Summary
这里重点提出的实验设计，研究酒精暴露在怀孕期间胎儿大脑细胞凋亡和应用营养神经肽的影响。从养殖到胎儿大脑的集合的详细描述。细胞凋亡的测定技术进行详细说明。
Abstract
调查产前酒精暴露在早期胚胎阶段的胎儿大脑发育的影响的实验设计是具有挑战性的。这主要是由于胎儿的大脑和他们测定产前暴露于酒精引起的细胞凋亡的切片显微切割的难度。这里所描述的实验提供从小鼠胎儿脑组织中繁殖的细胞死亡的识别的可视化技术。本研究采用C57BL / 6小鼠为动物模型，为研究胎儿酒精暴露和营养肽对酒精诱导的细胞凋亡的作用。养殖由2小时抠图窗口，以确定确切的胚胎年龄阶段。建立了胎儿酒精暴露模型已被用于这项研究，以确定影响胎儿大脑的产前酒精暴露。这涉及到免费使用酒精或对喂流质饮食，孕鼠营养的唯一来源。
为了研究细胞凋亡，胎儿的大脑是第一款嵌入式明胶使用剥离远离模具，以方便他们的切片vibratome的装置。嵌入并固定在多聚甲醛的胎儿大脑容易切片，和自由浮动部分可以安装在测定细胞凋亡或细胞死亡的Superfrost加幻灯片。
转移酶介导的缺口末端标记; TDT：脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TUNEL）检测已被用来确定细胞死亡或凋亡细胞。值得注意的是，APoptosis和细胞介导的细胞毒性，其特征在于DNA片段。因此，可视化的TUNEL阳性细胞的细胞死亡或细胞凋亡的指标。
这里的实验设计提供信息使用酒精的作用研究建立流质饮食和营养神经肽的作用，在怀孕期间胎儿的大脑。这涉及孕鼠的繁殖和饲养，胎儿大脑microdissecting，并决定细胞凋亡。总之，这些视觉和文本的技术可能是胎儿大脑有害物质调查产前暴露源。
Introduction
这里描述的实验方法的目标是评估胎儿酒精暴露模型使用几个涉及养殖技术，饲养营养肽，microdissecting，并检测细胞死亡的神经保护作用。从我们的实验室工作涉及的流质饮食，适度饮酒，这可能是人类在长期的酒精量的饮用水范式类似的模型与酒精混合食用1-5。我们和其他人反对的有害影响胎儿酒精暴露，神经保护的三肽衍生物。调查酒精暴露在胚胎阶段，使用动物模型的研究可能会导致潜在神经保护机制识别和允许干预程序的发展。这可能会提供足够的信息在怀孕期间接触酒精的有害影响的神经保护作用和衰减。
产前酒精暴露的影响，可能预防可能涉及治疗用肽已被证明是参与神经保护作用的体外 6,7和体内 1,2,4,8,9孕鼠。在这些肽中，ADNF-9或SAL称为SALLRSIPA来自活性依赖的神经营养因子（ADNF）7,10。另一种肽序列NAPVSIPQ肽，称为NAP，来自活性依赖的神经保护蛋白（ADNP）的6,11，表现出了强有力的保护作用，抗氧化应激伴有酒精暴露12,13。此外，我们最近发现了一种新的合成肽，colivelin，似乎发挥了关键的保护作用，在胎儿酒精暴露模型2。 colivelin由ADNF-9和AGA-（C8R）HNG17（PAGASRLLLLTGEIDLP）的。使用这些肽的重要性是，他们有能力穿越血脑屏障，防止酒精诱导的细胞凋亡的影响和大脑发育赤字的。
实验方法用于测试针对酒精诱导的细胞凋亡的神经保护作用使用C57BL / 6小鼠。为了准确估计胚胎第0 天（E0），因为它可以检测精子塞阴道涂片1-5透露，我们已经采取了2小时的窗口，而不是一夜之间育种。我们已经用流质饮食，因为这被认为是自由访问，而不是通过交付酒精灌胃的路线，这可能会引起应力怀孕小鼠喂养管。另一方面，显微切割可以是具有挑战性由于胎儿脑组织，解剖时可能会遇到在早期胚胎阶段的胎儿大脑的柔软度。在这里，我们将展示可视化技术，以应对所有的挑战，涉及显微切割。此外，也可以是具有挑战性的，因为胎儿的大脑切片，我们已采纳涉及嵌入胎儿大脑中明胶的使用剥离远离嵌入模具的技术。我们已经成功地在自由浮动的部分切割胎儿大脑在50微米厚。这使得我们可以调查任何改动的内容蛋白在胎儿的大脑部分，包括细胞死亡的鉴定。
