Summary
De experimentella designerna här föreslås inriktas på att studera effekterna av alkohol exponering i apoptos och tillämpningen av neurotrofiskt peptid under graviditeten i fostrets hjärna. En detaljerad beskrivning från avel till samlingen av fostrets hjärna beskrivs. Tekniker för bestämning av apoptos beskrivs också i detalj.
Abstract
Experimentell design för att undersöka effekterna av prenatal alkohol exponering under tidiga embryonala stadier i fostrets hjärna tillväxt är utmanande. Detta beror främst på svårigheten att microdissection av fostrets hjärna och deras sektionering för bestämning av apoptotiska celler orsakade av prenatal exponering för alkohol. Experimenten beskrivs här ger visualiserade tekniker från möss avel till identifiering av celldöd i fetal hjärnvävnad. Denna studie använde C57BL / 6 möss som djurmodell för att studera fetal alkohol exponering och rollen av näringsstatus peptid mot alkohol-inducerad apoptos. Uppfödningen består av en 2-hr mattor fönstret för att bestämma den exakta stadiet av embryonala ålder. En etablerad fetal alkohol exponering modell har använts i denna studie för att bestämma effekterna av prenatal alkohol exponering i fostrets hjärna. Detta involverar fri tillgång till alkohol eller parallellt utfodrad flytande dieter som den enda källan av näringsämnen för dräktiga möss.
För att utreda apoptos, är fetala hjärnor först inbäddad i gelatin med en peel-away mögel att underlätta deras sektionering med en vibratome apparat. Fostrets hjärna inbäddade och fixerades i paraformaldehyd är lätt sektioneras, och de fritt flytande sektioner kan monteras i SuperFrost Plus-objektglas för bestämning av apoptos eller celldöd.
TUNEL (TdT-förmedlad dUTP Nick ändmärkning, TdT: terminal deoxinukleotidyltransferas) analys har använts för att identifiera celldöd eller apoptotiska celler. Det är anmärkningsvärt att apoptosis och cellmedierad cytotoxicitet kännetecknas av DNA-fragmentering. Således, de visualiserade TUNEL-positiva celler tyder på celldöd eller apoptotiska celler.
De experimentella designerna här ge information om användningen av ett etablerat flytande diet för att studera effekterna av alkohol och den roll neurotrofa peptider under graviditeten i fostrets hjärna. Detta innebär uppfödning och utfodring dräktiga möss, microdissecting foster hjärnor, och bestämma apoptos. Tillsammans kan dessa visuella och textuella tekniker vara en källa för att undersöka prenatal exponering av skadliga ämnen i fostrets hjärna.
Introduction
Målet med de experimentella metoder som beskrivs här är att bedöma de nervskyddande effekterna av trofiska peptider i fosterställning alkohol exponering modell med flera tekniker som innefattar avel, utfodring, microdissecting, och detektera celldöd. Arbeta från vårt laboratorium har involverat en flytande kost blandat med alkohol som en modell av måttlig alkoholkonsumtion, vilket skulle kunna likna en människa dricka paradigm i tid av den mängd alkohol som konsumeras 1-5. Vi och andra har identifierat tre peptidderivat som är nervskyddande mot de skadliga effekterna av fetal alkohol exponering. Studier som undersöker alkohol exponering under embryonala stadier använder djurmodeller kan leda till identifiering av potentiella mekanismer neuroprotection och möjliggöra utveckling av förfaranden för att ingripa. Detta kan ge omfattande information om de nervskyddande effekter och dämpning av de skadliga effekterna av alkohol exponering under graviditet.
Möjlig förebygga effekterna av prenatal alkohol exponering kan innebära behandling av gravida möss med peptider som har visats vara involverade i skydd in vitro 6,7 och in vivo 1,2,4,8,9. Bland dessa peptider, är SALLRSIPA, känd som ADNF-9 eller SAL, som härrör från verksamhet-beroende neurotrofisk faktor (ADNF) 7,10. En annan peptid med sekvensen NAPVSIPQ peptid, benämnd NAP, som härrör från verksamhet-beroende neuroprotective protein (ADNP) 6,11, visat en potent skyddande effekt mot oxidativ stress i samband med alkohol exponering 12,13. Dessutom har vi nyligen identifierat en ny syntetiserad peptid, colivelin som verkar spela en viktig nervskyddande roll i fostrets alkohol exponering modell 2. Colivelin består av ADNF-9 och AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). Betydelsen av användningen av dessa peptider är att de har förmågan attkorsa hjärnan-blod barriären för att förhindra effekterna av alkohol-inducerad apoptos och hjärnan underskott tillväxt.
