Summary
Une méthode pour l'isolement des adhérents leucocytes inflammatoires des vaisseaux sanguins du cerveau de
Abstract
Nous décrivons une méthode pour l'isolement et la caractérisation des cellules adhérentes inflammatoires des vaisseaux sanguins du cerveau de P. berghei ANKA-souris infectées. L'infection des souris sensibles avec les souches cela se traduit souche de parasite dans l'induction de la malaria cérébrale expérimentale, un syndrome neurologique qui récapitule certains aspects importants de Plasmodium falciparum à médiation paludisme grave chez les humains 1,2. Formes matures du sang étapes paludisme exprimer des protéines parasites sur la surface de l'érythrocyte infecté, ce qui leur permet de se lier à des cellules endothéliales vasculaires. Ce processus induit obstruction du flux sanguin, ce qui entraîne une hypoxie et des hémorragies 3 et stimule également le recrutement des leucocytes inflammatoires au site de la séquestration du parasite.
Contrairement à d'autres infections, à savoir les virus neutrotopic 4-6, les deux paludisme globules rouges parasités (pRBC) ainsi que associé Inflammleucocytes Atory reste séquestré dans les vaisseaux sanguins plutôt que de s'infiltrer dans le parenchyme cérébral. Ainsi, pour éviter la contamination des leucocytes séquestrés avec des non-inflammatoires des cellules circulantes, vaste perfusion intracardiaque de souris infectées par-avant prélèvement d'organes et de traitement des tissus est nécessaire dans cette procédure pour retirer le compartiment sanguin. Après la perfusion, les cerveaux sont prélevés et disséqués en petits morceaux. La structure du tissu est encore perturbée par un traitement enzymatique avec de la collagénase D et DNAse I. L'homogénat de cerveau résultant est ensuite centrifugé sur un gradient Percoll qui permet de séparer le cerveau séquestrés leucocytes (BSL) de la myéline et des débris d'autres tissus. Les cellules isolées sont ensuite lavées, comptées à l'aide d'un hémocytomètre et colorées avec des anticorps fluorescents pour une analyse ultérieure par cytométrie en flux.
Cette procédure permet la caractérisation phénotypique complète des leucocytes inflammatoires de migrer vers le cerveau reréponse à divers stimuli, y compris les accidents vasculaires cérébraux ainsi que les infections virales ou parasitaires. La méthode fournit également un outil utile pour l'évaluation de nouveaux traitements anti-inflammatoires dans des modèles animaux précliniques.
Protocol
1. L'infection des souris avec P. berghei ANKA-
- Décongeler une aliquote de cryoconservé P. berghei ANKA pRBC.
- Retenir un paludisme cérébral résistant souris BALB / c donateurs (8-12 semaines d'âge) en utilisant la technique de retenue à deux mains. Injecter la souris avec 100-200 ul de pRBC l'aide d'une seringue de 1 ml d'insuline (28G aiguille). Régulièrement, 1-2 souris donneuses sont injectés.
- Sur les 4-5 jours post-infection (pi) retirer souris donneuse de la cage et le placer sur une station de travail ou un tampon jetable de travail.
- Doucement restreindre la souris par le bout de la queue et l'utilisation de petits ciseaux couper le bout de la queue (environ 1 mm). Alternativement, une ponction petite queue à l'aide d'une aiguille 25 G pourrait être réalisée.
- Déposer une goutte de sang de veine de la queue de la souris vers la fin d'une lame de microscope dépoli fin.
- Placez une deuxième lame (spreader) sur un angle de 45 ° et le sauvegarder dans la goutte de sang. Une fois le sang se propage le long du bord, pousser la veille épandeur-slideeul à travers la lame du microscope pour faire le frottis sanguin. Laisser le frottis sécher à l'air.
- Fixer les frottis sanguins dans le méthanol à 100% pendant 30 secondes, puis tache diapositives au Giemsa fraîchement préparée pendant 10 min.
- Rincer frottis de sang avec l'eau courante pendant 1 min, laisser sécher à l'air et à examiner glissière sous le microscope (100x immersion dans l'huile,). Énumérer pRBC à moins de 1000 érythrocytes et de calculer la parasitémie pour cent. Souris donneuses devraient atteindre des niveaux de parasitémie entre 2,5-5% avant d'être saigné pour l'infection des animaux de laboratoire.
