Summary
En metod för isolering av vidhäftande inflammatoriska leukocyter från fartyg hjärnan blod av
Abstract
Vi beskriver en metod för isolering och karaktärisering av vidhäftande inflammatoriska celler från fartyg hjärnan blod av P. berghei ANKA-infekterade möss. Infektion av mottagliga mus-stammar med denna parasit stam resulterar i induktion av experimentell cerebral malaria, en neurologisk syndrom som rekapitulerar vissa viktiga aspekter av Plasmodium falciparum-medierad svår malaria hos människor 1,2. Mogna formerna av blod steg malaria uttrycker parasitiska proteiner på ytan av den infekterade erytrocyt, vilket tillåter dem att binda till vaskulära endotelceller. Denna process inducerar hinder i blodflödet, vilket resulterar i hypoxi och blödningar 3 och stimulerar rekryteringen av inflammatoriska leukocyter till stället för parasiten kvarstad.
Till skillnad från andra infektioner, dvs neutrotopic virus 4-6, båda malaria parasiterade röda blodkroppar (pRBC) samt tillhörande Inflammatory leukocyter förblir binds i blodkärlen i stället infiltrera hjärnparenkymet. Således att undvika kontaminering av binds leukocyter med icke-inflammatoriska cirkulerande celler, omfattande intracardial perfusion av infekterade möss före orgel utvinning och vävnad bearbetning krävs denna procedur för att ta bort blodet facket. Efter perfusion är hjärnor skördas och dissekerades i små bitar. Vävnadsstrukturen ytterligare störs av enzymatisk behandling med kollagenas D och DNAs I. Det resulterande hjärnhomogenat sedan centrifugeras på en Percoll-gradient som möjliggör separation av hjärnan binds leukocyter (BSL) från myelin och annan vävnad skräp. Isolerade celler tvättas sedan, räknades med användning av en hemocytometer och färgades med fluorescerande antikroppar för efterföljande analys genom flödescytometri.
Detta förfarande möjliggör omfattande fenotypisk karaktärisering av inflammatoriska leukocyter migrerar till hjärnan i rerespons till olika stimuli, inklusive stroke, liksom virala eller parasitiska infektioner. Metoden ger också ett användbart verktyg för bedömning av nya anti-inflammatoriska behandlingar i prekliniska djurmodeller.
Protocol
1. Infektion av möss med P. berghei-ANKA
- Avfrostning en alikvot av frysförvarade P. berghei ANKA pRBC.
- Hålla en cerebral malaria-resistent BALB / c givare mus (8-12 veckor gamla) med två-handed återhållsamhet teknik. Injicera mus med 100-200 pl pRBC med en 1 ml spruta (28G nål). Rutinmässigt är 1-2 donatormöss injiceras.
- På dagarna 4-5 efter infektion (pi) avlägsna givare mus från bur och placera den på en arbetsstation eller en engångs arbetar pad.
- Försiktigt hålla musen i slutet av svansen och använda en liten sax klippa svanstipp (ca 1 mm). Alternativt kan en liten svans punktering med en 25 G nål utföras.
- Placera en droppe blod från musens svansven nära slutet av en frostad slutet mikroskop.
- Placera en andra bild (spridare) på en 45 ° vinkel och tillbaka det i droppe blod. När blodet sprids längs kanten, tryck spridaren-slide Evendast över objektglas för att göra blodutstryk. Låt utstryket lufttorka.
- Fix blodutstryk i 100% metanol under 30 sekunder och sedan färga objektglasen i nyframställd Giemsa under 10 min.
- Skölj blodutstryk med rinnande vatten under 1 minut, låt lufttorka och undersöka glider under mikroskop (100x, oljeimmersion). Räkna pRBC inom 1.000 erytrocyter och beräkna procent parasitemi. Donatormöss ska nå parasitemia nivåer mellan 2.5-5% innan de kan blöda för infektion av försöksdjur.
- Samla upp blod från givaren musen genom retroorbital blödning med en hepariniserad mikro-hematokrit kapillärrör. Alla experiment utförs i enlighet med Walter & Eliza Hall Institute Animal etikkommittén krav. Beroende på lokala Animal Ethic kommittén andra krav blödningar förfaranden kan användas. Lös erforderlig mängd blod i RPMI-medium vid en slutkoncentration av 1x10 6 pRBC/0.2 ml. Tänk på atten vanlig mus hematokrit är ~ 6x10 9 röda blodkroppar / 1 ml.
