Undersøgelser af alkohol eksponering under fosterstadiet anvendelse af dyremodeller kan føre til identifikation af potentielle mekanismer neuroprotektion og give mulighed for at udvikle interventionsprocedurer. Dette kan give rigelig information om neurobeskyttende effekter og dæmpning af de skadelige virkninger af alkohol eksponering under graviditet.
Mulig forebyggelse af virkningerne af prænatal alkohol eksponering kan indebære behandling af gravide mus med peptider, der har vist sig at være involveret i neuroprotektion in vitro 6,7 og in vivo 1,2,4,8,9. Blandt disse peptider er SALLRSIPA, kendt som ADNF-9 eller SAL, der stammer fra aktivitet-afhængig neurotrof faktor (ADNF) 7,10. En anden peptid med sekvensen NAPVSIPQ peptid, betegnet NAP, der stammer fra aktivitet-afhængig neuroprotektive protein (ADNP) 6,11, vist en potent beskyttende effekt mod oxidativ stress i forbindelse med alkohol eksponering 12,13. Derudover har vi for nylig identificeret en ny syntetiseret peptid colivelin, der synes at spille en central neuroprotektiv rolle i den føtale alkohol eksponering model 2. Colivelin er sammensat af ADNF-9 og AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). Betydningen af anvendelsen af disse peptider er, at de har evnen tilkrydse blod-hjerne-barriere for at forhindre virkningerne af alkohol-induceret apoptose og hjerne vækst underskud.
De eksperimentelle metoder C57BL / 6 mus til test af neurobeskyttende virkninger mod alkohol-induceret apoptose. Vi har vedtaget et 2-timers-vinduet i stedet for overnight avl for nøjagtigt estimere embryonale dag 0 (E0), da det kan blive afsløret ved påvisning af en sædcelle plug and vaginal smear 1-5. Vi har brugt en flydende kost med føderør, da dette anses for fri adgang i stedet for levering af alkohol gennem sonde ruten, som kan fremkalde stress til gravide mus. På den anden side, kan mikrodissektion være udfordrende på grund af blødheden af føtalt hjernevæv, der kan opstå, når dissekere føtale hjerner på tidlige embryonale stadier. Her viser vi visualiserede teknikker til at håndtere alle de udfordringer, der involverer mikrodissektion. Da fostrets hjerne sektionering også kan være en udfordring, vi har vedtageten teknik, der involverer indlejring af føtale hjerner i gelatine hjælp peel-away indlejring forme. Vi har haft succes med at skære de føtale hjerner i frie flydende sektioner ved 50 um tykkelse. Dette giver os mulighed for at undersøge eventuelle ændringer af indhold protein i føtale hjerne sektioner, herunder identifikation af celledød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Dyr Forædling og Trofisk Peptid Treatment
- Race C57BL/mice ved at placere hunmus (~ 6 uger gamle, gennemsnitlig vægt 20 g) i mandlige bure i 2 timer.
- Check for en sædcelle plug og / eller vaginal smear umiddelbart bagefter.
- Hvis resultatet er positivt, udpege dette tidspunkt, da embryonale dag 0 (E0).
- Den E7, vægt match gravide kvinder til kontrol-og behandlingsgruppen (3 grupper) tildeles som beskrevet for nylig 4: 1) Alkohol (ethanol) flydende kost gruppe (ALC), 2) pair-fed kontrolgruppe (PF) 3) Peptid behandlingsgruppe, som bør modtage intraperitoneal (ip) injektion af ADNF-9 peptid sammen alkohol eksponering flydende kost (ALC/ADNF-9). Detaljerne i udarbejdelsen af ALC og PF kostvaner og proceduren for ip injektioner kan findes i vores seneste arbejde 4..
- Mål daglige alkohol flydende kost, der kan leveres som fri adgang som den eneste kilde til næringsstoffer. PF flydende kost spændte individuelt to en ALC dæmning kan måles dagligt samt.
- Mængden af flydende kost indtages under den foregående 24 hr kan optages fra 30 ml gradueret skruelåg rør og frisklavet kost bør gives dagligt fra E7 til E13.
2.. Dissektion af fostre og mikrodissektion af føtale Brains
- Sacrifice gravide mus på E13 ved dybt euthanizing musene med en CO 2-proceduren efterfulgt af en cervikal dislokation.
- Rengør abdominal site af indsnit med 70% ethanol.
- Lav en abdominal incision hjælp steril saks og pincet.