De experimentella metoder som används C57BL / 6 möss för att testa de nervskyddande effekter mot alkohol-inducerad apoptos. Vi har antagit en 2-hr fönster istället för natten avel för att exakt uppskatta den embryonala dag 0 (E0), eftersom det kan avslöjas genom detektering av en spermie plugg och vaginalutstryk 1-5. Vi har använt en flytande diet med matningssonden, eftersom detta anses fri tillgång istället för leverans av alkohol genom sondmatning väg, som kan framkalla stress till dräktiga möss. Å andra sidan, kan microdissection vara en utmaning på grund av mjukheten hos foster hjärnvävnad, som kan uppstå när dissekera fostrets hjärna i tidiga embryonala stadier. Här visar vi visualiserade tekniker för att hantera alla de utmaningar som rör microdissection. Vidare, eftersom fostrets hjärna sektionering också kan vara en utmaning, har vi antagiten teknik som innebär att bädda fostrets hjärna i gelatin med avskalningsbara bädda formar. Vi har varit framgångsrika i att skära fostrets hjärna i fritt flytande sektioner på 50 ìm tjocklek. Detta tillåter oss att undersöka eventuella förändringar av innehållet protein i fostrets hjärna sektioner, inklusive identifiering av celldöd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Djur Avel och Trophic peptidbehandling
- Ras C57BL/mice genom att placera de kvinnliga möss (~ 6 veckor gamla, medelvikt 20 g) i manliga hem burar för 2 tim.
- Kontrollera om en spermie plugg och / eller vaginalutstryk omedelbart efteråt.
- Om positivt, utse denna tidpunkt som embryonala dag 0 (E0).
- Den E7, vikt-match dräktiga honor till kontroll-och behandlingsgrupper (3 grupper) tilldelas som nyligen beskrivits 4: 1) Alkohol (etanol) flytande kost grupp (ALC), 2) pair-fed kontrollgruppen (PF), 3) peptid behandlingsgruppen, vilket bör få intraperitoneal (ip) injektion av ADNF-9-peptid vid sidan av alkohol exponering flytande kost (ALC/ADNF-9). Detaljerna i beredningen av ALC och PF dieter och förfarandet för ip injektioner kan hittas i vårt senaste arbete 4.
- Mät dagliga kost alkohol vätska som kan ges fri tillgång som enda näringskälla. PF flytande kost yoked individuellt to en ALC dammen kan mätas dagligen samt.
- Den volym vätska diet förbrukas under den föregående 24 hr kan spelas in från 30-ml graderad skruvkork rör och nylagad kost bör ges dagligen från E7 till E13.
2. Dissektion av foster och microdissection av fostrets hjärna
- Offra dräktiga möss på E13 genom djupt euthanizing mössen med ett CO 2 förfarande som följs av en halsdislokation.
- Rengör buken platsen av snitt med 70% etanol.
- Gör en buksnitt med steril sax och pincett.
- När buken är öppen, dissekera ut livmodern genom att hålla den med en pincett och med användning av andra pincett för att riva mesometrium bort från livmodern. Se till att göra detta förfarande långsamt för att undvika punktering av embryon.
- Avlägsnandet av embryon från livmodern och överföra dem till en cellodlingsskål (60 mm x 15 mm) innehållande Hanks balanserade saltlösning (HBSS) i iskallt vatten.
- Dissekera foster hjärnor från hela embryon enligt stereomikroskop för microdissection.
- Använda ultra-fin pincett för microdissection, dra av huden på embryon vid den övre delen av huvudet för att exponera skallen.
- När skallen är utsatt och tydligt visualiseras under microdissection stereomikroskop, dra sedan av skallen från den bakre delen av hjärnan vid ryggmärgen och områden hjärnstammen.
- Var noga med att dra av skallen bit för bit från bakre till främre delar av huvudet.
