Summary
प्रयोगात्मक डिजाइन भ्रूण के मस्तिष्क में गर्भावस्था के दौरान apoptosis और neurotrophic पेप्टाइड के आवेदन में शराब जोखिम के प्रभावों के अध्ययन पर यहाँ ध्यान केंद्रित करने का प्रस्ताव रखा. प्रजनन से भ्रूण के दिमाग का संग्रह करने के लिए एक विस्तृत वर्णन वर्णित है. Apoptosis के निर्धारण के लिए तकनीक का भी विस्तार से वर्णन किया गया हैं.
Introduction
यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक विधियों का लक्ष्य, खिला microdissecting, और कोशिका मृत्यु का पता लगाने, प्रजनन से जुड़े कई तकनीकों का उपयोग करते हुए एक भ्रूण शराब जोखिम मॉडल में पौष्टिकता पेप्टाइड्स के neuroprotective प्रभाव का आकलन करने के लिए है. हमारी प्रयोगशाला से काम शराब की राशि की अवधि में एक मानव पीने के प्रतिमान के समान हो सकता है, जो उदारवादी शराब पीने की एक मॉडल के रूप में शराब के साथ मिश्रित एक तरल आहार शामिल किया गया है 1-5 सेवन किया. हम और दूसरों भ्रूण शराब जोखिम के हानिकारक प्रभावों के खिलाफ न्यूरोप्रोटेक्टिव हैं कि तीन पेप्टाइड डेरिवेटिव की पहचान की है. पशु मॉडल का उपयोग भ्रूण चरणों के दौरान शराब जोखिम की जांच के अध्ययन neuroprotection के संभावित तंत्र की पहचान करने के लिए नेतृत्व और हस्तक्षेप की प्रक्रिया के विकास के लिए अनुमति दे सकता है. यह गर्भावस्था के दौरान शराब जोखिम के हानिकारक प्रभावों के neuroprotective प्रभाव और क्षीणन के बारे में पर्याप्त जानकारी उपलब्ध करा सकता है.
जन्म के पूर्व शराब जोखिम के प्रभावों का संभव रोकथाम विट्रो 6,7 में और vivo 1,2,4,8,9 में neuroprotection में शामिल होना दिखाया गया है कि पेप्टाइड्स के साथ गर्भवती चूहों के उपचार शामिल हो सकता है. इन पेप्टाइड्स के अलावा, ADNF -9 या साल के रूप में जाना SALLRSIPA, गतिविधि पर निर्भर neurotrophic कारक (ADNF) 7,10 से ली गई है. अनुक्रम NAPVSIPQ पेप्टाइड, करार राष्ट्रीय वनीकरण कार्यक्रम, के साथ एक और पेप्टाइड गतिविधि पर निर्भर न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रोटीन (ADNP) 6,11 से निकाली गई, शराब जोखिम 12,13 के साथ जुड़े oxidative तनाव के खिलाफ एक शक्तिशाली सुरक्षात्मक प्रभाव का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, हम हाल ही में भ्रूण शराब जोखिम मॉडल 2 में एक महत्वपूर्ण neuroprotective भूमिका निभाते हैं प्रकट होता है कि एक नए संश्लेषित पेप्टाइड, colivelin की पहचान की है. Colivelin ADNF -9 और आगा-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP) से बना है. इन पेप्टाइड्स के प्रयोग के महत्व को वे की क्षमता है कि हैशराब प्रेरित apoptosis और मस्तिष्क विकास घाटे के प्रभाव को रोकने के लिए मस्तिष्क रक्त बाधा पार.