- Når maven er åben, dissekere ud livmoderen ved at holde det med én pincet og bruge de andre pincet til at rive mesometrium væk fra livmoderen. Sørg for at gøre denne fremgangsmåde langsomt for at undgå at punktere embryoner.
- Flytte embryoner fra livmoderen og overføre dem til en cellekultur skål (60 mm x 15 mm) indeholdende Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) i iskoldt vand.
- Dissekere føtale hjerner fra hele embryoner under stereomikroskop for mikrodissektion.
- Hjælp af ultra-fine tænger til mikrodissektion trække skindet af embryonerne på den øverste del af hovedet for at blotlægge kraniet.
- Når kraniet er blotlagt og tydeligt visualiseret under mikrodissektionsjob stereomikroskop derefter skrælle kraniet startende fra den bageste del af hjernen på rygmarven og hjernestammen områder.
- Vær sikker på at skrælle kraniet stykke for stykke fra posterior til anterior dele af hovedet.
- Når føtale hjerner visuelt er udsat, så fortsæt med at udvinde dem.
- Dissekerer føtale hjerner fra bunden af primordium lugtekolben til bunden af metencephalon.
- Postfix alle dissekeret føtale hjerner i 4% paraformaldehyd i 2-3 dage. Du kan også fryse andre føtale hjerner fra hver dam, hvis du tester dem for Western blot eller enzymatiske assays.
3.. Embedding Føtale Brains i Gelatine for Sektionsinddeling
- Forbered 10% af gelatine klasse A.
- Fyld en peel-away indlejring mug halvt ned og vente, indtil gelatine størkner.
- Sted kontrol og prænatalt behandlet føtalt hjerner side om side på toppen af den størknede gelatine. Dette er at holde ensartede betingelser for immunodetektion af celledød mellem både kontrol og forsøgsgrupper.
- Tilføj flydende gelatine på toppen af de føtale hjerner til at gøre en komplet støbeform (sørg for gelatine ikke er for varmt).
- Afkøl den forberedte gelatine skimmel, der holder føtale hjerner i 15 min.
- Peel offindlejring mug plast og derefter overføre pre-made gelatine indeholdende føtale hjerner i 4% paraformaldehyd i to dage.
- Sted og sektion fast føtale hjerner i gelatine hjælp vibratome sektionering maskine (Leica VT 1000S) ved 50 um tykkelse for coronal sektionering. Denne tykkelse er testet i vores studier, fordi det giver bedre anatomiske træk. Desuden tykkelser på 25 um og højere kan også testes med denne teknik, der involverer indlejret af føtale hjerner i 10% gelatine. Bemærk at kronafsnit blev skåret ved hjælp vibratome på basalganglierne eminence plan om forhjernen
- Saml fostrets hjerne sektioner i phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning.
- Monter fostrets hjerne sektioner i SuperFrost Plus dias i vand.
- Tør de monterede sektioner for 15 min.
- Anbring dine dias (monteret med fostrets hjerne sektioner) i PBS i næste dag afprøvning af TUNEL reaktion.
4.. TUNEL Reaktion for Detelse for celledød eller apoptose
(TUNEL: TdT-medieret dUTP Nick End mærkning TdT: terminal deoxynucleotidyltransferase). Dette assay har til formål at bestemme celledød.
- Behandle føtale hjerne sektioner monteret i Superfrost Plus slides med proteinase K (20 ug / ml) i 5 minutter ved 37 ° C (300 pi proteinase K blandet i 20 ml PBS). Slides samles i 5-Plend open Maile).
- Skyl føtale hjerne sektioner (monteret i dias) med PBS tre gange i 5 min under orbitalryster.
- Inkuber sektioner med 3% H 2 O 2 i methanol i 10 minutter ved stuetemperatur (3 ml 30% H 2 O 2 i 27 ml 100% methanol) (slides bør ikke være i en shaker).
- Skyl sektioner med PBS tre gange i 5 min i orbitalryster.
- Inkuber sektioner i permeabilization opløsning (0,1% Triton X-100 i 0,1% natriumcitrat) i 2 minutter på is (4 ° C) (100 ul Triton + 0,1 g natriumcitrat + 99,9 ml distilled vand).
- Skyl sektioner i PBS to gange i 5 min i orbitalryster.
- Tør området omkring sektioner i dias.
- Tegn barriere på SuperFrost Plus dias ved hjælp af PAP Pen. Dette har til formål at forhindre enhver lækage af opløsning, der anvendes til behandling afsnittene til påvisning af TUNEL-positive celler.