- Infect experimentell C57BL / 6 möss (8-12 veckor gamla) genom injicering intraperitonealt (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml.
- För att övervaka parasitemia nivåer av infekterade möss följer stegen 1,3-1,8. Parasitemi bör bestämmas varje 2-3 dagar med början den dag 2 eller 3 pi
- Debut av svår malaria i C57BL / 6 möss kanske manifesteras som krökt utseende, ruffed päls och låg aktivitet. Vissa möss kan återhämta i detta skede, men progression till förlust av självupprättande reflex indikerar irreversibel sjukdom och djur måste avlivas.
2. Intracardial perfusion av möss och Brain Extraction
- Montera ett manuellt system gravitation perfusion genom att säkra en 500 ml reservoar till en kolonn hållare fäst till toppen av en 60 cm kolonn stativ. Anslut plastslang till den nedre änden av behållaren och säkra en slang klämma för att styra buffert flöde. Fäst slangen till en 23 G-nål. Fill upp behållaren med PBS (hölls vid 22 ° C), öppna klämman och låta buffert rinna genom slangen för att ta bort alla luftbubblor.
- Avliva P. berghei ANKA-infekterade möss med CO 2 inandning. Bekräfta döden genom frånvaron av pedalen, orbital och respiratoriska reaktioner.
- Pin avlivas musen genom de bakre och främre tassar dorsalt på en frigolit dissektion styrelse i en plastbricka. Beroende på lokala djur Ethic kommitté krav anestesi kan administreras före påbörjandet av intracardial pefusion.
- Torka buksidan med 70% etanol.
- Använd stora sax och pincett för att öppna huden längs mittlinjen för att exponera brösthålan. Vik och nåla hud åt sidorna.
- Håll bröstbenet med fin pincett och skär membranet och längs båda sidorna av bröstben avskiljning revbenen. Se till att inte skada några stora blodkärl.
- Nåla bröstkorgen genom bröstbenet löst bredvid huvudet.
- Håll ventriklarna with fin pincett och försiktigt incise höger förmak med fina sax.
- Sätt 23G nål fäst vid gravitation perfusion systemet i vänster kammare mot stigande aorta medan PBS körs. Sätt endast 0,5 cm av nålspetsen.
- Perfundera musen för 5 minuter eller tills utflödet är klar.
- Ta loss musen och lägga den på sin mage. Torka huvud med 70% etanol.
- Med hjälp av stora saxar, gör ett snitt strax ovanför den cervikala ryggmärgen område.
- Använd fina sax för att göra en median caudal-rostralt snitt börjar vid skallbasen och skal hud bort för att frilägga skallen.
- Håller huvudet, placera bladen i en liten sax i varje orbitala håligheten och göra ett snitt mellan banor.
- Gör ett längsgående snitt längs sagittala suturen och försiktigt skallen på varje hjärnhalva utåt.
- Med hjälp av en spatel, försiktigt lyfta hjärnan och placera det i en 10 ml centrifugrör innehållande RPMI medium.
3. Isolering av Brain-binds Leukocyter (BSL)
- Att arbeta i en säkerhetsskåp, plats nyskördad hjärna ovanpå en rostfri cellfilter (40-60 maskstorlek) i en petriskål innehållande 3-5 ml RPMI vävnadsodlingsmedium.
- Skär hjärnvävnad till små bitar.
- Tryck små bitar av hjärnvävnad genom cellen silen med en kristall kolv.
- Överför hjämhomogenat till en 10 ml rör och centrifugera vid 250 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Lös pellet i 3 ml RPMI-medium, innehållande 0,05% kollagenas D och 2U/ml DNAs I.
- Rotera blandning under 30 minuter vid rumstemperatur. Avlägsna cellrester genom att trycka blandningen genom en 70 ^ m nylon cellfilter och / eller genom inkubering på is under 5 minuter.
- Lay hjärnhomogenat på en 7 ml 30% Percoll-kudde och centrifugera vid 400 xg (inga bromsar) under 20 min vid rumstemperatur.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml röda blodkroppar lysbuffert och inkubera på is under 5 min tilllysera vidhäftande pRBC, som inte kunde avlägsnas från hjärnan genom intracardial perfusion.
- Lägg 9 ml RPMI-medium, tvätta celler och centrifugera vid 250 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera BSL-innehållande pelleten i 50-100 ul RPMI-medium och celler överföring till ett Eppendorf-rör.
- Späd en 5-10 pl alikvot av cellprovet 1:2 i trypanblått för identifiering av viabla celler.
