Summary
मस्तिष्क की रक्त वाहिकाओं से पक्षपाती भड़काऊ leukocytes के अलगाव के लिए एक विधि
Abstract
हम अलगाव और पी. के मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं से पक्षपाती भड़काऊ कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के लिए एक विधि का वर्णन berghei ANKA संक्रमित चूहों. प्रयोगात्मक मस्तिष्क मलेरिया की प्रेरण, एक neurologic सिंड्रोम में इस परजीवी तनाव परिणामों के साथ अतिसंवेदनशील माउस उपभेदों के संक्रमण recapitulates प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम की मध्यस्थता मनुष्य के 1,2 में गंभीर मलेरिया के कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं कि. परिपक्व रक्त चरण मलेरिया की रूपों संक्रमित एरिथ्रोसाइट, जो उन्हें संवहनी endothelial कोशिकाओं को बाध्य करने के लिए अनुमति देता है की सतह पर परजीवी प्रोटीन व्यक्त करते हैं. इस प्रक्रिया में रक्त के प्रवाह में अवरोधों लाती है, जिसके परिणामस्वरूप hypoxia और 3 haemorrhages में और भी परजीवी ज़ब्ती की साइट पर भड़काऊ leukocytes की भर्ती को बढ़ावा देने.
अन्य संक्रमण, यानी neutrotopic 4-6 वायरस के विपरीत, दोनों मलेरिया parasitized लाल रक्त कोशिकाओं (pRBC) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जुड़े inflammatory leukocytes रक्त वाहिकाओं के बजाय भीतर मस्तिष्क पैरेन्काइमा घुसपैठ से तनहा रहते हैं. इस प्रकार की गैर भड़काऊ परिसंचारी कोशिकाओं, संक्रमित चूहों के व्यापक intracardial छिड़काव अंग निष्कर्षण और ऊतक प्रसंस्करण के लिए पहले के साथ तनहा leukocytes के संक्रमण से बचने के लिए इस प्रक्रिया में रक्त डिब्बे को हटाने की आवश्यकता है. छिड़काव के बाद, दिमाग और खेती कर रहे हैं और छोटे - छोटे टुकड़ों में dissected. ऊतक संरचना Collagenase विकास और DNase मैं के साथ enzymatic उपचार से बाधित है जिसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क homogenate तो एक Percoll ढाल है कि मस्तिष्क तनहा leukocytes की myelin और अन्य ऊतकों मलबे से जुदाई (BSL) की अनुमति देता है पर centrifuged है. पृथक कोशिकाओं को फिर धोया जाता है, प्रवाह cytometry द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए एक और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ hemocytometer दाग गिनती का उपयोग.
इस प्रक्रिया भड़काऊ leukocytes के व्यापक प्ररूपी लक्षण वर्णन पुनः में दिमाग की ओर पलायन करने की अनुमति देता हैस्ट्रोक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वायरल या परजीवी के संक्रमण सहित विभिन्न stimuli, sponse. विधि भी पूर्व नैदानिक पशु मॉडल में उपन्यास विरोधी भड़काऊ उपचार के मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है.
Protocol
1. पी. के साथ चूहों के संक्रमण berghei-anka
- Cryopreserved पी. का एक अशेष भाजक Defrost berghei ANKA pRBC.
- एक मस्तिष्क मलेरिया प्रतिरोधी BALB / ग दाता (8-12 सप्ताह पुराने) माउस संयम दो हाथ तकनीक का उपयोग सीमित रखें. PRBC की 100-200 μl 1 मिलीग्राम इंसुलिन सिरिंज (सुई 28G) का उपयोग के साथ माउस इंजेक्षन. नियमित, 1-2 दाता चूहों अंतःक्षिप्त रहे हैं.
- संक्रमण के बाद 4-5 दिनों (pi) पर पिंजरे से दाता माउस को हटाने और एक कार्य केंद्र या एक डिस्पोजेबल काम पैड पर यह जगह.