- Inkuber sektioner med TUNEL reaktionsblanding (50 pi fra flasken 1 og 450 pi fra flasken 2) i 1 time ved 37 ° C, vil kontrollen blive anvendt ved inkubation i opløsning fra flasken 2.
- Skyl med PBS tre gange 5 minutter under Orbit shaker.
- Tør området omkring væv.
- Inkuber sektioner med omformer-POD i 30 min ved 37 ° C.
- Skyl sektionerne tre gange i 5 min med Tris HCI (pH 7,5, 0,05 M).
- Inkubér sektioner til 7 min i 0,05% 3'-3'-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) og 0,003% H 2 O 2 (25 ml Tris HCI, pH 7,5, 0,05 M + 25 ul 3% H 2 0 2 + 500 pi DAB) Under Oribtal shaker ved 4 ° C (i is), og i mørke (sørg for at gøre denne procedure i ny 5-Plend open mailer).
- Skyl afsnittene med PBS tre gange 5 min under Orbital shaker.
- Hold dias sektioner i PBS for ikke mere end 24 timer i PBS, og derefter behandle dem for Nissl farvning som beskrevet i næste afsnit protokollen.
Bemærk: DAB er kræftfremkaldende. Brug handsker og rengør alle retter bruges med blegemiddel engang færdig med alle forsøgene.
5.. Nissl farvning for Udarbejdelse af fostrets hjerne Sektioner til mikroskopisk Observation
- Nissl farvning procedure bør ske i en biologisk sikkerhed hætte.
- Skyl glidesektioner med demineraliseret vand i 2 min.
- Inkuber sektioner i 70% ethanol i 2 min.
- Inkuber sektioner i 95% ethanol i 6 min.
- Inkuber sektioner i 70% ethanol i 2 min.
- Skyl afsnittene i demineraliseret watis i 2 min.
- Inkuber sektioner i cresylviolet Stain i 3 min.
- Skyl afsnittene i deioniseret vand i 2 min.
- Inkuber sektioner i 70% ethanol i 2 min.
- Inkuber sektioner i 95% ethanol + 3 ml iseddike i 3 min.
- Inkuber sektioner i 95% ethanol i 2 min.
- Inkuber sektioner i 100% ethanol i 2 minutter tre gange.
- Inkuber sektioner i xylen i 10 minutter tre gange.
- Slides holder fostrets hjerne sektioner kan monteres med Permount og dækglas objektglas.
- Lad monterede dias natten over forud for mikroskopisk observation og analyser.
- Mikroskopisk observation og mikrofotografier kan udføres under Leica opretstående mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eksperimentelle fremgangsmåder beskrevet her, viser, at en 2-timers avl vinduet er vigtigt at estimere nøjagtig gestationel fase. Vi har vist dissektion af embryonerne i en alder af E13. Vi har også demonstreret mikrodissektion af føtale hjerner på E13. Denne procedure indebærer flere etaper (AC), som beskrevet i figur 1.. Føtal hjerner dissekeres fra bunden af primordium lugtekolben til bunden af metencephalon (figur 1). Føtal hjerner bliver derefter fikseret i 4% paraformaldehyd for immunkemiske detektion. Efter fiksering er føtale hjerner indlejret i 10% gelatine og forberedt til vibratome sektionering som beskrevet i figur 2.. Bemærk, at trin-for-trin indlejring af føtale hjerner blev udført ved lavere forstørrelse. Føtal indlejrede hjerner kan visualiseres ved højere forstørrelse i fig. 1. Desuden koronale føtale hjerne sektioner på niveau med ganglie eminence på forhjernen kanopnås ved hjælp af vibratome og monteret i dias til immunhistokemisk detektion. Dette indebærer antallet af TUNEL-positive celler (figur 3). Vi viser her, at prænatal alkohol eksponering inducerede stigninger i TUNEL-positive celler i ganglie eminence (figur 3b) sammenlignet med PF kontrolgruppen (figur 3a). ADNF-9 administration signifikant reduceret alkohol-inducerede stigning i TUNEL-positive celler (figur 3c og 3d) sammenlignet med ALC gruppe.
Figur 1. Mikrodissektion af føtale hjerner på E13. Stages ac show trin-for-trin procedure s fra embryoner til dissekerede føtale hjerner. A) Dissekeret kontrol (PF) og alkohol (ALC) udsættes prænatalt embryoner. B) c), dissekerede føtale hjerner PF og ALC grupper.
