Summary
Fremgangsmåde til isolering af adhærente inflammatoriske leukocytter fra hjernen blodkar
Abstract
Vi beskriver en fremgangsmåde til isolering og karakterisering af adhærente inflammatoriske celler fra hjernen blodkar P. berghei ANKA-inficerede mus. Infektion af modtagelige muse-stammer med denne parasit stamme resulterer i induktion af eksperimentel cerebral malaria, en neurologisk syndrom, der redegør for en række vigtige aspekter af Plasmodium falciparum-medieret alvorlig malaria hos mennesker 1,2. Modne former af blod-stage malaria udtrykker parasitiske proteiner på overfladen af den inficerede erythrocyt, som tillader dem at binde til vaskulære endotelceller. Denne proces inducerer forhindringer i blodstrømmen, hvilket resulterer i hypoxi og blødninger 3 og også stimulerer rekruttering af inflammatoriske leukocytter til stedet for parasitten binding.
I modsætning til andre infektioner, dvs neutrotopic vira 4-6, både malaria-parasitized røde blodlegemer (PRBC) samt tilhørende InflammBAGGRUNDEN leukocytter forbliver sekvestreres i blodkarrene i stedet for at infiltrere hjerneparenkymet. Således at undgå forurening af sekvestrerede leukocytter med ikke-inflammatoriske cirkulerende celler, omfattende intracardial perfusion af inficerede-mus forud for organdonation og væv behandling er påkrævet i denne procedure for at fjerne blod rum. Efter perfusion bliver hjerner høstet og dissekeret i små stykker. Vævsstrukturen yderligere afbrudt ved enzymatisk behandling med collagenase D og DNAse I. Det resulterende hjernehomogenat centrifugeres derefter på en Percoll-gradient, som tillader separation af hjerne-sekvestrerede leukocytter (BSL) fra myelin og andet væv debris. Isolerede celler vaskes derefter, talt under anvendelse af et hæmocytometer og farvet med fluorescerende antistoffer til efterfølgende analyse ved flowcytometri.
Denne procedure muliggør omfattende fænotypisk karakterisering af inflammatoriske leukocytter migrerer til hjernen i respons på forskellige stimuli, herunder slagtilfælde såvel som virale eller parasitiske infektioner. Fremgangsmåden tilvejebringer også et nyttigt værktøj til vurdering af nye antiinflammatoriske behandlinger i prækliniske dyremodeller.
Protocol
1. Infektion af mus med P. berghei-ANKA
- Afrimning en alikvot af kryopræserveret P. berghei ANKA PRBC.
- Fastholde en cerebral malaria-resistent BALB / c donormus (8-12 uger gamle) ved hjælp af begge hænder fastholdelsesanordning teknik. Sprøjt mus med 100-200 ml PRBC anvendelse af en 1 ml insulinsprøjte (28G nål). Rutinemæssigt 1-2 donormus injiceret.
- På dage 4-5 post-infektion (pi) fjerne donor mus fra bur og placere den på en arbejdsstation eller en engangs arbejdsdag pad.
- Forsigtigt begrænse mus ved enden af halen og anvendelse af en lille saks skære halespidsen (ca. 1 mm). Alternativt kan en lille hale punktur under anvendelse af en 25 G nål udføres.
- Anbring en dråbe blod fra musens halevene nær slutningen af en matteret-end objektglas.
- Placer en anden dias (spreder) på en 45 ° vinkel og bakke det ind dråbe blod. Når blodet spreder langs kanten, skub sprederen-slide evenly tværs af mikroskopobjektglasset for at gøre blodudstrygning. Lad smøre at lufttørre.
- Fix blodudstrygninger i 100% methanol i 30 sekunder og derefter farves objektglassene i frisk fremstillet Giemsa i 10 minutter.