- धीरे पूंछ के अंत तक माउस नियंत्रित करना और छोटे कैंची का प्रयोग पूंछ टिप में कटौती (लगभग 1 मिमी). वैकल्पिक रूप से, एक छोटी पूंछ पंचर एक 25 जी सुई का उपयोग किया जा सकता है.
- पाले सेओढ़ लिया के अंत में एक खुर्दबीन स्लाइड के अंत के पास माउस पूंछ नस से खून की एक बूंद रखें.
- एक 45 डिग्री कोण पर एक दूसरे स्लाइड (स्प्रेडर) प्लेस और यह खून की बूंद में वापस. एक बार खून की बढ़त के साथ फैलता है, पूर्व संध्या स्प्रेडर स्लाइड धक्काखुर्दबीन स्लाइड भर में रक्त धब्बा बनाने nly. धब्बा शुष्क हवा करने की अनुमति दें.
- 30 सेकंड के लिए 100% मेथनॉल में रक्त स्मीयर ठीक है और फिर 10 मिनट के लिए हौसले से तैयार Giemsa में स्लाइड दाग.
- 1 मिनट के लिए पानी के साथ चल रहे ब्लड स्मीयर कुल्ला, हवा शुष्क और माइक्रोस्कोप (100x, तेल विसर्जन) के तहत स्लाइड की जांच करने के लिए अनुमति देते हैं. 1000 एरिथ्रोसाइट्स के भीतर pRBC की गणना करें और प्रतिशत पेरासाइटिमिया की गणना. दाता चूहों 2.5-5% के बीच पेरासाइटिमिया स्तर तक पहुँचने से पहले वे प्रायोगिक पशुओं के संक्रमण के लिए लहूलुहान किया जा सकता है चाहिए.
- दाता माउस से रेट्रो कक्षीय एक heparinized सूक्ष्म hematocrit केशिका ट्यूब का उपयोग खून बह रहा खून ले लीजिए. सभी प्रयोगों के अनुपालन में वाल्टर और एलिजा हॉल संस्थान पशु आचार समिति आवश्यकताओं के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. स्थानीय पशु नैतिक समिति आवश्यकताओं के आधार पर अन्य खून बह प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है. 1x10 6 pRBC/0.2 मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता में RPMI मध्यम में रक्त के लिए आवश्यक राशि को भंग. उस पर विचारएक सामान्य माउस hematocrit ~ 6x10 9 लाल रक्त कोशिकाओं / 1 मिलीलीटर है.
- Intraperitoneally (आईपी) मिलीलीटर 6 pRBC/0.2 1x10 इंजेक्शन द्वारा प्रयोगात्मक C57BL / 6 चूहों (8-12 सप्ताह पुराना) को संक्रमित.
- संक्रमित चूहों की पेरासाइटिमिया के स्तर की निगरानी 1.3-1.8 चरणों का पालन करें. पेरासाइटिमिया हर 2-3 दिन निर्धारित किया जाना चाहिए 2 या 3 दिन बगुलाभगत पर शुरू
- गंभीर मलेरिया के C57BL / 6 चूहों hunched उपस्थिति के रूप में हो सकता है प्रकट शुरुआत, के फर और कम गतिविधि कंठीदार. कुछ चूहों में इस स्तर पर ठीक हो सकते हैं, लेकिन स्वयं को ठीक पलटा के नुकसान के लिए प्रगति अपरिवर्तनीय रोग का संकेत है और जानवरों euthanized किया जाना चाहिए.
2. चूहे और मस्तिष्क निष्कर्षण के Intracardial परफ्यूज़न
- एक स्तंभ धारक एक 60 सेमी स्तंभ स्टैंड के ऊपर करने के लिए संलग्न करने के लिए एक 500 मिलीलीटर जलाशय हासिल करके इकट्ठा एक पुस्तिका गुरुत्वाकर्षण छिड़काव प्रणाली. जलाशय के नीचे अंत करने के लिए प्लास्टिक टयूबिंग कनेक्ट और बफर प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए एक टयूबिंग क्लैंप सुरक्षित. एक 23 जी सुई टयूबिंग संलग्न. Filपीबीएस (22 डिग्री सेल्सियस पर रखा है) के साथ जलाशय ऊपर एल, दबाना और बफर की अनुमति देने के लिए टयूबिंग के माध्यम से चलाने के लिए सभी हवाई बुलबुले को दूर खुला.