- När fostrets hjärna är visuellt exponerade, fortsätt med att extrahera dem.
- Dissekera fostrets hjärna från basen av primordium luktbulben till basen av metencephalon.
- Postfix dissekerade alla fetala hjärnor i 4% paraformaldehyd under 2-3 dagar. Du kan också frysa andra fetala hjärnor från varje dammen om du testar dem för Western blot eller enzymatiska analyser.
Tre. Bädda Fostrets Brains i Gelatin för sektionering
- Förbered 10% av gelatin klass A.
- Fyll en avskalningsbar bädda mögel halvvägs och vänta tills gelatinet stelnar.
- Place kontroll och prenatalt behandlade foster hjärnor sida vid sida ovanpå den stelnade gelatin. Detta för att hålla jämna förhållanden immunodetektion av celldöd mellan både kontroll och experimentella grupper.
- Tillsätt flytande gelatin ovanpå fostrets hjärna för att göra en fullständig form (se till att gelatin är inte för varmt).
- Kyla förberedda gelatin mögel som rymmer foster hjärnor i 15 min.
- Peel offinbäddning mögel plast och sedan överföra färdiga gelatin innehåller fostrets hjärna i 4% paraformaldehyd under två dagar.
- Ort och avsnitt fast fostrets hjärna i gelatin med vibratome sektionering maskin (Leica VT 1000S) vid 50 um tjocklek för frontal sektionering. Denna tjocklek är testad i våra studier, eftersom den ger ett bättre anatomiska kännetecken. Dessutom tjocklekar av 25 | im och högre kan också testas med denna teknik som inbegriper inbäddade av fetala hjärnor i 10% gelatin. Observera att koronala snitt skars med vibratome på basala ganglierna eminens nivå på framhjärnan
- Samla de fetala hjärnan sektioner i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-lösning.
- Montera fostrets hjärna avsnitt i SuperFrost Plus diabilder i vatten.
- Torka monterade sektioner för 15 min.
- Placera glasen (monteras med fostrets hjärna avsnitt) i PBS för nästa dag testning av TUNEL reaktion.
4. TUNEL Reaktion för Deskydd av celldöd eller apoptos
(TUNEL: TdT-förmedlad dUTP Nick ändmärkning, TdT: terminal deoxinukleotidyltransferas). Denna analys syftar till att bestämma celldöd.
- Behandla fetala hjärnan sektioner monterade i Superfrost Plus objektglas med Proteinase K (20 | ig / ml) under 5 min vid 37 ° C (300 | il proteinas K blandat i 20 ml PBS). Objektglasen är samlade i 5-Plend öppen maile).
- Skölj fetala hjärnan sektioner (monterad i diabilder) med PBS tre gånger i 5 min under orbitalskak.
- Inkubera de avsnitt med 3% H 2 O 2 i metanol under 10 min vid rumstemperatur (3 ml 30% H 2 O 2 i 27 ml 100% metanol) (slides bör inte vara i en shaker).
- Skölj sektioner med PBS tre gånger i 5 minuter i orbitalskak.
- Inkubera avsnitt i permeabilization lösning (0,1% TritonX-100 i 0,1% natriumcitrat) under 2 minuter på is (4 ° C) (100 | il TritonX + 0,1 g natriumcitrat + 99,9 ml distilled vatten).
- Skölj sektioner i PBS två gånger under 5 minuter i orbitalskak.
- Torr området kring avsnitten i glasen.
- Rita barriär på SuperFrost Plus diabilder med PAP Pen. Detta syftar till att förhindra läckage av lösning som används för att behandla de sektioner för påvisande av TUNEL-positiva celler.
- Inkubera sektioner med TUNEL reaktionsblandning (50 pl från flaska 1 och 450 l från flaska 2) under 1 timme vid 37 ° C, kommer kontrollen att användas av inkubation i lösning från flaskan 2.
- Skölj med PBS tre gånger 5 min under Orbit shaker.
- Torr området kring vävnad.
- Inkubera sektioner med converter-POD under 30 min vid 37 ° C.
- Skölj sektionerna tre gånger under 5 min med Tris HCl (pH 7,5, 0,05 M).