- Recueillir le sang de la souris donneuse par saignement rétro-orbitaire en utilisant un micro-hématocrite hépariné tube capillaire. Toutes les expériences sont réalisées en conformité avec les exigences Walter et Eliza Hall Institute du Comité d'éthique animale. En fonction des besoins des animaux locaux comité d'éthique procédures autres saignements peuvent être utilisés. Dissoudre la quantité requise de sang dans le milieu RPMI à une concentration finale de 1.10 6 pRBC/0.2 ml. Considérez queun hématocrite normal de la souris est de ~ 6x10 9 cellules rouges du sang / 1 ml.
- Infect C57BL expérimentale / 6 souris (8-12 semaines) par injection intrapéritonéale (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml.
- Pour surveiller les niveaux de parasitémie de souris infectées suivez les étapes 1.3 à 1.8. Parasitémie doit être déterminé tous les 2-3 jours à partir du jour 2 ou 3 pi
- L'apparition du paludisme grave chez souris C57BL / 6 peut se manifester comme apparence voûtée, la gélinotte fourrure et une faible activité. Certaines souris peut recouvrer à ce stade, mais la progression de la perte de l'auto-réflexe de redressement indique maladie irréversible et les animaux doivent être euthanasiés.
2. La perfusion intracardiaque de souris et d'extraction du cerveau
- Assembler un système de perfusion par gravité manuel par fixation d'un réservoir 500 ml d'un support de colonne fixé à la partie supérieure de la colonne de support 60 cm. Raccorder des tubes en matière plastique à l'extrémité inférieure du réservoir et assurer une pince de tube pour commander l'écoulement tampon. Fixer le tube à une aiguille 23 G. Fill le réservoir avec du PBS (maintenue à 22 ° C), ouvrir et serrer permettre tampon afin de fonctionner à travers le tube pour éliminer toutes les bulles d'air.
- Euthanasier P. berghei ANKA-souris infectée par inhalation de CO 2. Confirmer la mort par l'absence de pédale, et les réponses des voies respiratoires orbital.
- Pin souris euthanasiées par les pattes de derrière et devant dorsalement sur une planche à dissection mousse de polystyrène contenues dans un bac en plastique. Selon le Comité des animaux sous anesthésie locale exigences d'éthique pourrait être administré avant le début de pefusion intracardiaque.
- Essuyez la face ventrale avec de l'éthanol à 70%.
- Utilisez de grands ciseaux et des pinces pour ouvrir la peau le long de la ligne médiane pour exposer la cavité thoracique. Pli cutané et la broche sur les côtés.
- Tenez le sternum avec des pinces fines et couper le diaphragme et le long des deux côtés du sternum couper les côtes. Prenez soin de ne pas endommager les gros vaisseaux sanguins.
- La broche de la cage thoracique du sternum lâchement à côté de la tête.
- Tenez esprit ventriculesh pince fine et soigneusement inciser oreillette droite avec des ciseaux fins.
- Insérez l'aiguille 23G attaché au système de perfusion par gravité dans le ventricule gauche vers l'aorte ascendante tandis que le PBS est en cours d'exécution. Insérez seulement 0,5 cm de la pointe de l'aiguille.
- Perfuser la souris pendant 5 min ou jusqu'à ce que l'effluent est clair.
- Détacher la souris et le poser sur son abdomen. Essuyez la tête avec de l'éthanol à 70%.
- Utilisation de grands ciseaux, faire une coupe juste au-dessus de la zone de la moelle épinière cervicale.
- Utilisez des ciseaux fins pour faire une médiane caudale-rostrale coupe à partir de la base du crâne et la peau d'écart pour exposer le crâne.
- Tenant la tête, placez les lames de ciseaux petits dans chaque cavité orbitaire et faire une coupure entre les orbites.
- Faites une coupe longitudinale le long de la suture sagittale et détachez soigneusement le crâne sur chaque hémisphère du cerveau vers l'extérieur.
- Avec une spatule, soulevez doucement le cerveau et le placer dans un tube à centrifuger de 10 ml contenant du milieu RPMI.
3. Isolement de Brain-séquestrés leucocytes (BSL)
- Travailler dans une enceinte de sécurité, le lieu fraîchement récoltées cerveau au-dessus d'un tamis cellulaire en acier inoxydable (40-60 mesh) dans une boîte de Pétri contenant 3-5 ml de milieu de culture RPMI tissus.