- Skyl blodudstrygning med rindende vand i 1 minut, lad det lufttørre og undersøge slide under mikroskop (100x, immersionsolie). Optælle PRBC indenfor 1.000 erytrocytter og beregne procent parasitemia. Donormus bør nå parasitemia niveauer mellem 2.5-5% før de kan blive blødte for infektion af forsøgsdyr.
- Indsamle blod fra donor mus ved retro-orbital blødning under anvendelse af en hepariniseret mikro-hæmatokrit kapillarrør. Alle forsøg udføres i overensstemmelse med Walter & Eliza Hall Institute Animal Ethics Committee krav. Afhængig af lokale Animal Etik udvalgets andre krav blødning procedurer kan anvendes. Opløs nødvendige mængde blod i RPMI-medium ved en slutkoncentration på 1x10 6 pRBC/0.2 ml. Overvej, aten normal mus hæmatokrit er ~ 6x10 ni røde blodlegemer / 1 ml.
- Infect eksperimentelle C57BL / 6 mus (8-12 uger gamle) ved injektion intraperitonealt (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml.
- At overvåge parasitemia niveauer af inficerede mus følge trin 1,3-1,8. Parasitemia bør bestemmes hver 2-3 dage startende på dag 2 eller 3 pi
- Indtræden af alvorlig malaria i C57BL / 6 mus kunne manifestere sig som krum udseende, ruffed pels og lav aktivitet. Nogle mus kan inddrive på nuværende tidspunkt, men progression til tab af selv-opretningsrefleksen indikerer irreversibel sygdom og dyrene skal aflives.
2. Intracardial Perfusion af Mus og Brain Extraction
- Saml en manuel tyngdekraft perfusionssystem ved at fastgøre et 500 ml reservoir til en kolonne holder fastgjort til toppen af en 60 cm kolonne stativ. Forbinde plastrør til den nederste ende af reservoiret og sikre en slangeklemme at styre buffer flow. Fastgøre slangen til en 23 G nål. Fill op reservoiret med PBS (holdt ved 22 ° C), åbne klemmen og tillader buffer at løbe gennem røret for at fjerne alle luftbobler.
- Aflive P. berghei ANKA-inficerede mus ved CO2 inhalation. Bekræft døden ved fravær af pedalen, orbital og respiratoriske reaktioner.
- Pin aflives mus ved de bageste og forreste poter dorsalt på en styrofoam dissektion bord, der er indeholdt i en plastbakke. Afhængig af lokale Animal Etik udvalget krav anæstesi kan administreres før påbegyndelse af intracardial pefusion.
- Tør ventrale side med 70% ethanol.
- Brug store saks og pincet til at åbne huden langs midterlinjen for at blotlægge brysthulen. Fold og pin hud til siderne.
- Hold brystbenet med fine pincet og skære membranen og langs begge sider af brystbenet overskæring ribbenene. Pas på ikke at beskadige nogen store blodkar.
- Pin brystkassen ved brystbenet løst ved siden af hovedet.
- Hold ventrikler with fint pincet og omhyggeligt incise højre atrium med fine saks.
- Indsæt 23G nål fastgjort til tyngdekraften perfusion systemet i venstre ventrikel mod opstigende aorta, mens PBS kører. Indsæt kun 0,5 cm af nålespidsen.
- Perfundere musen i 5 minutter eller indtil effluenten er klart.
- Frigør mus og lægge den på sin mave. Tør hoved med 70% ethanol.
- Ved hjælp af store saks, lave et snit lige over livmoderhalskræft rygmarven område.
- Brug tynde saks til at gøre en median caudal-rostrale snit startende ved bunden af kraniet og skræl huden væk for at blotlægge kraniet.
- Hold hovedet, bladene af en lille saks placere i hver orbital hulrum og lave et snit mellem banerne.
- Lav en langsgående snit langs den sagittale sutur og forsigtigt kraniet på hver hjernehalvdel udad.