- Inkubera sektioner för 7 min i 0,05% 3'-3'-diaminobensidintetrahydroklorid (DAB) och 0,003% H 2 O 2 (25 ml Tris-HCl, pH 7,5, 0,05 M + 25 | il 3% H 2 0 2 + 500 xl DAB) Under Oribtal shaker vid 4 ° C (i is) och i mörker (se till att göra den här proceduren i nya 5-Plend öppen Mailer).
- Skölj delarna med PBS tre gånger 5 min under orbitalskakare.
- Håll diabilder sektioner i PBS för mer än 24 timmar i PBS, och sedan bearbeta dem för Nissl färgning enligt beskrivningen i nästa avsnitt protokollet.
Obs: DAB är ett cancerframkallande ämne. Använd handskar och rengöra alla rätter som används med blekmedel gång klar med alla experimenten.
Fem. Nissl färgning för framställning av fostrets hjärna Sektioner för mikroskopisk observation
- Nissl färgningsproceduren bör göras i ett biologiskt säkerhetsskåp huva.
- Skölj slide sektionerna med avjoniserat vatten i 2 min.
- Inkubera sektioner i 70% etanol i 2 min.
- Inkubera sektionerna i 95% etanol under 6 min.
- Inkubera sektioner i 70% etanol i 2 min.
- Skölj delarna i avjoniserat water i 2 min.
- Inkubera avsnitt i kresylviolett Stain i 3 min.
- Skölj delarna i avjoniserat vatten i 2 min.
- Inkubera sektioner i 70% etanol i 2 min.
- Inkubera sektionerna i 95% etanol + 3 ml isättika i 3 min.
- Inkubera avsnitt i 95% etanol i 2 min.
- Inkubera de avsnitt i 100% etanol i 2 min tre gånger.
- Inkubera sektioner i Xylen i 10 min tre gånger.
- Diabilder håller fostrets hjärna sektionerna kan monteras med hjälp Permount och täckglas diabilder glas.
- Lämna monterade diabilder över natten före mikroskopisk observation och analys.
- Mikroskopisk observation och mikrofotografier kan utföras under Leica upprätt mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De experimentella metoder som beskrivs här visar att en 2-hr avel fönster är viktigt att uppskatta exakt graviditetslängd skede. Vi har visat att dissektion av embryon vid en ålder av E13. Vi visade också microdissection av fostrets hjärna på E13. Förfarandet innebär flera steg (Ac), såsom beskrivs i figur 1. Fostrets hjärna dissekeras från basen av primordium luktbulben till basen av metencephalon (Figur 1). Fostrets hjärna sedan fixeras i 4% paraformaldehyd för immunokemisk detektion. Efter fixering är fetala hjärnor inbäddade i 10% gelatin och preparerades för vibratom sektionering såsom beskrivs i figur 2. Observera att steg-för-steg inbäddning av fetala hjärnor utfördes vid lägre förstoring. Fetal inbäddade hjärnor kan visualiseras vid högre förstoring i figur 1. Dessutom koronala fetala hjärnan sektioner på nivån för ganglionär eminens på framhjärnan kanerhållas med vibratome och monterade i diabilder för immunhistokemisk detektion. Detta innebär att antalet TUNEL-positiva celler (figur 3). Vi visar här att prenatal alkohol exponering inducerade ökningar i TUNEL-positiva celler i ganglionär eminens (Figur 3b) jämfört med PF kontrollgruppen (figur 3a). ADNF-9 administrationen minskas kraftigt alkohol-inducerad ökning av TUNEL-positiva celler (Figur 3c och 3d) jämfört med ALC grupp.
Figur 1. Microdissection fetala hjärnor vid E13. Stages ac visar steg-för-steg förfarande s från embryon till dissekeras fetala hjärnor. A) dissekerade kontroll (PF) och alkohol (ALC) exponerade prenatally embryon. B) c) dissekerade foster hjärnor PF och ALC grupper.