प्रयोगात्मक विधियों शराब प्रेरित apoptosis के खिलाफ neuroprotective प्रभाव का परीक्षण करने के लिए C57BL 6 / चूहों का इस्तेमाल किया. हम इसे एक शुक्राणु प्लग और योनि स्मियर 1-5 का पता लगाने के द्वारा प्रगट किया जा सकता है के रूप में सही, भ्रूण दिन 0 (E0) का अनुमान लगाने के क्रम में बजाय रात में प्रजनन की एक 2 घंटा खिड़की अपनाया है. हम इस गर्भवती चूहों में तनाव उत्पन्न हो सकता है जो नलिका - पोषण मार्ग, के माध्यम से के बजाय शराब की डिलीवरी की मुफ्त का उपयोग माना जाता है, के रूप में खिला ट्यूब के साथ एक तरल आहार का इस्तेमाल किया है. दूसरी ओर, सूक्षम जल्दी भ्रूण चरणों में भ्रूण के दिमाग विदारक जब सामना हो सकता है जो भ्रूण के मस्तिष्क के ऊतकों की कोमलता की वजह से चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यहाँ, हम सूक्षम से जुड़े सभी चुनौतियों से निपटने के लिए कल्पना तकनीक दिखा. इसके अलावा, भ्रूण के मस्तिष्क सेक्शनिंग भी चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि हम अपनाया हैजिलेटिन एम्बेड छील दूर का उपयोग कर सांचों में भ्रूण दिमाग एम्बेड शामिल है कि एक तकनीक है. हम 50 माइक्रोन मोटाई से कम मुक्त अस्थायी वर्गों में भ्रूण के दिमाग को काटने में सफल रहे हैं. यह हमें कोशिका मृत्यु की पहचान सहित, भ्रूण के मस्तिष्क वर्गों में सामग्री प्रोटीन के किसी भी परिवर्तन की जांच करने के लिए अनुमति देता है.
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Protocol
1. पशु प्रजनन और पोषण से संबंधित पेप्टाइड ट्रीटमेंट
- 2 घंटे के लिए पुरुष घर पिंजरों में मादा चूहों (~ 6 सप्ताह पुरानी है, औसत वजन 20 ग्राम) रखकर नस्ल C57BL/mice.
- तुरंत बाद एक शुक्राणु प्लग और / या योनि स्मियर के लिए जाँच करें.
- सकारात्मक हैं, भ्रूण दिन 0 (E0) के रूप में इस समय बिंदु नामित.
- हाल ही में वर्णित के रूप में E7 पर, नियंत्रण और उपचार समूहों के लिए गर्भवती महिलाओं के वजन मैच (3 समूहों) आवंटित कर रहे हैं 4: 1) शराब (इथेनॉल) तरल आहार समूह (कृत्रिम अंग केन्द्र), 2) जोड़ी से सिंचित नियंत्रण समूह (पीएफ), 3) शराब जोखिम तरल आहार (ALC/ADNF-9) के साथ ADNF-9 पेप्टाइड की intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) प्राप्त करना चाहिए जो पेप्टाइड उपचार समूह,. कृत्रिम अंग केन्द्र और पीएफ आहार की तैयारी के विवरण और आईपी इंजेक्शन की प्रक्रिया हमारे हाल ही में काम 4 में पाया जा सकता है.
- पोषक तत्वों का एकमात्र स्रोत के रूप में मुफ्त का उपयोग के रूप में प्रदान किया जा सकता है कि प्रतिदिन शराब तरल आहार उपाय. पीएफ तरल आहार व्यक्तिगत टी yokedओ एक कृत्रिम अंग केन्द्र बांध के रूप में अच्छी तरह से दैनिक मापा जा सकता है.
- पिछले 24 घंटे के दौरान खपत तरल आहार की मात्रा से दर्ज किया जा सकता है 30 मिलीलीटर पेंच टोपी ट्यूब स्नातक और हौसले से तैयार आहार E7 से E13 के लिए दैनिक प्रदान की जानी चाहिए.
2. भ्रूण और भ्रूण दिमाग की Microdissection के विच्छेदन
- गहराई से एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद एक सीओ 2 की प्रक्रिया के साथ चूहों euthanizing से E13 पर गर्भवती चूहों बलिदान.
- 70% इथेनॉल के साथ चीरा के पेट साइट को साफ करें.
- बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग कर एक पेट चीरा बनाओ.
- पेट खुल जाने के बाद, एक संदंश के साथ इसे पकड़ और दूर गर्भाशय से mesometrium फाड़ करने के लिए अन्य संदंश का उपयोग करके गर्भाशय काटना. भ्रूण puncturing से बचने के क्रम में धीरे धीरे इस प्रक्रिया को करने के लिए सुनिश्चित करें.
- गर्भाशय से भ्रूण निकालें और हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान युक्त (60 मिमी x 15 मिमी) एक सेल संस्कृति डिश में उन्हें स्थानांतरण (HBSS) बर्फ के ठंडे पानी में.
- सूक्षम लिए stereomicroscope के तहत पूरे भ्रूण से भ्रूण के दिमाग काटना.
- सूक्षम के लिए अल्ट्रा ठीक संदंश का प्रयोग, खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए सिर के ऊपरी भाग में भ्रूण की त्वचा से दूर खींच.
- एक बार जब खोपड़ी सामने आ रहा है और स्पष्ट रूप से फिर रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क क्षेत्रों में मस्तिष्क के पिछले भाग से शुरू खोपड़ी से छील, सूक्षम stereomicroscope के तहत कल्पना.
- सिर के पूर्वकाल भागों के लिए पीछे से टुकड़ा द्वारा खोपड़ी टुकड़ा बंद छील करने के लिए सुनिश्चित करें.
- भ्रूण के दिमाग नेत्रहीन उजागर कर रहे हैं, उन्हें निकालने के साथ आगे बढ़ना.
- उत्स घ्राण बल्ब के आधार से metencephalon के आधार पर भ्रूण दिमाग काटना.
- पोस्टफिक्स सभी 2-3 दिनों के लिए 4% paraformaldehyde में भ्रूण दिमाग विच्छेदित. आप पश्चिमी धब्बा या एंजाइमी assays के लिए उन्हें परीक्षण कर रहे हैं अगर आप भी प्रत्येक बांध से अन्य भ्रूण दिमाग जमा कर सकते हैं.
3. सेक्शनिंग के लिए जिलेटिन में भ्रूण दिमाग एम्बेड
- जिलेटिन ग्रेड ए का 10% तैयार करें
- आधे रास्ते में एक छील दूर एम्बेड मोल्ड भरें और जिलेटिन solidifies तक इंतजार.
- जम जिलेटिन के शीर्ष पर रखें नियंत्रण और prenatally इलाज भ्रूण दिमाग पक्ष द्वारा साइड. यह नियंत्रण और प्रयोगात्मक दोनों समूहों के बीच कोशिका मृत्यु का immunodetection के अनुरूप शर्तों रखने के लिए है.
- (जिलेटिन बहुत गर्म नहीं है यकीन है कि) एक पूरा ढालना बनाने के लिए भ्रूण दिमाग के शीर्ष पर जिलेटिन तरल जोड़ें.
- 15 मिनट के लिए भ्रूण दिमाग रखती है कि तैयार जिलेटिन ढालना ठण्डा.
- कपड़ा उतार लेनातो एम्बेडिंग प्लास्टिक मोल्ड और दो दिनों के लिए 4% paraformaldehyde में पूर्व बनाया जिलेटिन युक्त भ्रूण दिमाग हस्तांतरण.
- में रखें और अनुभाग भ्रूण दिमाग तय जिलेटिन राज्याभिषेक सेक्शनिंग के लिए 50 माइक्रोन मोटाई से कम vibratome सेक्शनिंग मशीन (Leica वीटी 1000S) का उपयोग कर. यह बेहतर शारीरिक विशेषताओं प्रदान करता है क्योंकि यह मोटाई हमारे अध्ययन में परीक्षण किया है. इसके अलावा, 25 माइक्रोन की मोटाई और उच्च भी 10% जिलेटिन में भ्रूण के दिमाग की एम्बेडेड से जुड़े इस तकनीक के साथ परीक्षण किया जा सकता है. अग्रमस्तिष्क पर बेसल ganglia श्रेष्ठता स्तर पर vibratome का उपयोग राज्याभिषेक वर्गों काट रहे थे कि नोट
- फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के घोल में भ्रूण के मस्तिष्क वर्गों लीजिए.