- Anvendelse af en spatel, løftes forsigtigt hjernen og anbring det i et 10 ml centrifugeglas indeholdende RPMI-medium.
3. Isolering af Brain-sekvestrerede Leukocytter (BSL)
- Arbejder i et sikkerhedsskab, place friskhøstede hjernen på toppen af en rustfri stål-celle si (40-60 mesh-størrelse) i en petriskål indeholdende 3-5 ml RPMI vævskulturmedium.
- Skær hjernevæv i små stykker.
- Skubbe små stykker hjernevæv gennem cellen sien med en krystal stempel.
- Overførsel hjernehomogenat til et 10 ml rør og centrifugeres ved 250 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Opløs pellet i 3 ml RPMI-medium, indeholdende 0,05% collagenase D og 2U/ml DNAse I.
- Rotere blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjerne cellerester ved at trykke blandingen gennem en 70 um nylon celle filter og / eller ved inkubation på is i 5 min.
- Lay hjernehomogenat på en 7 ml 30% Percoll pude, og der centrifugeres ved 400 x g (ingen bremser) i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender pellet i 1 ml røde blodlegemer lysepuffer og inkuberes på is i 5 min tillyserer klæbende PRBC, som ikke kunne fjernes fra hjernen ved intracardial perfusion.
- Tilsættes 9 ml RPMI-medium, vaske cellerne og centrifugeres ved 250 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender BSL-holdige pellet i 50 til 100 pi RPMI-medium og overføre cellerne til et Eppendorf-rør.
- Fortynd en 5-10 pi alikvot af celleprøven 1:2 i Trypan-blåt til identifikation af levedygtige celler.
- Tælle levedygtige celler under mikroskopet med et hæmocytometer. Fra dag 6 pi frem, da P. berghei ANKA-inficerede mus viser neurologiske tegn, 20,000-100,000 BSLs kan inddrives.
4. Immunophenotyping af BSL vha. multicolour flowcytometri
- Centrifugeres cellerne ved 250 x g i 10 minutter ved 4 ° C, aspireres supernatanten og resuspender pellet i 50 pi farvning buffer (PBS, 1% føtalt kalveserum (FCS), 2 mM EDTA).
- Tilsæt 1 ml af oprenset anti-CD16/32 antistof (Fcblock).
- Cellerne inkuberes i 10 min på is.
- Vask cellerne med 1 ml farvningsbuffer. Centrifugeres cellerne ved 250 x g i 10 minutter ved 4 ° C og sug supernatanten.
- Resuspender cellerne i 50 ul farvningsbuffer indeholdende forudbestemte optimale fortyndinger af påkrævede fluorescerende antistoffer, dvs anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR-og anti-NK1.1.
- Der inkuberes i 1 time på is.
- Vask cellerne med 1 ml farvningsbuffer. Centrifugeres cellerne ved 250 x g i 10 minutter ved 4 ° C og sug supernatanten.
- Resuspender cellerne i 100 pi PBS.
- Overføre cellerne til et flowcytometri plastrør.
- Ved hjælp af et flowcytometer, mindst 5.000-10.000 arrangementer får. Passende ufarvede celle kontroller og fluorochrom kompensation prøver bør medtages efter behov.
- Analysere resultater ved anvendelse af passende flowcytometri software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne i fig. 2 viser procenter og absolutte tal af forskellige BSL populationer udvundet fra hjerner af perfunderede eller unperfused malaria-inficerede og naive kontrolmus. Isoleret BSL blev farvet med PE-anti-NK1.1 og APC-anti-TCR-β-antistoffer er angivet i protokollen teksten. I overensstemmelse med tidligere resultater 7-9, αβTCR + T-celler omfatter en stor del af BSL pool i hjernen hos perfunderede malaria-inficerede mus (dag 6 pi). Denne population syntes at være betydeligt underrepræsenteret i hjernen hos ikke-perfunderede dyr (fig. 2A-B). Den tilsyneladende reduktion af T-celle frekvenser i ikke-perfunderede hjerner var forbundet med en væsentlig højere procentdel og det samlede antal af dobbelt-negative celler (αβTCR - NK1.1 -) i disse dyr (fig. 2A-B). Høj procentdel og numre på dobbelt negative celler i unperfused hjerner var ikke kun påvist i malaria-inficerede mus, men også i na & iuml; ve kontrol, hvilket antyder, at disse celler er ikke-inflammatoriske leukocytter til stede i hjernen blodkar, der er udvundet sammen med inflammatoriske celler, hvis intracardial perfusion ikke udføres.
