Summary
실험 디자인은 태아의 뇌 임신 중 세포 사멸 및 신경성 펩타이드의 응용 프로그램에서 알코올 노출의 효과를 공부에 여기에 초점을 제안했다. 사육에서 태아 뇌의 컬렉션에 대한 자세한 설명이 설명되어 있습니다. 세포 사멸의 결정을위한 기법도 자세히 설명되어 있습니다.
Abstract
태아의 뇌 성장의 초기 배아 단계에서 태아 알코올 노출의 영향을 조사하는 실험 디자인에 도전하고 있습니다. 이 대부분은 태아의 뇌와 알코올 태아 노출로 인한 세포 사멸 세포의 결정에 대한 자신의 절편의 microdissection을의 어려움 때문이다. 실험은 태아의 뇌 조직에있는 세포 죽음의 식별 사육 쥐에서 시각화 기술을 제공합니다 여기에 설명. 본 연구에서는 C57BL 사용 / 알코올에 의한 세포 사멸에 대한 태아 알코올 노출과 영양 펩타이드의 역할을 연구 동물 모델로 6 마우스. 사육 배아 시대의 정확한 단계를 결정하기 위해 2 시간 매트 창으로 구성되어 있습니다. 설립 태아 알코올 노출 모델은 태아의 뇌에있는 태아 알코올 노출의 효과를 결정하기 위해 본 연구에서 사용되었다. 이것은 임신 한 쥐에 대한 영양소의 유일한 소스로 알코올이나 쌍 공급 액체 다이어트에 무료로 액세스를 포함합니다.
apoptosis를 조사를 위해, 태아의 두뇌가 먼저 vibratome 기기와 함께 자신의 절편을 촉진하기 위하여 필 - 멀리 금형을 사용하여 젤라틴에 포함됩니다. 파라 포름 알데히드에 포함 된 고정 태아의 뇌는 쉽게 단면이며, 무료 부동 섹션은 세포 사멸 또는 세포 죽음의 결정에 superfrost 플러스 슬라이드에 장착 할 수 있습니다.
TUNEL (TDT-중재 dUTP 닉 엔드 라벨, TDT : 전이 터미널 deoxynucleotidyl) 분석은 세포 사멸 또는 사멸 세포를 식별하는 데 사용되었습니다. 그것은 주목할만한 그 APoptosis 및 세포 매개 세포 독성은 DNA 파편을 특징으로하고 있습니다. 따라서, 시각 TUNEL 양성 세포는 세포 사멸 또는 세포 사멸 세포의 지표입니다.
여기에 실험 디자인은 태아 두뇌에 임신 중에 알코올의 영향을 연구 설립 액체 다이어트의 사용에 대한 정보와 신경성 펩티드의 역할을 제공합니다. 이 번식 임신 한 쥐를 먹이 태아의 두뇌를 microdissecting 및 세포 사멸을 결정을 포함한다. 함께, 이러한 시각 및 텍스트 기술은 태아 두뇌에 유해한 에이전트의 태아 노출 조사를위한 소스가 될 수 있습니다.
Introduction
여기에 설명 된 실험 방법의 목표는 먹이 microdissecting 및 세포 죽음을 감지, 번식과 관련된 여러 가지 기술을 사용하여 태아 알코올 노출 모델에서 영양 펩타이드의 신경 효과를 평가하는 것입니다. 우리 실험실에서 작업 알코올의 양 기간에 인간 마시는 패러다임과 유사 할 수있는 적당한 음주의 모델로 알코올과 혼합 액체 음식을 포함했다하면 1-5 소비. 우리와 다른 태아 알코올 노출의 해로운 영향으로부터 신경 세 가지 펩타이드 유도체를 발견했습니다. 동물 모델을 사용하여 배아 단계에서 알코올 노출을 조사 연구는 신경 보호의 잠재적 인 메커니즘의 신분으로 이어질 중재 절차의 개발을 허용 할 수 있습니다. 이 임신 중 알코올 노출의 해로운 효과의 신경 효과와 감쇠에 대한 충분한 정보를 제공 할 수 있습니다.