- Coupez le tissu cérébral en petits morceaux.
- Appuyez sur de petits morceaux de tissu cérébral à travers le filtre cellulaire à l'aide d'un piston de cristal.
- Transfert homogénat de cerveau dans un tube de 10 ml et centrifuger à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Dissoudre le culot dans 3 ml de milieu RPMI, contenant 0,05% de collagénase D et DNAse I. 2U/ml
- Tournez mélange pendant 30 min à température ambiante. Éliminer les débris cellulaires en poussant le mélange à travers un tamis de nylon 70 um cellule et / ou par incubation sur de la glace pendant 5 min.
- Lay homogénat de cerveau sur un coussin de 7 ml de Percoll 30% et centrifuger à 400 xg (sans freins) pendant 20 min à température ambiante.
- Remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon de lyse des globules rouges du sang et incuber sur de la glace pendant 5 min àlyser pRBC adhérent, qui n'a pu être retirée du cerveau par perfusion intracardiaque.
- Ajouter 9 ml de milieu RPMI, laver les cellules et centrifuger à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension BSL contenant du pellet dans 50-100 pi de milieu RPMI et transférer les cellules dans un tube Eppendorf.
- Diluer une aliquote de 5-10 pi de l'échantillon de cellules 1:2 dans du bleu trypan pour l'identification de cellules viables.
- Compter les cellules viables sous le microscope à l'aide d'un hémocytomètre. A partir du jour de pi 6, lorsque P. berghei ANKA-souris infectées présentent des signes neurologiques, 20,000-100,000 BSLs peut être récupéré.
4. Immunophénotypage de BSL en cytométrie en flux Multicolore
- Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 50 ul de tampon de coloration (PBS, 1% sérum de veau foetal (FCS), 2 mM EDTA).
- Ajouter le pl 1 sur purifiée anti-CD16/32 anticorps (Fcblock).
- Incuber les cellules pendant 10 min sur la glace.
- Laver les cellules avec 1 ml de tampon de coloration. Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C et aspirer le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans 50 ul de tampon de coloration contenant prédéterminés dilutions optimales de exigées anticorps fluorescents, c'est à dire anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR et anti-NK1.1.
- Incuber pendant 1 heure sur la glace.
- Laver les cellules avec 1 ml de tampon de coloration. Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C et aspirer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans 100 ul de PBS.
- Transférer des cellules dans un tube de plastique de cytométrie de flux.
- L'aide d'un cytomètre en flux, accumuler au moins 5.000-10.000 événements. Des contrôles de cellules non colorées et des échantillons de rémunération fluorochromes doivent être incluses au besoin.
- Analyser les résultats en utilisant un logiciel approprié cytométrie en flux.
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Representative Results
Les résultats de la Fig. 2 pourcentages montrent et le nombre absolu des différentes populations BSL récupérés à partir de cerveaux de souris perfusés ou unperfused contrôle infectées par la malaria et naïf. Isolé BSL ont été colorés avec du PE-anti-NK1.1 et APC-anti-TCR-β anticorps comme indiqué dans le texte du Protocole. Conformément aux conclusions précédentes 7-9, αβTCR cellules T comprend une forte proportion de la piscine BSL dans le cerveau des perfusés infectés par le paludisme chez la souris (jour 6 pi). Cette population semble être significativement sous-représentés dans le cerveau des animaux non perfusés (Fig. 2A-B). La réduction apparente de fréquences de lymphocytes T non-perfusés cerveau a été associée à un pourcentage considérablement plus élevé et le nombre total de cellules doublement négatives (αβTCR - NK1.1 -) chez ces animaux (Fig. 2A-B). Pourcentage élevé et le nombre de cellules doublement négatives dans le cerveau unperfused n'étaient pas seulement détecté dans le paludisme chez des souris infectées, mais aussi à na & iuml; ve contrôles, ce qui suggère que ces cellules sont des leucocytes inflammatoires non présents dans les vaisseaux sanguins du cerveau qui sont récupérées en même temps que les cellules inflammatoires si perfusion intracardiaque n'est pas effectuée.