To yderligere eksempler på BSL analyse er vist i fig. 3 og fig. 4. Kort fortalt blev C57BL / 6 mus inficeret med P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Tidsmæssige sammenhænge mellem leukocytrekruttering til hjernen og påbegyndelsen af neurologiske symptomer (mellem dag 6-8 pi) er blevet påvist i P. berghei ANKA inficerede mus 7-9. I dette særlige eksempel blev malaria-inficerede mus aflivet på dag 6 pi, og BSL blev oprenset som beskrevet i protokollen teksten. Isoleret BSL blev farvet med PE-anti-NK1.1, APC-anti-TCR-β, FITC-anti-CD4 og PerCPCy5.5-anti-CD8a antistoffer. Prøverne blev erhvervet ved hjælp af en BD Biosciences FACSCalibur flowcytometer og den udførte analyse under anvendelse af Weasel 3.0.1 software. Viable celler var gated ved fremad og sidespredning. Procentdelene af NK-celler, T-lymfocytter og NKT-celler (NK1.1 + TCR +-celler) afsondret i hjernen hos naive og malaria-inficerede mus (dag 6 pi) er angivet i de øverste paneler (fig. 3A). De nederste paneler viser procentdele af CD4 + og CD8 + T-lymfocytter blandt gated NK1.1 - αβTCR +-celler (fig. 3A). Fig. 3B viser et eksempel, hvor absolutte antal af CD4 + og CD8 + hjerne-sekvestrerede T-celler blev beregnet på dag 6 pi med P. berghei ANKA. I almindelighed kan 20,000-100,000 BSL udvindes fra hjerner af P. berghei ANKA inficerede mus. Flere faktorer, såsom tid pi, kan modtagelighed af musestamme eller inklusion af anti-inflammatoriske behandlinger påvirke celleindvinding. Rutinemæssigt en enkelt hjerne tilvejebringer nok celler til 1 sæt antistof farvninger.
I eksemplet i Fig.. 4 chemokinreceptor brug af hjerne-sekvestrerede T-lymfocytter blev analyseret. Mus blev inficeret med P. berghei ANKA og BSL blev isoleret på dag 6 pi Celler blev farvet med APC-anti-TCR-β, PE-anti-CXCR3 og biotinyleret-anti-CCR5-antistoffer, efterfulgt af inkubation med et streptavidin-PerCPCy5.5 konjugat. Prøver blev erhvervet og analyseret iht. Fig. 3. Histogrammerne repræsenterer procentdele αβTCR +-celler blandt total BSL i malaria-inficerede og naive kontrolmus. De kontur parceller i det midterste og nederste paneler viser de procentdele af CXCR3 + og CCR5 + celler inden gated αβTCR +-celler.
Fig. 1. Rutediagram over fremgangsmåden til isolering og analyse af BSLfra P. berghei ANKA-inficerede mus. (1) En cryopreseved prøve af P. berghei ANKA PRBC afrimes og 1 eller 2 donormus er smittet. (2) Fire dage senere parsitemia niveauer af donormus beregnes, donormus er afblødte og blod fortyndinger udarbejdet til infektion af eksperimentelle mus. En malaria infektion er så oprettet i alvorlig malaria-følsomme C57BL / 6 mus. (3) På dage 5-7 pi, musene aflivet ved CO2 inhalation, og umiddelbart intracardially perfunderet at fjerne alle cirkulerende ikke-adhærente celler. (4) Brains høstes dernæst og et hjernehomogenat fremstillet ved fordøjelse af væv med collagenase D og DNAse I. BSL separeres derefter fra myelin og cellerester ved en Percoll-gradient. (5) Udfældet BSL vaskes derefter, talt under anvendelse af et hæmocytometer, farvet med fluorescerende antistoffer og analyseret ved flowcytometri.