태아 알코올 노출의 영향을 가능한 한 방지 체외 6,7와 in vivo 1,2,4,8,9의 신경 보호에 관여하는 것으로 알려져있다 펩타이드와 임신 한 생쥐의 치료를 포함 할 수 있습니다. 이러한 펩타이드 중, ADNF-9 또는 SAL로 알려진 SALLRSIPA은, 활동에 따라 신경 영양성 인자 (ADNF) 7,10에서 파생됩니다. 순서 NAPVSIPQ 펩티드라고 NAP, 또 다른 펩티드 활동에 따라 신경 단백질 (ADNP) 6,11에서 파생 된 알코올 노출 12,13과 관련된 산화 스트레스에 대한 강력한 보호 효과를 보여 주었다. 또한, 우리는 최근 태아 알코올 노출 모델 2에 중요한 신경 역할을 표시하는 새로운 합성 펩티드, colivelin을 발견했습니다. Colivelin는 ADNF-9 AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP)으로 구성되어 있습니다. 이 펩티드의 사용의 중요성은 그들이 할 수있는 기능을 가지고있다알코올에 의한 세포 사멸과 뇌의 성장 적자의 영향을 방지하기 위해 뇌 혈액 장벽을 통과.
실험 방법은 알콜에 의한 세포 사멸에 대한 신경 보호 효과를 테스트하기 위해 C57BL / 6 생쥐를 사용 하였다. 우리는 그것이 정자 플러그 및 질 세포진 검사 1-5의 검출에 의해 밝혀 질 수 정확하게, 배아 일 0 (E0)를 추정하기 위해 대신 하룻밤 사육 2 시간 창을 채택했다. 우리는이가 임신 한 쥐에 스트레스를 유발할 수 있습니다 투여 경로를 통해 대신 알코올 배송 무료 액세스로 간주되는, 공급 튜브 액체 다이어트를 사용했습니다. 반면에, microdissection을 조기 배아 단계에서 태아의 뇌를 해부 할 때 발생할 수있는 태아 뇌 조직의 부드러움으로 인해 도전 할 수 있습니다. 여기, 우리는 microdissection을 관련된 모든 문제를 처리하는 시각 기술을 보여줍니다. 또한, 태아의 뇌 절편도 도전 할 수 있기 때문에, 우리는 채택젤라틴 포함 껍질 - 멀리하여 금형 태아 두뇌를 포함 포함하는 기술. 우리는 50 μm의 두께로 무료 부동 섹션에서 태아 뇌를 절단에 성공했다. 이것은 우리가 세포 죽음의 식별을 포함하여, 태아의 뇌 섹션에서 콘텐츠 단백질의 변화를 조사 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 동물 사육 및 영양 펩타이드 치료
- 2 시간 동안 남성의 홈 케이지에 암컷 생쥐 (~ 육주 세, 평균 체중 20g)을 배치하여 품종 C57BL/mice.
- 즉시 나중에 정자 플러그 및 / 또는 질 세포진 검사를 확인합니다.
- 긍정적 인 경우, 배아 0 일 (E0)로이 시점을 지정합니다.
- 최근에 설명 된대로 E7에, 제어 및 치료 그룹에 임신 한 암컷 체중 성냥 (3 그룹)가 할당됩니다 4 : 1) 알코올 (에탄올) 액체 다이어트 그룹 (ALC), 2) 쌍 공급 대조군 (PF), 3) 알코올 노출 액체 다이어트 (ALC/ADNF-9)와 함께 ADNF-9 펩타이드의 복강 내 (IP) 주입을 받아야한다 펩타이드 치료 그룹. ALC 및 PF 다이어트의 준비의 세부 사항 및 IP 주사 절차는 우리의 최근 작업 4에서 찾을 수 있습니다.