Figur 2. Metod för inbäddning foster hjärnor för sektionering. Stages (AE) visar steg-för-steg-anvisningar från framställning av inbäddning av fostrets hjärna till inställningen av gelatin blocket i objektet för vibratome skärning. A) Peel-away bädda mögel fylld halvvägs med gelatin, b) Fetal hjärnor från PF kontroll och ALC grupper är placerade sida vid sida i formen och täcktes med gelatin, c) Peel-away inbäddning mögel avskurna vid fyra sidor, d) fetala hjärnor inbäddade i gelatin och redo som skall fastställas i paraformaldehyd, e) GElatin form som innehåller fetala hjärnor placeras i objektet för vibratome snittning.
Figur 3. Effekter av neurotrofisk peptid, ADNF-9, mot alkohol-inducerad apoptos med hjälp av TUNEL-analys i ganglionär eminens vid E13 skede. Prenatal alkohol exponering inducerade ökningar av celldöd såsom anges med pilhuvuden i ALC grupp (b) jämfört med PF grupp (a). ADNF-9 administration tillsammans prenatal alkohol exponering visade minskning i TUNEL-positiva celler (c). Statistiska analyser visade att ADNF-9 administrationen förhindrade alkohol-inducerade ökningar i TUNEL-positiva celler (d). Värden visas som medelvärden ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 (Newman-Keul s post hoc test). N = 4 för varje grupp. Skala bar = 100 nm. Utdrag ur publikationen (4), med tillåtelse från Elsevier (licens # 2904310752995).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metodik och teknik som presenteras i denna studie visar effekterna av prenatal exponering för alkohol i fostrets hjärna och betydelsen av trofiska peptider för att förebygga dessa effekter. Dessa kan ge information om hur man kan studera andra droger av missbruk eller andra giftiga kemikalier i fostrets hjärna under graviditetens olika skeden.
I avseende på avel paradigm, i vissa fall detekteringen av spermier kontakten inte skulle kunna observeras. Vid denna punkt, är det viktigt att testa vaginalutstryk i ett bildspel under mikroskopisk observation, vilket kan ge möjlighet spermier positiv upptäckt.
Det anges i denna studie att utfodring innebär fri tillgång av flytande kost som innehåller PF kontroll och alkohol. Minst 30% av luftfuktighet och en temperatur som inte överstiger 22-24 ° C krävs för att övervaka kvaliteten på kosten under 24h fri tillgång till kosten 1,2. Det krävs också attdiet beredas på nytt varje dag. De matningssonden bör rengöras efter varje användning.
Det finns svårigheter i microdissection av fostrets hjärna. Dessa beror på den testade fosterstadiet. Till exempel kan fetala hjärnor dissekeras vid en ålder av E13 vara svårt att hantera jämfört med fetala hjärnor dissekeras vid E18. Detta beror på det faktum att vid E18, är fostrets hjärna väl utvecklad och skallen blir lätt att dra bort jämfört med E13, när skallen fortfarande är mjuk och svår att dra bort. Vid denna punkt, när dissekera foster hjärnor på E13, är det viktigt att dra bort skallen bit-by-bit som demonstreras i videon som medföljer detta manuskript.
I fråga om att bädda foster hjärnor i gelatin, fann vi att detta är den bästa tekniken för att få sektioner som är redo att användas för immunhistokemisk analys. För att få bättre skärning av fostrets hjärna, är det viktigt att den fixering i 4% paraformaldehyd igelatin block som innehåller foster hjärnor är klar. Således kan detta ta minst två dagar, och gelatin blocket kan vara redo för att skära av den tredje dagen. Tjockleken av sektionerna är också en faktor, 50 ìm tjocklek brukar testas för immunokemisk detektion såsom TUNEL analys 1,2,4. Dock tjocklekar på 25 ^ m och högre kan också testas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga upplysningar som skall lämnas.
Acknowledgments
Detta forskningsprojekt stöddes av utmärkelsen Number R21AA017735 (YS) från National Institutes på alkoholmissbruk och alkoholism. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute on alkoholmissbruk och alkoholism eller National Institutes of Health. Författaren vill också tacka Charisse Montgomery för redigering detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations. Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).
- Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).
- Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 202, 465-473 (2012).
- Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation. Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).
- Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide. J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).
- Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).
- Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).
- Sari, Y., Gozes, I. Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein. Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).
- Brenneman, D. E., Gozes, I. A femtomolar-acting neuroprotective peptide. J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).
- Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein. J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).
- Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease. Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).
- Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress. J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).