Figur 2. BSL analyse i hjernen hos perfunderede eller unperfused mus. C57BL / 6 mus blev inficeret med P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Hjerner blev høstet på dag 6 pi fra perfunderede eller unperfused dyr. The BSL blev isoleret, farvet med anti-NK1.1-og anti-TCR fluorescerende antistoffer og analyseret ved flowcytometri. (A) Dot plots viser procenter af NK-celler, T-lymfocytter, NK1.1 + TCR + celler og dobbelte negative celler NK1.1 - TCR - i perfunderede (toppaneler) eller unperfused (bundfelter) malaria-inficerede og naive kontrolmus . (B) Det absolutte antal af dobbelt-negative celler og T-lymfocytter og blev beregnet på dag 6 pi med P. berghei ANKA og naive kontrolmus. Hver bar represents middelværdien af 3 prøver ± SEM, * p> 0,05.
Figur 3. NK-celler og T-lymfocytter kan påvises i hjernen hos P. berghei ANKA inficerede mus. C57BL / 6 mus blev inficeret med P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Hjerner blev ekstraheret på dag 6 pi efter perfusion af de aflivet dyr. The BSL blev isoleret, farvet med anti-NK1.1, anti-TCR, anti-CD4 og anti-CD8 fluorescerende antistoffer og analyseret ved flowcytometri. (A) Top paneler afbilder procenter af NK-celler, T-lymfocytter og NK1.1 + TCR +-celler i malaria-inficerede og naive kontrolmus. Bundpanelerne viser procentdele af CD4 + og CD8 + T-celler inden gated αβTCR + NK1.1 - (B) Det absolutte antal af hjerne-sekvestrerede CD4 + og CD8 + T-celler blev beregnet på dag 6 pi med P. berghei ANKA og naive kontrolmus. Hver søjle repræsenterer middelværdien af 3 prøver ± SEM.
Figur 4. Størstedelen af T-lymfocytter migrerer til hjernen som reaktion på svær malariainfektion udtrykker chemokine receptor CXCR3. C57BL / 6 mus blev inficeret med P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Hjerner blev ekstraheret på dag 6 pi efter omfattende perfusion af de aflivet dyr. The BSL blev isoleret, farvet med anti-TCR, anti-CXCR3 og anti-CCR5-antistoffer og analyseret ved flowcytometri. Toppaneler afbilder procenter af αβT lymfocytter i malaria-inficerede og naive kontrolmus. Konturen plots illustrerer procenter af CXCR3 + (midterste paneler) og CCR5 + (nederste panel) celler i gatede αβTCR +-lymfocytter.