- Räkna levande celler i mikroskop med hjälp av en hemocytometer. Från dag 6 pi framåt när P. berghei ANKA-infekterade möss visar neurologiska tecken, 20,000-100,000 BSLs kan återvinnas.
4. Immunfenotypning av BSL genom Multicolour flödescytometri
- Centrifugera cellerna vid 250 x g under 10 minuter vid 4 ° C, aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 50 pl färgningsbuffert (PBS, 1% fetalt kalvserum (FCS), 2 mM EDTA).
- Lägg till 1 pl renad anti-CD16/32 antikropp (Fcblock).
- Inkubera cellerna under 10 minuter på is.
- Tvätta cellerna med 1 ml färgningsbuffert. Centrifugera cellerna vid 250 x g under 10 minuter vid 4 ° C och aspirera supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 50 | il färgningsbuffert innehållande förutbestämda optimala utspädningar av erforderliga fluorescerande antikroppar, dvs anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR-och anti-NK1.1.
- Inkubera under 1 timme på is.
- Tvätta cellerna med 1 ml färgningsbuffert. Centrifugera cellerna vid 250 x g under 10 minuter vid 4 ° C och aspirera supernatanten.
- Resuspendera celler i 100 pl PBS.
- Överför celler till en flödescytometri plaströr.
- Med hjälp av en flödescytometer, förvärva minst 5,000-10,000 evenemang. Lämpliga ofärgade celler kontroller och fluorokroma prover ersättning bör ingå som krävs.
- Analysera resultat med hjälp av lämplig programvara flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten i FIG. 2 visar procenttal och absoluta antalet olika BSL populationer återhämtat sig från hjärnan hos perfunderade eller unperfused malaria-infekterade och naiv kontrollmöss. Isolerad BSL färgades med PE-anti-NK1.1 och APC-anti-TCR-β antikroppar såsom anges i protokollet texten. Konsekvent med tidigare fynd 7-9 bestod αβTCR + T-celler en hög andel av BSL poolen i hjärnorna hos perfunderade malaria-infekterade möss (dag 6 pi). Denna population verkade vara betydligt underrepresenterade i hjärnor av icke-perfuserade djur (figur 2A-B). Den skenbara minskningen av T-cell frekvenser i icke-perfuserade hjärnor var associerat med en betydligt högre andel och totalt antal dubbla negativa celler (αβTCR - NK1.1 -) i dessa djur (Fig. 2A-B). Hög andel och siffror på dubbla negativa celler i unperfused hjärnor var inte bara detekteras i malaria-infekterade möss men även i NA & IUml, ve kontroller, vilket tyder på att dessa celler är icke-inflammatoriska leukocyter närvarande i kärl hjärnan blod som återvinns tillsammans med inflammatoriska celler om intracardial perfusion inte utförs.
Två ytterligare exempel på BSL analys visas i figur. 3 och Fig.. 4. Kortfattat C57BL / 6 möss infekterade med P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Temporal samband mellan leukocytrekrytering till hjärnan och uppkomsten av neurologiska symptom (mellan dag 6-8 pi) har visats i P. berghei ANKA infekterade möss 7-9. I detta speciella exempel har malaria-infekterade möss avlivades på dag 6 pi, och BSL renades såsom beskrivits i protokollet texten. Isolerad BSL färgades med PE-anti-NK1.1, APC-anti-TCR-β, FITC-anti-CD4 och PerCPCy5.5-anti-CD8a antikroppar. Proverna har förvärvats med hjälp av en BD Biosciences FACSCalibur flödescytometer och analys med hjälp Weasel 3.0.1 mjukvara. Viariella celler gated genom framåt och sidospridning. De procentsatser av NK-celler, T-lymfocyter och NKT celler (NK1.1 + TCR + celler) sekvestreras i hjärnan hos naiva och malaria-infekterade möss (dag 6 pi) anges i de bästa panelerna (Fig. 3A). Bottenpanelema visar procentandelar av CD4 + och CD8 + T-lymfocyter bland gated NK1.1 - αβTCR +-celler (fig. 3A). FIG. 3B avbildar ett exempel i vilket det absoluta antalet CD4 + och CD8 + hjärnan sekvestreras T-celler beräknades på dag 6 pi med P. berghei ANKA. I allmänhet kan 20,000-100,000 BSL återvinnas från hjärnor av P. berghei ANKA infekterade möss. Flera faktorer såsom tid pi kan känslighet musstam eller införande av anti-inflammatoriska behandlingar påverkar cellens återhämtning. Rutinmässigt ger en individuell hjärna tillräckligt med celler för 1 uppsättning av antikroppar färgningar.