- 영양의 단독 소스로 무료로 이용하실로 제공 할 수 있습니다 매일 알코올 액체 다이어트를 측정한다. PF 액체 다이어트 개별적 t 멍에O는 ALC 댐뿐만 아니라 매일 측정 할 수 있습니다.
- 이전 24 시간 동안 소비 된 액체 다이어트의 볼륨에서 녹음 할 수 있습니다 30 ML 스크류 캡 튜브를 졸업하고 갓 준비한 다이어트 E7에서 E13까지 (매일)가 제공되어야한다.
2. 태아 및 태아의 두뇌 이외에 Microdissection의 해부
- 깊이 자궁 경부 전위 다음 CO 2 절차에 마우스를 euthanizing으로 E13에서 임신 한 쥐를 희생.
- 70 % 에탄올로 절개 복부 사이트를 청소합니다.
- 멸균 가위와 집게를 사용하여 복부 절개를합니다.
- 복부가 열리면, 한 집게로 잡고 멀리 자궁 mesometrium를 찢어 다른 집게를 사용하여 자궁을 해부. 배아를 펑 쳐링 방지하기 위해 천천히이 절차를 수행해야합니다.
- 자궁에서 배아를 제거하고 행크스 '밸런스드 소금 솔루션을 포함 (60mm X 15mm) 세포 배양 접시에 전송할 (HBSS) 얼음 냉수합니다.
- microdissection을위한 입체 현미경 하에서 전체 배아에서 태아의 뇌를 해부.
- microdissection을위한 초 미세 집게를 사용하여 두개골을 노출 머리의 상단 부분에있는 태아의 피부를 당겨.
- 일단 두개골 노출 명확하게하고 척수와 뇌간 영역에서 뇌의 뒤쪽 부분에서 시작하여 두개골을 벗겨, microdissection을의 실체 현미경 아래에서 시각.
- 머리의 앞쪽 부분에 후방에서 조각에 의한 두개골 조각을 벗겨주십시오.
- 태아의 뇌가 시각적으로 노출되면, 압축을 해제를 진행합니다.
- primordium 후각 망울의 기지에서 metencephalon의 기초에 태아의 뇌를 해부.
- 접미사는 모두 2 ~ 3 일 4 % 파라 포름 알데히드 태아 뇌를 해부. 당신이 서양 얼룩이나 효소 분석을 위해 그들을 테스트하는 경우에는 각 댐에서 다른 태아의 두뇌를 고정 할 수 있습니다.
3. 단면에 대한 젤라틴 태아 두뇌를 포함
- 젤라틴 등급 A의 10 %를 준비
- 중간 껍질 - 멀리 삽입 형을 입력하고 젤라틴 굳은 때까지 기다립니다.
- 응고 된 젤라틴의 상단에 위치 제어 및 태아 치료 태아의 두뇌 나란히. 이 제어 및 실험 그룹 모두 간 세포 죽음의 면역의 일관된 상태를 유지하는 것입니다.
- (젤라틴이 너무 섹시하지 있는지 확인) 완료 형을 만들기 위하여 태아 두뇌의 상단에 젤라틴 액체를 추가합니다.
- 15 분 동안 태아의 뇌를 보유하고 준비된 젤라틴 형 냉장.
- 벗겨다음 임베딩 금형 플라스틱과는 이틀 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 미리 만든 젤라틴을 포함하는 태아의 뇌를 전송합니다.
- 의 장소 섹션은 태아의 뇌를 고정 젤라틴 관상 절편 50 μm의 두께로 vibratome 단면 기계 (라이카 VT 1000S)를 사용. 더 나은 해부학 적 기능을 제공하기 때문에 두께는 우리의 연구에서 테스트됩니다. 또한, 25 ㎛의 두께 이상은 10 % 젤라틴 태아의 두뇌에서 임베디드 관련이 기술을 테스트 할 수 있습니다. 전뇌에서 기저핵 예하 수준에서 vibratome를 사용하여 코로나 섹션이 잘린합니다
- 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액에 태아의 뇌 부분을 수집합니다.