- पानी में Superfrost प्लस स्लाइड में भ्रूण के मस्तिष्क वर्गों माउंट.
- 15 मिनट के लिए मुहिम शुरू वर्गों सूखी.
- TUNEL के प्रतिक्रिया के अगले दिन परीक्षण के लिए पीबीएस में स्लाइड्स (भ्रूण के मस्तिष्क वर्गों के साथ घुड़सवार) रखें.
4. डी के लिए TUNEL के रिएक्शनकोशिका मृत्यु या apoptosis की tection
(TUNEL: TdT की मध्यस्थता dUTP निक एंड लेबलिंग; TdT: टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़). यह परख कोशिका मृत्यु का निर्धारण करने के उद्देश्य से है.
- 37 डिग्री सेल्सियस (20 मिलीलीटर पीबीएस में मिश्रित proteinase कश्मीर के 300 μl) में 5 मिनट के लिए proteinase कश्मीर (20 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ Superfrost प्लस स्लाइड में घुड़सवार भ्रूण के मस्तिष्क वर्गों समझो. स्लाइड्स) 5 Plend खुला Maile में इकट्ठा कर रहे हैं.
- कक्षीय हिलनेवाला के तहत 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार भ्रूण के मस्तिष्क वर्गों (स्लाइड में घुड़सवार) कुल्ला.
- 3% कमरे के तापमान पर 10 मिनट (3 मिलीग्राम 30% 27 में एच 2 हे 2 मिलीलीटर 100% मेथनॉल) (स्लाइड एक प्रकार के बरतन में नहीं होना चाहिए) के लिए मेथनॉल में एच 2 2 हे के साथ वर्गों सेते हैं.
- कक्षीय प्रकार के बरतन में 5 मिनट के लिए पीबीएस तीन बार के साथ वर्गों कुल्ला.
- बर्फ पर 2 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) (100 μl TritonX + 0.1 ग्राम सोडियम साइट्रेट + 99.9 मिलीलीटर डिस्टीलियरीज लिए permeabilization के समाधान में वर्गों (0.1% 0.1% सोडियम साइट्रेट में TritonX-100) सेतेघ पानी).
- कक्षीय प्रकार के बरतन में 5 मिनट के लिए पीबीएस में वर्गों दो बार कुल्ला.
- स्लाइड में वर्गों के आसपास शुष्क क्षेत्र.
- पीएपी पेन का उपयोग कर Superfrost प्लस स्लाइड पर बाधा ड्रा. यह किसी भी TUNEL के पॉजिटिव कोशिकाओं का पता लगाने के लिए वर्गों के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है कि समाधान की लीक को रोकने के उद्देश्य से है.
- 37 पर 1 घंटे के लिए TUNEL के प्रतिक्रिया मिश्रण (बोतल 1 से 50 μl और बोतल 2 से 450 μl) डिग्री सेल्सियस के साथ वर्गों सेते हैं, नियंत्रण बोतल 2 से समाधान में ऊष्मायन द्वारा उपयोग किया जाएगा.
- ऑर्बिट प्रकार के बरतन के तहत पीबीएस तीन बार 5 मिनट से कुल्ला.
- ऊतक आसपास शुष्क क्षेत्र.
- 37 पर 30 मिनट के लिए कनवर्टर पॉड के साथ वर्गों सेते डिग्री सेल्सियस
- Tris एचसीएल (पीएच 7.5, 0.05 एम) के साथ 5 मिनट के लिए वर्गों तीन बार कुल्ला.