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Protocol
1。动物育种与营养肽治疗
- 品种C57BL/mice将雌性小鼠（〜6周岁，平均体重20克）到2小时的男性的笼子。
- 精子塞和/或阴道涂片检查后立刻。
- 如果是正数，指定这个时间点为胚胎第0天（E0）。
- E7，重量匹配怀孕女性对照组和治疗组（3组）最近被指定为4：1）酒精（乙醇）的流质饮食组（ALC）; 2）对喂养的对照组（PF）; 3）肽治疗组，应该接受腹腔（IP）ADNF-9肽注射酒精暴露流质饮食（ALC/ADNF-9）的旁边。编制的ALC和PF的饮食和腹腔注射过程的细节，可以发现在我们最近的工作4。
- 测量每日饮酒流质饮食可以提供免费访问作为唯一的营养来源。 PF流质饮食个别轭吨ØALC坝每天可以测量。
- 流质饮食，在过去24小时消耗的体积可以记录30毫升毕业于螺丝帽管，并应提供新鲜烹制的饮食，每天从E7到E13。
2。胎儿解剖显微切割与胎儿大脑
- 牺牲孕鼠E13通过深入实施安乐死的小鼠与CO 2程序由颈椎脱位。
- 用70％乙醇清洁腹部切口。
- 做腹部切口，用无菌剪刀和镊子。
- 一旦腹部是开放的，拿着它用一个镊子和使用其他镊子撕膜及远离子宫子宫解剖。请一定要慢慢做这个程序，以避免穿刺胚胎。
- 从子宫中取出胚胎，并将它们传送到一个细胞培养皿（60毫米×15毫米）的Hanks'平衡盐溶液 （HBSS），在冰冷的水。
- 从整体胚胎体视显微镜下进行显微切割，解剖胎儿大脑。
- 采用超细显微切割钳，拉断的胚胎在头的上部暴露颅骨皮肤。
- 一旦头骨暴露，并清晰地显示的显微解剖体视显微镜下，然后剥离颅骨从后壁的部分大脑在脊髓和脑干区。
- 一定要一块一块地从后部到前部，头颅骨剥离。
- 一旦胎儿的大脑视觉接触，进行提取。
- 解剖胎儿大脑，从基原基嗅球，后脑的基础上。
- Postfix的所有解剖胎儿的大脑在4％多聚甲醛为2-3天。您也可以从每个水坝冻结其他胎儿大脑，如果你正在测试他们Western blot法或酶法检测。
3。嵌入胎儿大脑切片明胶
- 准备10％的明胶A级
- 填补嵌入模具剥离外半等到明胶凝固。
- 将控制和产前治疗胎儿的大脑侧由端之上的凝固的明胶。这是为了保持一致的条件下在对照组和实验组之间的细胞死亡的免疫检测。
- 添加液体明胶顶部胎儿的大脑，使一个完整的模具（确保明胶是不是太热了）。
- 制备的明胶模具冷藏保存15分钟的胎儿的大脑。
- 剥离嵌入模具塑料预先制作明胶含有胎儿的大脑，然后转移到4％多聚甲醛两天。
- 固定地点及部分胎儿的大脑在明胶vibratome的切片机（莱卡VT 1000S）冠状切片厚度为50微米。该厚度的测试是在我们的研究中，因为它提供了更好的解剖特征。此外，厚度为25μm，也可以进行测试，用这种技术，涉及嵌入胎儿的大脑中，在10％的明胶。需要注意的是冠状切片，使用前脑vibratome的上基底节隆起水平
- 收集胎儿的脑切片，于磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液。
- 安装的Superfrost Plus水滑梯胎儿的大脑部分。
- 擦干安装部分为15分钟。
- 将幻灯片（安装与胎儿的大脑部分），在PBS第二天测试TUNEL反应。
4。德TUNEL反应细胞死亡或凋亡TECTION
（TUNEL末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记; TDT：脱氧核糖核苷酸末端转移酶）。此法的目的是，以确定细胞死亡。