- 물에 Superfrost 플러스 슬라이드에있는 태아의 뇌 부분을 마운트합니다.
- 15 분의 장착 부분을 건조.
- TUNEL 반응의 다음날 테스트를 위해 PBS에 슬라이드 (태아 뇌 부분에 장착)를 배치.
4. 드에 대한 TUNEL 반응세포 죽음 또는 세포 사멸의 방호
(TUNEL : TDT-중재 dUTP 닉 엔드 라벨, TDT : 터미널 deoxynucleotidyl 전이). 이 분석은 세포 죽음을 결정하기위한 것입니다.
- 37 ° C (20 ML PBS에 혼합 단백질 분해 효소 K 300 μL)에서 5 분 단백질 분해 효소 K (20 ㎍ / ㎖)을 Superfrost 플러스 슬라이드에 장착 된 태아의 뇌 부분을 처리합니다. 슬라이드) 5 Plend 열린 애스턴에 조립됩니다.
- 궤도 셰이커에 따라 5 분 PBS 세 번으로 태아의 뇌 섹션 (슬라이드에 장착) 린스.
- 3 % 상온에서 10 분 (3 ML 30 % 27 H 2 O 2 ㎖ 100 % 메탄올) (슬라이드 셰이커에 있으면 안)에 대한 메탄올의 H 2 O 2 섹션을 품어.
- 궤도 셰이커 5 분 동안 PBS 세 번에 섹션을 씻어.
- 얼음에 2 분 (4 ° C) (100 μL TritonX + 0.1 g 나트륨 구연산 + 99.9 ML distille에 대한 permeabilization 솔루션의 섹션 (0.1 % 0.1 % 구연산 나트륨의 TritonX-100)를 품다D 물).
- 궤도 셰이커 5 분 동안 PBS의 섹션을 두 번 헹구십시오.
- 슬라이드의 섹션 주위에 건조한 지역.
- PAP 펜을 사용하여 Superfrost 플러스 슬라이드에 장벽을 그립니다. 이 모든 TUNEL 양성 세포의 검출을위한 섹션을 치료하는 데 사용됩니다 용액의 누출을 방지하기위한 것입니다.
- 37 1 시간에 대한 TUNEL 반응 혼합물 (병 1에서 50 μL 병 2 ~ 450 μL) ° C와 섹션을 품어, 컨트롤이 병 2의 용액에서 배양하여 사용됩니다.
- 궤도 셰이커 아래 PBS 세 번 5 분 씻어.
- 조직의 주위에 건조한 지역.
- 37 30 분 동안 컨버터 POD로 섹션을 품어 ° C.
- 트리스 염산 (산도 7.5, 0.05 M)를 5 분 동안 절을 세 번 씻어.
- 0.05 % 3'-3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) 및 0.003 % H 2 O 2 (25 ML 트리스 염산, pH7.5, 0.05 M + 25 ㎕의 3 % H 2 0 2 + 500의 7 분의 섹션을 품어 μL DAB4)에서 Oribtal 통 아래 ° C (얼음)와 어두운 곳에서 () 새로운 5 Plend 오픈 우편물이 절차를 수행해야합니다.
- 궤도 셰이커 아래 PBS 세 번 5 분으로 섹션을 씻어.
- 다음 섹션 프로토콜에 설명 된대로 Nissl 염색법을 처리 한 후 PBS에서 더 이상 24 이상의 시간 동안 PBS에있는 슬라이드 섹션을 유지합니다.
참고 : DAB는 발암 물질이다. 장갑을 사용하고 모두 한 번 실험을 완료 표백제로 사용되는 모든 요리를 청소합니다.
5. 현미경 관찰을위한 태아 뇌 섹션의 준비를 위해 Nissl 염색
- Nissl 염색 과정은 생물 안전 후드에서 수행되어야한다.
- 2 분 동안 탈 이온수로 슬라이드 부분을 씻어.
- 2 분 70 % 에탄올의 섹션을 품어.