- 0.05% 3'-3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (थपका) और 0.003% एच 2 2 हे (25 मिलीलीटर Tris एचसीएल, pH7.5, 0.05 एम + 25 μl 3% एच 2 0 2 500 में 7 मिनट के लिए वर्गों सेते μl थपका) 4 में Oribtal प्रकार के बरतन के तहत डिग्री सेल्सियस (बर्फ में) और अंधेरे में () नया 5 Plend खुला मेलर में यह प्रक्रिया करने के लिए सुनिश्चित करें.
- कक्षीय हिलनेवाला तहत पीबीएस तीन बार 5 मिनट के साथ वर्गों कुल्ला.
- अगले भाग प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप Nissl धुंधला के लिए उन्हें प्रक्रिया फिर, पीबीएस में कोई अधिक से अधिक 24 घंटे के लिए पीबीएस में स्लाइड्स वर्गों रखें.
नोट: थपका एक कैसरजन है. दस्ताने का प्रयोग करें और एक बार सभी प्रयोगों के साथ समाप्त हो ब्लीच के साथ उपयोग किए गए सभी बर्तन साफ.
5. सूक्ष्म अवलोकन के लिए भ्रूण के मस्तिष्क वर्गों की तैयारी के लिए Nissl धुंधला
- Nissl धुंधला प्रक्रिया एक जैविक सुरक्षा हुड में किया जाना चाहिए.
- 2 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी के साथ स्लाइड वर्गों कुल्ला.
- 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में वर्गों सेते हैं.
- 6 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में वर्गों सेते हैं.
- 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में वर्गों सेते हैं.
- विआयनीकृत वाट में वर्गों कुल्ला2 मिनट के लिए एर.
- Cresyl बैंगनी वर्गों में 3 मिनट के लिए दाग सेते हैं.
- 2 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में वर्गों कुल्ला.
- 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में वर्गों सेते हैं.
- 3 मिनट के लिए 95% इथेनॉल + 3 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड में वर्गों सेते हैं.
- 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में वर्गों सेते हैं.
- 2 मिनट में तीन बार के लिए 100% इथेनॉल में वर्गों सेते हैं.
- 10 मिनट के लिए तीन बार Xylene में वर्गों सेते हैं.
- भ्रूण के मस्तिष्क वर्गों पकड़े स्लाइड्स Permount और कवर पर्ची गिलास स्लाइड का उपयोग कर रखा जा सकता है.
- घुड़सवार रातोंरात सूक्ष्म अवलोकन और विश्लेषण करने से पहले स्लाइड छोड़ दें.
- सूक्ष्म अवलोकन और photomicrographs Leica ईमानदार माइक्रोस्कोप के तहत किया जा सकता है.
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Representative Results
प्रयोगात्मक विधियों 2 घंटा प्रजनन खिड़की सही गर्भावधि चरण आकलन करने के लिए आवश्यक है पता चलता है कि यहां का वर्णन किया. हम E13 की उम्र में भ्रूण का विच्छेदन प्रदर्शन किया है. हम भी E13 में भ्रूण के दिमाग की सूक्षम प्रदर्शन किया. प्रक्रिया के रूप में चित्र 1 में वर्णित कई चरणों (एसी), शामिल है. भ्रूण दिमाग उत्स घ्राण बल्ब के आधार से metencephalon के आधार (चित्रा 1) को विच्छेदित कर रहे हैं. भ्रूण दिमाग तो immunochemical का पता लगाने के लिए 4% paraformaldehyde में तय कर रहे हैं. निर्धारण के बाद, भ्रूण दिमाग जिलेटिन 10% में एम्बेडेड रहे हैं और चित्रा 2 में वर्णित के रूप में vibratome सेक्शनिंग के लिए तैयार है. भ्रूण के दिमाग का कदम दर कदम एम्बेडिंग कम बढ़ाई पर प्रदर्शन किया गया था कि ध्यान दें. एम्बेडेड भ्रूण दिमाग चित्र 1 में उच्च बढ़ाई कल्पना की जा सकती. इसके अलावा, अग्रमस्तिष्क पर ganglionic श्रेष्ठता के स्तर पर राज्याभिषेक भ्रूण के मस्तिष्क वर्गों कर सकते हैंvibratome का उपयोग प्राप्त और immunohistochemical पता लगाने के लिए स्लाइड में रखा जाएगा. इस TUNEL के पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा 3) की संख्या शामिल है. हम जन्म के पूर्व शराब जोखिम पीएफ नियंत्रण समूह (चित्रा 3a) की तुलना में ganglionic श्रेष्ठता में TUNEL के पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा 3b) में वृद्धि प्रेरित किया कि यहाँ दिखा. ADNF -9 प्रशासन काफी कृत्रिम अंग केन्द्र समूह की तुलना में TUNEL के पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा -3 सी और 3 डी) में शराब प्रेरित वृद्धि कम हो.