I det exempel som i Fig.. 4 av kemokinreceptorn användning av hjärnan binds T-lymfocyter analyserades. Möss infekterades med P. berghei ANKA och BSL isolerades på dag 6 pi Cellerna färgades med APC-anti-TCR-β, PE-anti-CXCR3 och biotinylerad anti-CCR5-antikroppar, följt av inkubering med ett streptavidin-konjugat PerCPCy5.5. Prover insamlats och analyserats enligt figur. 3. Histogrammen representerar procentandelar av αβTCR + celler bland totalt BSL i malaria-infekterade och naiv kontroll möss. Konturen tomter i mitten och botten paneler visar andelen CXCR3 + och CCR5 + celler inom gated αβTCR + celler.
Figur 1. Flödesschema av förfarandet för isolering och analys av BSLfrån P. berghei ANKA-infekterade möss. (1) En cryopreseved alikvot av P. berghei ANKA pRBC avfrostas och 1 eller 2 donatormöss är smittade. (2) Fyra dagar senare parsitemia nivåer donatormöss beräknas, donatormöss är avblodade och blod utspädningar beredda för infektion av experimentella möss. En malariainfektion sätts sedan upp i svår malaria-känsliga C57BL / 6 möss. (3) De dagar 5-7 pi, möss avlivas av CO 2 inandning och omedelbart intracardially perfusion att ta bort alla cirkulerande icke vidhäftande celler. (4) hjärnor skördas sedan och en hjämhomogenat framställd genom digerering av vävnad med kollagenas D och DNAse I. BSL separeras sedan från myelin och cellrester genom en Percoll-gradient. (5) Utfälld BSL tvättas därefter, räknades med användning av en hemocytometer, färgades med fluorescerande antikroppar och analyserades med flödescytometri.
Figur 2. BSL analys hjärnan hos perfunderade eller unperfused möss. C57BL / 6 möss infekterades med P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Hjärnor skördades på dag 6 pi från perfunderade eller unperfused djur. BSL isolerades, färgades med anti-NK1.1 och anti-TCR-fluorescerande antikroppar och analyserades med flödescytometri. (A) punktdiagram visar procent av NK-celler, T-lymfocyter, NK1.1 + TCR + celler och dubbla negativa celler NK1.1 - TCR - i perfunderade (toppaneler) eller unperfused (bottenpaneler) malaria-infekterade och naiv kontrollmöss . (B) Det absoluta antalet dubbla negativa celler och T-lymfocyter och beräknades på dag 6 pi med P. berghei ANKA och naiva möss kontroll. Varje stång represents medelvärdet av 3 prover ± SEM, * p> 0,05.
Figur 3. NK-celler och T-lymfocyter kan detekteras i hjärnor av P. berghei ANKA infekterade möss. C57BL / 6 möss infekterades med P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Hjärnor extraherades dag 6 pi efter perfusion av euthanized djuren. BSL isolerades, färgades med anti-NK1.1, anti-TCR, anti-CD4 och anti-CD8 fluorescerande antikroppar och analyserades med flödescytometri. (A) Bästa paneler visar procent av NK-celler, T-lymfocyter och NK1.1 + TCR + celler i malaria-infekterade och naiv kontroll möss. Bottenpaneler illustrerar procentandelar av CD4 + och CD8 + T-celler inom gated αβTCR + NK1.1 - (B) Det absoluta antalet hjärnan binds CD4 + och CD8 + T-celler beräknades på dag 6 pi med P. berghei ANKA och naiva möss kontroll. Varje stapel representerar medelvärdet av 3 prover ± SEM.
Figur 4. De flesta T-lymfocyter migrerar till hjärnan som svar på svår malariainfektion uttrycker kemokinreceptorn CXCR3. C57BL / 6 möss infekterades med P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Hjärnor extraherades dag 6 pi efter omfattande perfusion av euthanized djuren. BSL isolerades, färgades med anti-TCR, anti-CXCR3 och anti-CCR5-antikroppar och analyserades med flödescytometri. Toppaneler visar procentandelar av αβT lymfocyter i malaria-infekterade och naiv kontrollmöss. Konturen tomter visar procentsatser av CXCR3 + (mitten paneler) och CCR5 + (nedre panelen) celler i avgränsade lymfocyter αβTCR +.