Figur 2. Metode til at indbygge føtale hjerner for sektionering. Stages (AE) viser trin-for-trin procedurer fra udarbejdelse af indlejring af føtale hjerner til indstillingen af gelatine blok i objekt for vibratome skæring. A) Peel-away indlejring fyldt skimmel halvvejs med gelatine b) Føtal hjerner fra PF kontrol og ALC grupper anbragt side om side i formen og dækkes med gelatine c) Peel-væk indlejring støbeform skåret på fire sider d) føtale hjerner indlejret i gelatine og klar skal fastsættes i paraformaldehyd e) gelatin form indeholdende føtale hjerner er placeret i det objekt vibratome sektionering.
Figur 3. Effekter af neurotrofisk peptid, ADNF-9 mod alkohol-induceret apoptose ved hjælp TUNEL assay i ganglie eminence på E13 stadium. Prænatal alkohol eksponering inducerede stigninger i celledød som angivet ved pile i ALC-gruppen (b) sammenlignet med PF gruppe (a). ADNF-9 administration sammen prænatal alkohol eksponering viste fald i TUNEL-positive celler (c). Statistiske analyser viste, at ADNF-9 administration forhindrede alkohol-inducerede stigninger i TUNEL-positive celler (d). Værdier er vist som middelværdier ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 (Newman-Keul s post-hoc test). N = 4 for hver gruppe. Skala bar = 100 um. Genoptrykt fra offentliggørelse (4), med tilladelse fra ElSevier (licens # 2904310752995).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metode og teknologi præsenteres i denne undersøgelse viser effekten af prænatal eksponering for alkohol i føtale hjerner og den rolle, trofiske peptider i forebyggelsen af disse virkninger. Disse kan give oplysninger om, hvordan at studere andre misbrugsstoffer eller andre giftige kemikalier i føtale hjerner på forskellige graviditet faser.
Med hensyn til avls paradigme, påvisning af sædcellerne proppen i nogle tilfælde måske ikke kunne ses. På dette punkt er det vigtigt at teste vaginal smear i en slide ved mikroskopisk observation, som kan give mulig sperm positiv detektering.
Det anføres i denne undersøgelse, at fodring indebærer fri adgang flydende diæt indeholdende PF kontrol og alkohol. Mindst 30% af fugtighed og en temperatur på højst 22-24 ° C, er forpligtet til at overvåge kvaliteten af kosten under 24-timers fri adgang til kost 1,2. Det er også nødvendigt, at denkost være forberedt frisk hver dag. De sonderne skal rengøres efter hver brug.
Der er problemer med mikrodissektion af føtale hjerner. Disse afhænger af embryonale testede scenen. For eksempel kan føtale hjerner dissekeret i en alder af E13 være vanskeligt at håndtere i forhold til føtale hjerner dissekeret på E18. Dette skyldes det faktum, at på E18, er føtale hjerner veludviklede og kraniet bliver let at trække ud i forhold til E13, når kraniet er stadig blødt og vanskeligt at trække ud. På dette tidspunkt, når dissekere føtale hjerner på E13, er det vigtigt at trække fra kraniet brik-by-stykke som vist i videoen følger med dette manuskript.
Med hensyn til indlejring føtale hjerner i gelatine, fandt vi, at dette er den bedste teknik til at opnå sektioner, der er klar til at blive anvendt til immunohistokemisk analyse. For at få en bedre skæring af fostrets hjerne, er det vigtigt, at fiksering i 4% paraformaldehyd afgelatine blok indeholder føtale hjerner er færdig. Således kan dette tage mindst to dage, og gelatine blok kan være klar til skæring med den tredje dag. Tykkelsen af sektionerne er også en faktor, 50 um tykkelse er normalt testet for immunokemisk detektion såsom TUNEL assay 1,2,4. Imidlertid tykkelser af 25 um og højere kan også testes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen oplysninger, der skal foretages.
Acknowledgments
Dette forskningsprojekt er støttet af Award Number R21AA017735 (YS) fra National Institutes for alkoholmisbrug og alkoholisme. Indholdet er alene ansvarlig for forfatteren og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter nationale institut for alkoholmisbrug og alkoholisme eller National Institutes of Health. Forfatteren vil også gerne takke Charisse Montgomery til redigering dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations. Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).
- Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).
- Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 202, 465-473 (2012).
- Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation. Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).
- Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide. J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).
- Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).
- Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).
- Sari, Y., Gozes, I. Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein. Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).
- Brenneman, D. E., Gozes, I. A femtomolar-acting neuroprotective peptide. J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).
- Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein. J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).
- Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease. Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).
- Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress. J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).