चित्रा 1. E13 में भ्रूण के दिमाग की microdissection. भ्रूण से विच्छेदित भ्रूण दिमाग के चरणों एसी शो कदम दर कदम प्रक्रिया है. एक) Dissected नियंत्रण (पीएफ) और अल्कोहल (कृत्रिम अंग केन्द्र) prenatally भ्रूण अवगत कराया. ख) ग) पीएफ और कृत्रिम अंग केन्द्र समूहों की Dissected भ्रूण दिमाग.
चित्रा 2. सेक्शनिंग के लिए भ्रूण दिमाग एम्बेड करने के लिए विधि. चरणों vibratome काटने के लिए वस्तु में जिलेटिन ब्लॉक की स्थापना के लिए भ्रूण के दिमाग की एम्बेडिंग की तैयारी से (एई) शो कदम दर कदम प्रक्रिया. एक) भरा पील दूर एम्बेड ढालना आधे रास्ते में जिलेटिन के साथ, ख) पीएफ नियंत्रण और कृत्रिम अंग केन्द्र समूहों से भ्रूण दिमाग मोल्ड में पक्ष द्वारा साइड रखा जाता है और जिलेटिन के साथ कवर;) ग पील दूर एम्बेड ढालना चार पक्षों में कटौती, घ) भ्रूण के दिमाग में एम्बेडेड जिलेटिन और तैयार paraformaldehyde में तय होने के लिए, ई) जीईभ्रूण के दिमाग युक्त लैटिन ढालना vibratome सेक्शनिंग के लिए वस्तु में रखा जाता है.
चित्रा 3. पीएफ समूह (एक) की तुलना में कृत्रिम अंग केन्द्र समूह (ख) में तीर द्वारा संकेत के रूप में E13 मंच पर ganglionic श्रेष्ठता में TUNEL के परख का उपयोग शराब प्रेरित apoptosis के खिलाफ neurotrophic पेप्टाइड, ADNF -9, के प्रभाव. जन्म के पूर्व शराब जोखिम कोशिका मृत्यु में वृद्धि प्रेरित किया. जन्म के पूर्व शराब जोखिम के साथ ADNF -9 प्रशासन TUNEL के पॉजिटिव कोशिकाओं (ग) में कमी देखी गई. सांख्यिकीय विश्लेषण ADNF -9 प्रशासन TUNEL के पॉजिटिव कोशिकाओं (घ) में शराब प्रेरित बढ़ता रोका कि प्रदर्शन किया. मान का मतलब ± SEM के रूप में दिखाया जाता है. * पी 0.05 <; ** पी <0.01 (न्यूमैन-Keul का पद अस्थायी परीक्षण). एन प्रत्येक समूह के लिए = 4. स्केल बार = 100 माइक्रोन. एल से अनुमति के साथ प्रकाशन (4), से पुनर्प्रकाशितसेवियर (लाइसेंस # 2904310752995).