| Problem | Felsökning |
| Ofullständig perfusion |
|
| Inte nog BSL återhämtat |
|
Tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering och analys av BSL är en metod som möjliggör karakterisering och kvantifiering av inflammatoriska celler migrerar till hjärnan som svar på vävnadsskada eller infektion i experimentella musmodeller. Införandet av en intracardial perfusion steg för avlägsnande av blod facket innan orgel extraktion och efterföljande cellisolering är användbart för att förhindra kontaminering av inflammatoriska celler med icke-inflammatoriska cirkulerande leukocyter. Detta kan inte vara ett viktigt krav i neurotropa infektioner såsom mus encefalomyelitvirus där inflammatoriska celler tränger hjärnparenkymet 5, men är särskilt relevant i gnagare malaria, där infekterade erytrocyter och inflammatoriska leukocyter förblir binds i blodkärlen i stället infiltrera hjärnvävnad . Därför bör intracardial perfusion av malaria-infekterade möss inte bara rekommenderas för analys av BSL men kan också vara användbart förbedömning av parasit-vävnad kvarstad 10,11. Liknar icke-inflammatoriska cirkulerande leukocyter, omogna former av malariaparasiter inte att vidhäfta till det vaskulära endotelet och bör avlägsnas genom perfusion. Däremot anhängare pRBC (mogna schizonter) tycks förbli inom fartyg hjärnan blod. P. berghei ANKA transgena parasiter som uttrycker luciferas har genererats 12 och är en värdefull resurs för denna typ av analys. Efter infektion med luciferas-uttryckande linjer kan parasit vävnad kvarstad bestämmas genom avbildning av perfunderade hjärnor från smittade djur med hjälp av ett IVIS systemet 10,11. En direkt jämförelse av parasit-kvarstad på dagar 6-7 pi i hjärnan hos perfunderade djur och hjärnan hos möss infekterade med steg-specifika reporter parasiter (dvs uttrycka luciferas endast under schizont stadium) skulle vara användbara för ytterligare validering av denna metod.
Enviktig nackdel med traditionella histologiska metoder för analys av vävnads-infiltrerande celler är att dessa tekniker inte tillåter bedömning av cellpopulationer som kräver erkännande av mer än en cell markör för att identifiera (dvs. NK1.1 + αβTCR + CD1d fritt NKT eller CD4 + Foxp3 + T regulatoriska celler). Till skillnad från histologi är flödescytometrisk analys av inflammatoriska leukocyter kan bli föremål för flera antikroppar färgningar, vilket ger ett mycket användbart verktyg för omfattande fenotypiska karaktärisering av cellulära infiltrat 7,9,13. Dessutom, är denna metod är tillräckligt känslig för att detektera cellpopulationer uppträder vid frekvenser så låga som 1-3% av den totala intravaskulära infiltrera, inklusive inte bara endogena men också adoptivt överförda celler liksom antigenspecifika T-celler. P. berghei ANKA transgena parasiter som uttrycker MHC I och MHC II-begränsade epitoper från OVA 14 + CD8 + T-celler från OT-I möss kunde detekteras bland BSL av Ly5.2 + C57BL / 6 PbTG-infekterade möss, som styrker att inflammatoriska T-celler migrerar till hjärnan i svar på malaria är parasit-specifika 14.
Analysen av BSL är också användbart för att utvärdera potentialen av nya anti-inflammatoriska behandlingar i prekliniska djurmodeller. Till exempel har kapaciteten av monoklonala antikroppar mot CXCR3 kemokinen IFN-γ-inducerbart protein 10 (IP-10) för att förhindra hjärnan intravaskulär infiltration och lindra sjukdomssymptom i samband med svår malaria har framgångsrikt visat att använda dennametod 11.
En begränsning att denna metod kan ha är att det totala antalet celler utvunna från en individ hjärna är generellt tillräckligt för en uppsättning av antikroppar färgningar. Sålunda separata experiment kan behövas om mer än 4-6 cellmarkörer krävs för analysen. I allmänhet, är det förfarande som är lätt att utföra. Den enda åtgärd som kan behöva viss grundutbildning är intracardial perfusion. Några tips som kan vara användbara för att övervinna potentiella problem visas i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka fröken Liana Mackiewicz för tekniskt stöd. Detta arbete har gjorts möjlig genom viktorianska delstatsregeringen driftsinfrastruktur Support och Australiens regering National Health och Medicinska forskningsrådet IRIISS och projektbidrag 1.031.212.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