- Euthanize पी. सीओ 2 साँस लेना द्वारा berghei Anka संक्रमित माउस. पेडल, कक्षीय और सांस की प्रतिक्रियाओं के अभाव से मौत की पुष्टि.
- एक स्टायरोफोम विच्छेदन बोर्ड पर एक प्लास्टिक की ट्रे में निहित पृष्ठीय हिंद और सामने पंजे द्वारा euthanized माउस पिन. स्थानीय पशु नैतिक समिति आवश्यकताओं संज्ञाहरण पर निर्भर करता है intracardial pefusion की पूर्व प्रारंभ प्रशासित किया जा सकता है.
- 70% इथेनॉल के साथ उदर पक्ष साफ कर लें.
- Midline साथ त्वचा को खोलने के लिए वक्ष गुहा का पर्दाफाश बड़ी कैंची और संदंश का प्रयोग. मोड़ो और पिन पक्षों को त्वचा.
- ठीक संदंश के साथ उरोस्थि पकड़ो और डायाफ्राम कटौती और उरोस्थि के दोनों पक्षों के साथ पसलियों विच्छेद. देखभाल करने के लिए किसी भी बड़े रक्त वाहिकाओं को नुकसान नहीं है.
- शिथिल सिर के बगल में उरोस्थि द्वारा रिब पिंजरे पिन.
- Ventricles बुद्धि पकड़ोज ठीक संदंश और ध्यान से काटकर अलग कर देना ठीक कैंची साथ सही atrium.
- 23g बाएं वेंट्रिकल में आरोही महाधमनी की ओर गुरुत्वाकर्षण छिड़काव प्रणाली जबकि पीबीएस चल रहा है संलग्न सुई डालें. सुई टिप के केवल 0.5 सेमी डालें.
- 5 मिनट के लिए या जब तक प्रवाह माउस छिड़कना स्पष्ट है.
- अनपिन माउस और वह अपने पेट पर रखना. 70% इथेनॉल के साथ सिर को अच्छे से साफ करें.
- बड़ी कैंची का प्रयोग, ग्रीवा रीढ़ की हड्डी क्षेत्र के ऊपर एक कट.
- ठीक कैंची का उपयोग करने के लिए एक औसत कट दुम का - व्याख्यान चबूतरे वाला खोपड़ी के आधार पर शुरू करने और त्वचा छील दूर खोपड़ी बेनकाब.
- सिर होल्डिंग, प्रत्येक कक्षीय गुहा में एक छोटी सी कैंची की ब्लेड जगह और कक्षाओं के बीच स्थित एक कट.
- बाण के समान सीवन के साथ एक अनुदैर्ध्य काट बनाओ और ध्यान से प्रत्येक मस्तिष्क गोलार्द्ध पर जावक खोपड़ी छील.
- एक रंग का प्रयोग, धीरे मस्तिष्क उठा और यह एक 10 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र RPMI मध्यम युक्त ट्यूब में जगह.
3. ब्रेन - तनहा Leukocytes का अलगाव (बीएसएल)
- एक सुरक्षा कैबिनेट में कार्य करना, जगह ताजा RPMI टिशू कल्चर माध्यम के 3-5 मिलीलीटर युक्त एक पेट्री डिश में स्टेनलेस स्टील सेल झरनी (40-60 जाल आकार) के शीर्ष पर मस्तिष्क काटा.
- मस्तिष्क के ऊतकों को छोटे - छोटे टुकड़ों में काटें.