- 治疗胎儿的大脑部分的Superfrost幻灯片加蛋白酶K（20微克/毫升），装在5分钟，37°C（300微升的蛋白酶K混合在20毫升PBS）。幻灯片组装在5-Plend开MAILE）。
- 冲洗胎儿的大脑部分（安装在投影片），用PBS三次轨道摇床下5分钟。
- 孵育的部分，用3％H 2 O 2在甲醇中，在室温下和10分钟（3毫升30％H 2 O 2在27毫升100％甲醇）（幻灯片不应该在摇床）。
- 用PBS三次冲洗部分5分钟轨道摇床。
- 部分在透化溶液（0.1％表面活性剂TritonX-100，0.1％的柠檬酸钠）孵育2分钟，在冰上（4℃）（100微升表面活性剂TritonX + 0.1柠檬酸钠+99.9毫升distille二维水流）。
- 在轨道摇床中的5分钟，在PBS中冲洗部分两次。
- 干周围部分幻灯片。
- 绘制屏障的Superfrost Plus幻灯片使用PAP笔。这旨在防止任何泄漏的解决方案，是用于治疗的TUNEL阳性细胞的检测的部分。
- TUNEL反应混合物（50微升1瓶和2瓶450微升）1小时，在37°C孵育部分将用于培养瓶2溶液中，控制。
- 用PBS三次5分钟轨道摇床下冲洗。
- 干周围组织。
- 孵育部分与转换器-POD 30分钟，在37°C。
- 冲洗部分三次，用Tris盐酸（pH值7.5，0.05 mol）的5分钟。
- 孵育7分钟，在0.05％的3'-3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）和0.003％H 2 O 2（25毫升的Tris盐酸，pH7.5的0.05M的+25μl的3％的H 2 O 2 + 500的部分民建联微升）根据抖Oribtal器在4°C（冰），并在黑暗中（确保做到这一点在新的5 Plend打开邮件的程序）。
- 用PBS三次轨道摇床下5分钟，冲洗部分。
- 保持幻灯片的部分不超过24小时的PBS中，然后在PBS处理他们的尼氏染色，在下一节中详细协议。
注：DAB是一种致癌物质。使用手套及清洁漂白一次完成所有的实验使用的所有菜肴。
5。尼氏染色显微镜观察胎儿脑切片制备
- Nissl染色程序应做在生物安全罩。
- 滑动部分，用去离子水冲洗2分钟。
- 孵育2分钟，在70％乙醇的部分。
- 孵育6分钟，95％乙醇中的各节。
- 孵育2分钟，在70％乙醇的部分。
- 冲洗部分在去离子笏ER 2分钟。
- 孵育部分甲酚紫染色3分钟。
- 的部分在去离子水中漂洗2分钟。
- 孵育2分钟，在70％乙醇的部分。
- 孵育在95％乙醇3分钟+ 3毫升冰醋酸部分。
- 孵育2分钟，在95％乙醇部分。
- 孵育的部分在100％乙醇3次，持续2分钟。
- 孵育10分钟三次二甲苯的部分。
- 可以安装使用Permount和盖玻片载玻片幻灯片控股胎儿的大脑部分。
- 一夜之间离开安装滑动前到微观的观察与分析。
- 徕卡直立显微镜下进行显微观察和显微。
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Representative Results
这里所描述的实验方法表明，有2小时的繁殖窗口是必不可少的，以判断准确的妊娠阶段。在E13的年龄，我们已经展示了清扫的胚胎。我们还展示了胎儿大脑的显微解剖E13。该过程包括几个阶段（交流）， 图1中所描述的。胎儿大脑的解剖从基原基嗅球，后脑（ 图1）的基极。胎儿的大脑，然后固定在4％多聚甲醛固定，进行免疫化学检测。固定后，在10％明胶嵌入胎儿大脑和vibratome的切片，如在图2中描述的制备。需要注意的是在较低的放大倍率进行一步一步的嵌入胎儿大脑。胎儿大脑的嵌入可以在更高的放大倍率在图1中被可视化。此外，日冕胎儿大脑前脑部分神经节隆起的水平获得使用的vibratome安装在幻灯片免疫组化检测。这涉及到TUNEL阳性细胞的数量（ 图3）。我们在这里展示产前酒精暴露引起的TUNEL阳性细胞，神经节隆起（ 图3b）相比增加PF对照组（ 图3a）。 ADNF-9给药显着降低酒精引起的增加相比，ALC组中TUNEL阳性细胞（ 图3c和3d）。