- 6 분 95 % 에탄올에 섹션을 품어.
- 2 분 70 % 에탄올의 섹션을 품어.
- 탈 와트의 섹션을 씻어2 분 동안 어.
- 크레 실 바이올렛의 섹션 3 분 얼룩 품어.
- 2 분 동안 탈 이온수의 섹션을 씻어.
- 2 분 70 % 에탄올의 섹션을 품어.
- 3 분 95 % 에탄올 + 3 ML 빙초산을에 섹션을 품어.
- 2 분 95 % 에탄올에 섹션을 품어.
- 2 분 3 회 100 % 에탄올에 섹션을 품어.
- 10 분 3 회 크실렌의 섹션을 품어.
- 태아의 뇌 부분을 잡고 슬라이드 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 및 커버 슬립 유리 슬라이드를 사용하여 장착 할 수 있습니다.
- 장착 하룻밤 현미경 관찰과 분석을하기 전에 슬라이드 둡니다.
- 현미경 관찰과 현미경 사진은 라이카 직립 현미경으로 수행 할 수 있습니다.
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Representative Results
실험 방법은 2 시간 사육 창 정확한 임신 단계를 추정하는 것이 필수적입니다 것을 보여 여기에 설명. 우리는 E13의 나이에 배아의 절개를 증명하고있다. 우리는 또한 E13에 태아 뇌의 microdissection을을 보여 주었다. 절차는 그림 1에서 설명한 여러 단계 (AC), 포함한다. 태아의 뇌는 primordium 후각 망울의 기지에서 metencephalon의 기초 (그림 1)을 해부한다. 태아의 뇌는 그 면역 탐지를위한 4 % 파라 포름 알데히드로 고정되어 있습니다. 고정 후, 태아의 뇌는 젤라틴 10 %에 포함되어 있으며 그림 2에 설명 된대로 vibratome는 단면을 준비했습니다. 태아 두뇌의 단계별 임베딩이 낮은 배율에서 수행되었다합니다. 내장 된 태아의 뇌는 그림 1의 높은 배율에서 시각화 할 수 있습니다. 또한, 전뇌에 신경절 예하의 수준에서 관상 태아의 뇌 섹션 수vibratome를 사용하여 얻은 면역 검출을위한 슬라이드에 장착 할. 이 TUNEL 양성 세포 (그림 3)의 수를 포함한다. 우리는 태아 알코올 노출이 PF 대조군 (그림 3A)에 비해 신경절 예하의 TUNEL 양성 세포 (그림 3B)의 증가를 유도하는 여기에 표시됩니다. ADNF-9 행정부는 크게 ALC 그룹에 비해 TUNEL 양성 세포 (그림 3C 및 3D) 알코올에 의한 증가를 감소시켰다.
그림 1. E13에 태아 뇌의 microdissection을. 배아 해부 태아의 두뇌 단계 AC 쇼 단계별 절차들.) 해부 제어 (PF)과 알코올 (ALC) 태아 배아를 노출. b)는 C) PF 및 ALC 그룹의 해부 태아의 두뇌.
그림 2. 단면에 대한 태아의 뇌를 포함시키는 방법. 단계 vibratome 절단 개체의 젤라틴 블록의 설정으로 태아 뇌의 임베딩의 준비에서 (AE) 쇼 단계별 절차에 대해 설명합니다.) 가득 필 떨어져 내장 형 중간 젤라틴, B) PF 제어 및 ALC 그룹에서 태아의 뇌가 금형에 나란히 배치되어 젤라틴으로 덮여;) C 필 떨어져 내장 형은 네면을 절단, D) 태아의 뇌에 포함 된 젤라틴 준비 파라 포름 알데히드로 고정한다; E) GE는태아의 뇌를 포함하는 라틴어 형은 vibratome의 절편에 대한 개체에 배치됩니다.