- सेल एक क्रिस्टल सवार का उपयोग झरनी के माध्यम से मस्तिष्क के ऊतकों के छोटे टुकड़े पुश.
- एक 10 मिलीग्राम और 250 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए मस्तिष्क homogenate स्थानांतरण
- RPMI मध्यम के 3 मिलीलीटर में गोली भंग, 0.05% Collagenase डी और 2U/ml DNase मैं युक्त
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिश्रण घुमाएँ. के माध्यम से मिश्रण धक्का द्वारा एक 70 सुक्ष्ममापी नायलॉन सेल झरनी और / या 5 मिनट के लिए बर्फ पर incubating सेल मलबे निकालें.
- एक 7 मिलीलीटर 30% Percoll और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 400 XG (कोई ब्रेक) पर गद्दी अपकेंद्रित्र पर मस्तिष्क homogenate लेटाओ.
- 5 मिनट के लिए बर्फ पर लाल रक्त सेल और बफर सेते के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspendlyse पक्षपाती pRBC, जो मस्तिष्क से intracardial छिड़काव द्वारा नहीं हटाया जा सकता है.
- RPMI मध्यम 9 मिलीलीटर जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 250 XG पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र धो लो
- RPMI मध्यम और एक Eppendorf ट्यूब को हस्तांतरण कोशिकाओं के 50-100 μl में Resuspend गोली BSL युक्त.
- सेल का एक नमूना 5-10 μl अशेष भाजक 01:02 व्यवहार्य कोशिकाओं की पहचान के लिए Trypan नीले रंग में पतला.
- व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना एक hemocytometer का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे. दिन 6 pi के बाद से, जब पी. berghei ANKA संक्रमित चूहों न्यूरोलॉजिकल संकेत प्रदर्शित 20,000-100,000 BSLs बरामद किया जा सकता.
4. Multicolour फ्लो का बीएसएल Immunophenotyping
- 250 XG में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट में के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, धुंधला बफर के 50 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली aspirate (पीबीएस, 1% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 2 मिमी EDTA).
- शुद्ध anti-CD16/32 प्रतिरक्षी (Fcblock) की 1 μl जोड़ें.
- 1 के लिए कोशिकाओं सेतेबर्फ पर 0 मिनट.
- धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 250 XG पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र तैरनेवाला aspirate.
- बफर धुंधला हो जाना आवश्यक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के पूर्व निर्धारित इष्टतम dilutions, यानी विरोधी CD4, विरोधी CD8, विरोधी TCR और विरोधी NK1.1 युक्त की 50 μl में Resuspend कोशिकाओं.
- बर्फ पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 250 XG पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र तैरनेवाला aspirate.
- पीबीएस के 100 μl में कोशिकाओं Resuspend.
- एक प्रवाह cytometry प्लास्टिक ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण.
- एक प्रवाह cytometer का उपयोग करना है, कम से कम 5,000-10,000 घटनाओं हासिल. उपयुक्त अस्थिर सेल नियंत्रण और fluorochrome मुआवजा के नमूने की आवश्यकता के रूप में शामिल किया जाना चाहिए.
- उचित प्रवाह cytometry सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणाम का विश्लेषण.