图1。胎儿大脑的显微切割E13。交流阶段显示一步一步的过程及●从胚胎到胎儿大脑解剖。）解剖控制（PF）和酒精（ALC）产前暴露的胚胎。 二） 。C）PF和ALC组解剖胎儿大脑。
图2。嵌入胎儿的大脑切片的方法。阶段（AE）显示一步一步的vibratome的切割对象的阿胶块设置胎儿大脑的嵌入程序，从编制一）剥离的嵌入模具填充用明胶半; 二）从PF控制胎儿的大脑和ALC组被放置在模具中端和覆盖使用明胶; c）剥离外嵌入模具切四边D）胎儿大脑中嵌入明胶和准备多聚甲醛固定，E）GE被放置在含有拉丁模具的胎儿大脑切片vibratome的对象。
图3。影响脑源性神经营养肽，ADNF-9，反对酒精诱导的细胞凋亡TUNEL法检测神经节隆起在E13阶段。产前酒精暴露诱导细胞死亡的增加相比，PF组（一）ALC组（B）中的箭头表示。 ADNF-9一起行政产前酒精暴露呈减少TUNEL阳性细胞（C）。统计分析表明，ADNF-9给药的防止酒精引起的增加，TUNEL阳性细胞（四）。值显示为平均值±标准差。 * P <0.05; ** P <0.01（纽曼KEUL的事后检验）。各组N = 4。比例尺= 100微米。转载自出版（4），从El许可塞维尔（许可证编号2904310752995）。
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Discussion
在这项研究中提出的方法和技术演示的影响，产前暴露于酒精在胎儿大脑和营养肽的作用，对预防这些影响。这些可能提供关于如何学习其他药物滥用或其他有毒化学物质在胎儿的大脑在不同妊娠阶段的信息。
在对于繁殖范式，在某些情况下，精子插头的检测可能不被观察到。在这一点上，它是重要的测试中的幻灯片的阴道涂片在显微镜观察下，它可以提供可能的阳性精子检测。
据指出，在这项研究中，喂食流质饮食含有PF控制和酒精包括免费使用。至少30％的湿度和温度不超过22-24°C是必需的24小时免费使用的饮食1,2期间的饮食质量监测。这也是需要的饮食每天准备新鲜。每次使用后应及时清洗喂食管。
显微切割胎儿大脑有困难。这些依赖于萌芽阶段测试。例如，胎儿的大脑解剖岁E13是很难对付与胎儿大脑解剖E18相比。这是因为，E18，胎儿的大脑发达，头骨变得容易拉断，相比E13，头骨仍然是柔软，不易拉断时的事实。此时，胎儿的大脑解剖时在E13，它是重要的拉断的头骨片逐片在视频稿件附带证明。
嵌入胎儿大脑在明胶方面，我们发现，这是最好的技术来获得部分准备用于免疫组化分析。为了有更好的切割胎儿的大脑，重要的是，在4％多聚甲醛固定的阿胶块含有胎儿的大脑是完整的。因此，这可能需要至少两天，阿胶块可能是准备用于切割第三天。的部分的厚度也是一个因素，厚度为50微米，通常为（如TUNEL检测1,2,4）的免疫组织化学检测测试。然而，厚度为25μm，也可以进行测试。
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Disclosures
没有披露。
Acknowledgments
该研究项目得到了奖号码R21AA017735国家酒精滥用与酒精中毒研究所（YS）。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立酒精滥用和酒精中毒或美国国立卫生研究院的官方意见。笔者还要感谢里斯蒙哥马利编辑这篇稿子。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
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