| Problem | Fejlfinding |
| Ufuldstændig perfusion |
|
| Ikke nok BSL genvundet |
|
Tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isoleringen og analyse af BSL er en fremgangsmåde, som muliggør karakterisering og kvantificering af inflammatoriske celler migrerer til hjernen som reaktion på vævsbeskadigelse eller infektion i eksperimentelle musemodeller. Indførelsen af en intracardial perfusion trin til fjernelse af blodfordelingsrummet før organ-ekstraktion og efterfølgende celleisolering er nyttig for at forhindre forurening af inflammatoriske celler med ikke-inflammatoriske cirkulerende leukocytter. Dette er måske ikke et væsentligt krav i neurotrofiske infektioner, såsom murine encephalomyelitis virus, hvori inflammatoriske celler trænger ind i hjerneparenkymet 5, men er særligt relevant i gnaver malaria, ved hvilken inficerede erythrocytter og inflammatoriske leukocytter forbliver sekvestreres i blodkarrene og ikke infiltrerende hjernevæv . Følgelig bør intracardial perfusion af malaria-inficerede mus, der ikke kun anbefales til analyse af BSL men kunne også være nyttige tilvurdering af parasit-væv binding 10,11. Svarende til ikke-inflammatoriske cirkulerende leukocytter, umodne former af malariaparasitter kan ikke klæbe til det vaskulære endotel, og bør fjernes ved perfusion procedure. I modsætning hertil synes adhærerende PRBC (modne schizonts) at forblive inden for hjernens blodkar. P. berghei Anka transgene parasitter udtrykker luciferase er blevet genereret 12 og er en værdifuld ressource for denne type analyse. Efter infektion med luciferase-udtrykkende linjer, kan parasit væv-binding bestemmes ved billeddannelse af perfunderede hjerner fra inficerede dyr ved hjælp af en IVIS-system 10,11. En direkte sammenligning af parasit-afsondring på dag 6-7 pi i hjernen hos perfunderede dyr og hjerner fra mus inficeret med fase-specifikke reporter parasitter (dvs. udtrykker luciferase kun under schizont fase) ville være nyttig til yderligere validering af denne fremgangsmåde.
Onevigtig ulempe ved traditionelle histologiske fremgangsmåder til analyse af vævs-infiltrerende celler er, at disse teknikker ikke tillader vurdering af cellepopulationer, der kræver anerkendelse af mere end én celle markør for identifikation (dvs. NK1.1 + αβTCR + CD1d-begrænsede NKT eller CD4 + foxp3 + T regulatoriske celler). I modsætning til histologi, er flowcytometrisk analyse af inflammatoriske leukocytter modtagelige for flere antistofprodukter farvninger, giver et meget nyttigt værktøj for omfattende fænotypisk karakterisering af cellulære infiltrater 7,9,13. Desuden er denne metode følsom nok til at påvise cellepopulationer, der forekommer ved frekvenser så lave som 1-3% af den samlede intravaskulære infiltrat, herunder ikke blot endogene men også adoptivt overførte celler og antigenspecifikke T-celler. P. berghei Anka transgene parasitter, der udtrykker MHC I og MHC II-begrænsede epitoper fra OVA 14 + CD8 + T-celler fra OT-I-mus kunne påvises blandt BSL af Ly5.2 + C57BL / 6 PbTG-inficerede mus, som godtgør, inflammatoriske T-celler migrerer til hjernen i reaktion på malaria er parasit-specifikke 14.
Analysen af BSL er også nyttigt at vurdere potentialet af hidtil ukendte anti-inflammatoriske behandlinger i prækliniske dyremodeller. For eksempel har kapaciteten af monoklonale antistoffer mod CXCR3 chemokine IFN-γ-inducerbart protein 10 (IP-10) for at forhindre hjernen intravaskulær infiltration og lindre sygdomssymptomer forbundet med alvorlig malaria blevet demonstreret ved hjælp af dennemetode 11.
En begrænsning, at denne metode kan have, er, at det totale antal celler genvundet fra et individ hjernen er generelt tilstrækkeligt for et sæt antistof farvninger. Således separate forsøg kan være nødvendigt, hvis mere end 4-6 cellemarkører er nødvendige for analysen. Generelt er proceduren let at udføre. Det eneste skridt, der kan kræve en vis grunduddannelse er det intracardial perfusion. Et par hints, der kan være nyttige til at overvinde potentielle problemer, er anført i tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Miss Liana Mackiewicz til teknisk bistand. Dette arbejde blev gjort mulig gennem Victorian delstatsniveau operationelle infrastruktur Support og australske regering National Health og Medical Research Council IRIISS og Project Grant 1.031.212.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