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Representative Results
छवि में परिणाम है. 2 शो प्रतिशत और अलग BSL perfused या unperfused मलेरिया संक्रमित और भोले नियंत्रण चूहों के दिमाग से बरामद आबादी की निरपेक्ष संख्या. पृथक BSL पीई विरोधी NK1.1 और APC विरोधी TCR β एंटीबॉडी के साथ दाग थे प्रोटोकॉल पाठ के रूप में संकेत दिया है. लगातार पिछले 7-9 निष्कर्षों के साथ, αβTCR + टी कोशिकाओं perfused मलेरिया से संक्रमित चूहों (6 दिन pi) के दिमाग में बीएसएल पूल की एक उच्च अनुपात शामिल थे. इस आबादी के लिए काफी गैर perfused जानवरों के दिमाग में underrepresented (छवि 2A-B) दिखाई दिया. इन जानवरों में (छवि 2A-B) गैर perfused दिमाग में टी सेल आवृत्तियों की स्पष्ट कमी एक काफी उच्च प्रतिशत और डबल नकारात्मक कोशिकाओं की कुल संख्या (- NK1.1 αβTCR) के साथ जुड़े थे. उच्च और unperfused दिमाग में डबल नकारात्मक कोशिकाओं पर प्रतिशत संख्या ही पता लेकिन यह भी ना और आइयू में मलेरिया से संक्रमित चूहों में नहीं थेमिलीलीटर, ve नियंत्रण, सुझाव है कि इन कोशिकाओं को गैर भड़काऊ है कि एक साथ भड़काऊ कोशिकाओं के साथ बरामद कर रहे हैं अगर intracardial छिड़काव नहीं किया जाता है मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं में मौजूद leukocytes हैं.
BSL विश्लेषण के आगे के दो उदाहरण छवि में दिखाए जाते हैं. 3 और अंजीर. 4. संक्षेप में, C57BL / 6 चूहों पी. से संक्रमित थे berghei Anka (1x10 pRBC 6). मस्तिष्क के लिए ल्युकोसैट भर्ती और स्नायविक लक्षण (pi के बीच 6-8 दिन) की शुरुआत के बीच अस्थायी संघों पी. में प्रदर्शित किया गया berghei ANKA 7-9 संक्रमित चूहों. इस विशिष्ट उदाहरण में, मलेरिया संक्रमित चूहों 6 दिन pi पर euthanized किया गया है, और प्रोटोकॉल पाठ के रूप में वर्णित BSL शुद्ध थे. पृथक BSL पीई विरोधी NK1.1, APC विरोधी TCR β, FITC विरोधी CD4 और PerCPCy5.5 विरोधी CD8α एंटीबॉडी के साथ दाग थे. नमूने एक बी.डी. बायोसाइंसेज FACSCalibur प्रवाह cytometer और प्रदर्शन विश्लेषण नेवला 3.0.1 सॉफ्टवेयर का उपयोग का उपयोग कर हासिल किया गया. के माध्यम सेble कोशिकाओं को आगे और पक्ष तितर बितर द्वारा gated थे. एन.के. कोशिकाओं, टी lymphocytes और NKT कोशिकाओं (NK1.1 + TCR कोशिकाओं +) का प्रतिशत भोले और मलेरिया से संक्रमित चूहों (6 दिन बगुलाभगत) के मस्तिष्क में तनहा शीर्ष पैनल (छवि 3 ए) में संकेत कर रहे हैं. नीचे पैनलों CD4 का प्रतिशत बताते हैं + और gated NK1.1 बीच CD8 + टी lymphocytes αβTCR + कोशिकाओं (छवि 3 ए). अंजीर. 3B एक उदाहरण है जिसमें + CD4 और CD8 + मस्तिष्क तनहा टी कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या 6 दिन pi पर पी. के साथ गणना की गई दर्शाया गया है berghei ANKA. सामान्य में, 20,000-100,000 BSL पी. के दिमाग से बरामद किया जा सकता है berghei ANKA संक्रमित चूहों. समय बगुलाभगत जैसे कई कारकों, माउस तनाव या विरोधी भड़काऊ उपचार के शामिल किए जाने की संवेदनशीलता सेल वसूली प्रभावित हो सकता है. नियमित, एक व्यक्ति के मस्तिष्क एंटीबॉडी stainings की 1 सेट के लिए पर्याप्त कक्षों प्रदान करता है.