그림 3. PF 그룹 (A)에 비해 ALC 그룹 (B)의 화살촉에 표시된대로 E13 단계에서 신경절 예하의 TUNEL 분석을 사용하여 알코올에 의한 세포 자멸사에 대한 신경성 펩타이드, ADNF-9의 효과. 태아 알코올 노출은 세포 사멸의 증가를 유도. 태아 알코올 노출과 함께 ADNF-9 행정부는 TUNEL 양성 세포 (C)의 감소를 보였다. 통계 분석은 ADNF-9 행정부는 TUNEL 양성 세포 (D) 알코올에 의한 증가를 막을 것을 보여 주었다. 값은 의미 ± SEM으로 표시됩니다. * p <0.05, ** p <0.01 (뉴먼 - Keul의 사후 검사). N 각 그룹 = 4. 스케일 바는 = 100 μm의. 엘의 허가를 발행 (4)에서 재판세비 (라이센스 # 2904310752995).
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Discussion
본 연구에서 제시 한 방법론과 기술은 태아 태아 두뇌에 알코올 노출과 이러한 효과의 예방에 영양 펩티드의 역할의 효과를 보여줍니다. 이들은 다른 임신 단계에서 남용 또는 태아 뇌의 다른 독성 화학 물질의 다른 약물을 연구하는 방법에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다.
사육 패러다임에 관해서, 어떤 경우에는 정자 플러그의 검출은 관찰되지 않을 수 있습니다. 이 시점에서, 그것이 가능한 정자에게 긍정적 인 탐지를 제공 할 수있는 현미경 관찰에서 슬라이드 질 얼룩을 테스트하는 것이 중요합니다.
그것은 수유 PF 제어 및 알코올을 포함하는 액체 다이어트의 자유로운 접근을 포함하는 본 연구에 명시되어 있습니다. 적어도 30 습도의 %와 22-24을 초과하지 않는 온도 ° C 다이어트 1,2를 24 시간 무료로 이용할 중에 다이어트의 품질을 모니터링해야합니다. 또한 요구되는다이어트는 매일 신선한 준비하십시오. 공급 튜브는 사용 후 매번 청소해야합니다.
태아 두뇌의 microdissection을에 어려움이 있습니다. 이러한 테스트 배아 단계에 따라 달라집니다. 예를 들어, E13의 나이에 해부 태아의 뇌는 E18에서 해부 태아의 뇌에 비해 처리하기 어려울 수 있습니다. 이 E18에서, 태아의 두뇌가 잘 발달하고 두개골 두개골은 아직 해내 부드럽고 어려운 E13에 비해 해내 쉽게되어 있다는 사실 때문입니다. 이 시점에서, E13에 태아의 뇌를 해부하면,이 원고와 함께 제공된 비디오에 알 수 있듯이 두개골을 하나씩 해내 것이 중요합니다.
젤라틴 태아 두뇌를 포함에 관해서, 우리는이 면역 분석에 사용할 준비가 부분을 얻을 수있는 가장 좋은 방법입니다 것으로 나타났습니다. 태아 두뇌의 더 나은 절단을 위해, 그것은 중요합니다 그 4 % 파라 포름 알데히드에 고정태아의 뇌를 포함하는 젤라틴 블록이 완료됩니다. 따라서이 최소한 이틀은 더 걸릴 수 있으며, 젤라틴 블록은 셋째 날에 의해 절단에 대 한 준비 될 수 있습니다. 섹션의 두께도 요인, 50 μm의 두께는 일반적으로 TUNEL 분석 1,2,4 등의 면역 검출을위한 테스트합니다. 그러나 25 ㎛의 두께 이상도 테스트 할 수 있습니다.
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Disclosures
어떤 공개가 이루어지지합니다.
Acknowledgments
이 연구 프로젝트는 알코올 남용과 알코올 중독에 국립 연구소에서 보너스 번호 R21AA017735 (YS)에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 알코올 남용 및 알코올 중독이나 건강의 국립 연구소에있는 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 저자는 또한이 원고를 편집 Charisse 몽고메리 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
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