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Discussion
इस अध्ययन में प्रस्तुत कार्यप्रणाली और प्रौद्योगिकी प्रसव पूर्व भ्रूण के दिमाग में शराब के लिए जोखिम और इन प्रभावों की रोकथाम में पौष्टिकता पेप्टाइड्स की भूमिका के प्रभाव को प्रदर्शित करता है. ये अलग गर्भावस्था के चरणों के दौरान दुर्व्यवहार या भ्रूण के दिमाग में अन्य जहरीले रसायनों के अन्य दवाओं का अध्ययन करने के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है.
प्रजनन प्रतिमान करने का संबंध है, कुछ मामलों में शुक्राणु प्लग का पता लगाने नमूदार नहीं किया जा सकता है. इस बिंदु पर, यह संभव शुक्राणु सकारात्मक पहचान प्रदान कर सकते हैं, जो सूक्ष्म निगरानी में एक स्लाइड में योनि स्मियर परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है.
यह खिला पीएफ नियंत्रण और अल्कोहल युक्त तरल आहार का मुफ्त का उपयोग शामिल है कि इस अध्ययन में कहा गया है. कम से कम 30 नमी का% और 22-24 से अधिक नहीं एक डिग्री सेल्सियस के तापमान आहार 1,2 करने के लिए 24 घंटे का मुफ्त उपयोग के दौरान भोजन की गुणवत्ता पर नजर रखने के लिए आवश्यक हैं. यह भी आवश्यक है किआहार दैनिक ताजा तैयार रहना. खिला ट्यूब प्रत्येक उपयोग के बाद साफ किया जाना चाहिए.
भ्रूण के दिमाग की सूक्षम में कठिनाइयों कर रहे हैं. ये परीक्षण भ्रूण अवस्था पर निर्भर करते हैं. उदाहरण के लिए, E13 की उम्र में विच्छेदित भ्रूण दिमाग E18 पर विच्छेदित भ्रूण दिमाग की तुलना में से निपटने के लिए मुश्किल हो सकता है. यह E18 पर, भ्रूण के दिमाग में अच्छी तरह से विकसित और खोपड़ी खोपड़ी अभी भी बाहर खींचने के लिए मुलायम और मुश्किल है जब E13, की तुलना में खींच करने के लिए आसान हो जाता है कि वास्तव में कारण है. इस बिंदु पर, E13 में भ्रूण दिमाग विदारक है, यह इस पांडुलिपि के साथ आपूर्ति की वीडियो में प्रदर्शन के रूप में खोपड़ी के टुकड़े दर टुकड़े खींच करने के लिए महत्वपूर्ण है.
जिलेटिन में भ्रूण दिमाग एम्बेड करने का संबंध है, हम इस immunohistochemical विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं कि वर्गों को प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छी तकनीक है कि पाया. भ्रूण के मस्तिष्क का बेहतर काटने के क्रम में, यह महत्वपूर्ण है कि के 4% paraformaldehyde में नियतनभ्रूण के दिमाग युक्त जिलेटिन ब्लॉक पूरा हो गया है. इस प्रकार, यह कम से कम दो दिन लग सकते हैं, और जिलेटिन ब्लॉक तीसरे दिन से काटने के लिए तैयार हो सकता है. वर्गों की मोटाई भी एक कारक है, 50 माइक्रोन मोटाई आमतौर पर इस तरह के TUNEL के परख 1,2,4 के रूप में immunochemical का पता लगाने के लिए परीक्षण किया है. हालांकि, 25 माइक्रोन की मोटाई और उच्च भी परीक्षण किया जा सकता है.
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Disclosures
कोई खुलासे किए जाने के लिए.
Acknowledgments
इस शोध परियोजना शराब सेवन और शराब पर राष्ट्रीय संस्थान से पुरस्कार संख्या R21AA017735 (वाई एस) द्वारा समर्थित किया गया था. सामग्री केवल लेखक की जिम्मेदारी है और जरूरी शराब सेवन और शराब या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों पर राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता. लेखक भी इस पांडुलिपि संपादन के लिए Charisse मोंटगोमरी को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
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