फाई में दिए गए उदाहरण मेंजी. मस्तिष्क तनहा टी lymphocytes 4 केमोकाइन रिसेप्टर के उपयोग का विश्लेषण किया गया. चूहे पी. से संक्रमित किया गया berghei ANKA और BSL अलग थे दिन पर 6 pi कोशिकाओं APC-विरोधी TCR β, पीई विरोधी CXCR3 और CCR5-biotinylated विरोधी एंटीबॉडी, एक streptavidin PerCPCy5.5 संयुग्म साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा के साथ दाग थे. नमूने का अधिग्रहण किया गया छवि प्रति के रूप में विश्लेषण किया. 3. histograms मलेरिया संक्रमित और भोले नियंत्रण चूहों में कुल BSL बीच αβTCR + कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं. मध्यम और नीचे पैनलों में समोच्च भूखंडों CXCR3 के प्रतिशत और CCR5 कोशिकाओं gated αβTCR भीतर + + कोशिकाओं दिखाते हैं.
चित्रा 1 बीएसएल अलगाव और विश्लेषण के लिए प्रक्रिया का प्रवाह चार्टपी. से berghei ANKA संक्रमित चूहों. (1) पी. के cryopreseved अशेष भाजक berghei ANKA pRBC defrosted और 1 या 2 दाता चूहों संक्रमित हैं. (2) दाता चूहों के चार दिन बाद parsitemia स्तर की गणना कर रहे हैं, दाता चूहों लहूलुहान और रक्त प्रयोगात्मक चूहों के संक्रमण के लिए तैयार dilutions कर रहे हैं. एक मलेरिया संक्रमण तो गंभीर मलेरिया अतिसंवेदनशील C57BL / 6 चूहों में स्थापित है. (3) दिन 5-7 बगुलाभगत में चूहों सीओ 2 साँस लेना द्वारा euthanized हैं और तुरंत intracardially सभी परिसंचारी गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने perfused. (4) दिमाग तो काटा जाता है और एक मस्तिष्क Collagenase विकास और DNase मैं BSL के साथ ऊतक के पाचन द्वारा तैयार homogenate तो एक Percoll ढाल द्वारा myelin और सेल मलबे से अलग कर रहे हैं. (5) BSL उपजी रहे हैं तो धोया, hemocytometer, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग और प्रवाह cytometry से विश्लेषण गिनती का उपयोग.
चित्रा 2 perfused या unperfused चूहों के दिमाग में बीएसएल विश्लेषण. C57BL / 6 चूहों पी. से संक्रमित थे berghei Anka (1x10 pRBC 6). दिमाग दिन perfused या unperfused जानवरों से 6 pi पर काटा गया. BSL अलग थे, विरोधी NK1.1 और विरोधी TCR फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग और प्रवाह cytometry से विश्लेषण. TCR - (ए) डॉट भूखंडों एन.के. कोशिकाओं, टी lymphocytes, + TCR + NK1.1 कोशिकाओं और डबल नकारात्मक कोशिकाओं NK1.1 के प्रतिशत को दर्शाती perfused (शीर्ष पैनल) या unperfused (नीचे पैनलों) मलेरिया संक्रमित और भोले चूहों पर नियंत्रण . (बी) डबल नकारात्मक कोशिकाओं और टी lymphocytes की निरपेक्ष संख्या और पी. के साथ 6 दिन pi पर गणना की गई berghei ANKA और भोले नियंत्रण चूहों. प्रत्येक बार represe3 नमूने का माध्य एनटीएस ± SEM, * p> 0.05.
चित्रा 3 एन.के. कोशिकाओं और टी lymphocytes पी. के दिमाग में पाया जा सकता है berghei ANKA संक्रमित चूहों. C57BL / 6 चूहों पी. से संक्रमित थे berghei Anka (1x10 pRBC 6). दिमाग दिन 6 pi पर euthanized जानवरों के छिड़काव के बाद निकाले गए थे. BSL अलग थे, विरोधी NK1.1, विरोधी TCR, विरोधी CD4 और विरोधी CD8 फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग और प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया. (ए) शीर्ष पैनल एन.के. कोशिकाओं, टी lymphocytes और मलेरिया से संक्रमित और भोले नियंत्रण चूहों में NK1.1 TCR + कोशिकाओं के प्रतिशत को दर्शाती है. नीचे पैनलों CD4 + और gated αβTCR के भीतर CD8 + टी कोशिकाओं NK1.1 + प्रतिशत दर्शाते हैं - (बी) मस्तिष्क की निरपेक्ष संख्या तनहा CD4 + और CD8 + टी कोशिकाओं 6 दिन pi पर पी. के साथ गणना की गई berghei ANKA और भोले नियंत्रण चूहों. प्रत्येक बार 3 नमूने ± SEM मतलब का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 4 टी गंभीर मलेरिया संक्रमण के जवाब में मस्तिष्क के लिए पलायन लिम्फोसाइटों के बहुमत केमोकाइन CXCR3 रिसेप्टर व्यक्त. C57BL / 6 चूहों पी. से संक्रमित थे berghei Anka (1x10 pRBC 6). दिमाग दिन euthanized जानवरों के व्यापक छिड़काव के बाद 6 pi पर निकाले गए थे. BSL अलग थे, विरोधी TCR, विरोधी CXCR3 और विरोधी CCR5 एंटीबॉडी के साथ दाग और प्रवाह cytometry से विश्लेषण. शीर्ष पैनलों α के प्रतिशत को दर्शातीमलेरिया से संक्रमित और भोले नियंत्रण चूहों में βT लिम्फोसाइटों. समोच्च भूखंडों CXCR3 + (मध्य पैनलों) और + CCR5 (नीचे के पैनल) gated αβTCR + लिम्फोसाइटों के भीतर कोशिकाओं के प्रतिशत वर्णन.
| समस्या | समस्या निवारण |
| अधूरा छिड़काव |
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| BSL पर्याप्त नहीं बरामद |
|
तालिका 1.
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Discussion
बीएसएल अलगाव और विश्लेषण एक तरीका है कि लक्षण वर्णन और सूजन ऊतक या प्रयोगात्मक माउस मॉडल में चोट संक्रमण जवाब में मस्तिष्क के लिए पलायन कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. अंग निष्कर्षण और बाद में सेल अलगाव से पहले रक्त डिब्बे को हटाने के लिए एक intracardial छिड़काव कदम की शुरूआत गैर भड़काऊ परिसंचारी leukocytes के साथ भड़काऊ कोशिकाओं के प्रदूषण को रोकने के लिए उपयोगी है. यह murine encephalomyelitis वायरस के रूप में इस तरह के neurotropic संक्रमण में जो भड़काऊ कोशिकाओं मस्तिष्क 5 पैरेन्काइमा घुसना में एक अनिवार्य आवश्यकता नहीं किया जा सकता है, लेकिन कृंतक मलेरिया में विशेष रूप से प्रासंगिक है, जिसमें संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स और भड़काऊ leukocytes रहते रक्त वाहिकाओं के भीतर तनहा बजाय मस्तिष्क के ऊतकों घुसपैठ हो सकता है . तदनुसार, केवल मलेरिया से संक्रमित चूहों के intracardial छिड़काव का बीएसएल विश्लेषण के लिए नहीं की सिफारिश की किया जाना चाहिए, लेकिन यह भी के लिए उपयोगी हो सकता हैपरजीवी ऊतक 10,11 ज़ब्ती का मूल्यांकन. गैर भड़काऊ परिसंचारी leukocytes के लिए भी इसी तरह, मलेरिया परजीवी के अपरिपक्व रूपों संवहनी endothelium का पालन करने में असमर्थ रहे हैं और छिड़काव प्रक्रिया से हटा दिया जाना चाहिए. इसके विपरीत, पक्षपाती pRBC (परिपक्व schizonts) मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं के भीतर रहने के दिखाई देते हैं पी.. berghei ANKA ट्रांसजेनिक luciferase व्यक्त परजीवी 12 उत्पन्न किया गया है और विश्लेषण के इस प्रकार के लिए एक मूल्यवान संसाधन हैं. Luciferase व्यक्त लाइनों के साथ संक्रमण के बाद, ऊतक ज़ब्ती परजीवी संक्रमित एक IVIS 10,11 प्रणाली का उपयोग जानवरों से perfused दिमाग की इमेजिंग के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. दिनों 6-7 बगुलाभगत पर एक परजीवी ज़ब्ती के प्रत्यक्ष perfused चूहों के दिमाग और जानवरों के दिमाग में तुलना मंच विशिष्ट रिपोर्टर परजीवी के साथ संक्रमित (यानी luciferase schizont चरण के दौरान ही व्यक्त) इस विधि के आगे सत्यापन के लिए उपयोगी होगा.
एकके विश्लेषण के लिए पारंपरिक histological दृष्टिकोण के महत्वपूर्ण दोष ऊतक कोशिकाओं घुसपैठ है कि इन तकनीकों की अनुमति नहीं देते सेल आबादी है कि उनकी पहचान के लिए एक से अधिक सेल मार्कर (यानी + NK1.1 αβTCR + CD1d प्रतिबंधित NKT या CD4 की मान्यता की आवश्यकता का आकलन Foxp3 + + विनियामक कोशिकाओं टी). ऊतक विज्ञान के विपरीत, भड़काऊ leukocytes के प्रवाह cytometric विश्लेषण कई एंटीबॉडी stainings के लिए उत्तरदायी है, सेलुलर 7,9,13 पैठ की व्यापक प्ररूपी लक्षण वर्णन के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं. इसके अलावा, इस विधि संवेदनशील सेल आवृत्तियों पर ही नहीं, बल्कि अंतर्जात adoptively हस्तांतरित कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट प्रतिजन टी कोशिकाओं सहित कुल intravascular घुसपैठ, का 1-3% के रूप में कम के रूप में होने वाली आबादी का पता लगाने के लिए पर्याप्त है. पी. berghei ANKA ट्रांसजेनिक 14 OVA से व्यक्त MHC मैं और MHC द्वितीय प्रतिबंधित epitopes परजीवी + + टी कोशिकाओं स्थानांतरित की Ly5.2 + C57BL / 6 PbTG संक्रमित चूहों BSL बीच पता लगाया जा सकता है, सबूत है कि भड़काऊ टी कोशिकाओं में मस्तिष्क के लिए पलायन मलेरिया के परजीवी विशिष्ट प्रतिक्रिया 14 हैं.
का बीएसएल विश्लेषण भी पूर्व नैदानिक पशु मॉडल में उपन्यास विरोधी भड़काऊ उपचार की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है. उदाहरण के लिए, CXCR3 केमोकाइन IFN-γ-inducible 10 प्रोटीन (आईपी-10) करने के लिए मस्तिष्क intravascular घुसपैठ को रोकने के लिए और गंभीर मलेरिया के साथ जुड़े रोग के लक्षणों को कम करने के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की क्षमता को सफलतापूर्वक किया गया है इस का उपयोग कर प्रदर्शन11 विधि.
एक सीमा है कि इस विधि के लिए हो सकता है कि एक व्यक्ति के मस्तिष्क से बरामद कोशिकाओं की कुल संख्या में आम तौर पर एंटीबॉडी stainings का एक सेट के लिए पर्याप्त है. इस प्रकार अलग प्रयोगों अगर 4-6 से अधिक सेल मार्कर के विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं की जरूरत हो सकती है. सामान्य में, प्रक्रिया करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए आसान है. केवल एक कदम है कि कुछ प्रारंभिक प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है intracardial छिड़काव है. कुछ संकेत है कि संभावित समस्याओं को दूर करने के लिए उपयोगी हो सकता है 1 तालिका में सूचीबद्ध हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए तकनीकी सहायता के लिए मिस लता Mackiewicz धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम विक्टोरियन राज्य सरकार परिचालन बुनियादी सुविधाओं समर्थन और ऑस्ट्रेलियाई सरकार राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद IRIISS और परियोजना 1031212 अनुदान के माध्यम से संभव बनाया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