Deux autres exemples d'analyse BSL sont présentés dans la figure. 3 et Fig. 4. Brièvement, des souris C57BL / 6 ont été infectées avec P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Associations temporelles entre le recrutement des leucocytes vers le cerveau et l'apparition des symptômes neurologiques (entre les jours 6-8 pi) ont été mis en évidence chez P. berghei ANKA infecté des souris 7-9. Dans cet exemple particulier, le paludisme souris infectées ont été euthanasiés au jour 6 pi, et le BSL ont été purifiés comme décrit dans le texte du Protocole. Isolé BSL ont été colorés avec du PE-anti-NK1.1, APC-anti-TCR-β, FITC anti-CD4 et anti-PerCPCy5.5 CD8a anticorps. Les échantillons ont été acquises à l'aide d'un cytomètre de flux BD Biosciences FACSCalibur et l'analyse effectuée à l'aide du logiciel Weasel 3.0.1. Viables cellules ont été déclenchés par l'avant et la diffusion latérale. Les pourcentages de cellules NK, les lymphocytes T et les cellules NKT (NK1.1 + + TCR des cellules) séquestré dans le cerveau des souris naïves et infecté par la malaria (jour 6 pi) sont indiqués dans les panneaux supérieurs (figure 3A). Les panneaux inférieurs affichent des pourcentages de CD4 + et CD8 + T entre NK1.1 fermée - αβTCR + cellules (figure 3A). Fig. 3B représente un exemple dans lequel le nombre absolu de CD4 + et CD8 + cerveau séquestrés cellules T ont été calculés au jour 6 pi avec P. berghei ANKA. En général, 20,000-100,000 BSL peut être récupéré à partir de cerveaux de P. berghei ANKA souris infectées. Plusieurs facteurs tels que pi temps, la sensibilité de la souche de souris ou l'inclusion de traitements anti-inflammatoires pourraient influer sur la récupération des cellules. Régulièrement, un cerveau individuel fournit suffisamment de cellules pour 1 jeu de colorations anticorps.
Dans l'exemple fourni dans Fig. 4, le récepteur de chimiokine utilisation des lymphocytes T cerveau séquestrées ont été analysées. Les souris ont été infectées avec P. berghei ANKA et BSL ont été isolés le jour 6 Cellules pi ont été colorées avec APC-anti-TCR-β, PE-anti-CXCR3 et biotinylé anti-CCR5 anticorps, suivie d'une incubation avec un conjugué streptavidine-PerCPCy5.5. Les échantillons ont été acquises et analysées selon la Fig. 3. Les histogrammes représentent les pourcentages de cellules + αβTCR entre BSL totale chez les souris témoins infectées par la malaria et naïf. Les tracés de contour dans le milieu et du bas montrent les pourcentages de CXCR3 et CCR5 + + dans les cellules αβTCR fermée + cellules.
Organigramme Figure 1. De la procédure pour l'isolement et l'analyse de BSLà partir de P. berghei ANKA-souris infectées. (1) Une partie aliquote de cryopreseved de P. berghei ANKA pRBC est dégivré et 1 ou 2 souris donneuses sont infectés. (2) niveaux Quatre jours plus tard parsitemia de souris donneuses sont calculés, souris donneuses sont des dilutions saignés et le sang préparés pour l'infection des souris expérimentales. Une infection du paludisme est ensuite mis en place dans le paludisme sévère sensibles à souris C57BL / 6. (3) Sur pi 5-7 jours, les souris sont euthanasiées par inhalation de CO 2 et immédiatement perfusé par voie intracardiaque pour supprimer tous circulant cellules non-adhérentes. (4) Les cerveaux sont ensuite récoltés et un homogénat de cerveau préparé par digestion du tissu avec de la collagénase D et la DNAse I. BSL sont ensuite séparés de la myéline et les débris cellulaires par un gradient de Percoll. (5) précipité BSL sont ensuite lavées, comptées à l'aide d'un hémocytomètre, colorées avec des anticorps fluorescents et analysées par cytométrie en flux.
Figure 2. BSL analyse dans le cerveau des souris perfusés ou unperfused. Souris C57BL / 6 ont été infectées avec P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Les cerveaux ont été récoltés au jour 6 pi à partir d'animaux perfusés ou unperfused. Le BSL ont été isolés, colorées avec des anticorps anti-NK1.1 et anti-TCR fluorescente et analysées par cytométrie en flux. (A) des parcelles Dot représentent les pourcentages des cellules NK, des lymphocytes T NK1.1 + + TCR des cellules et des cellules doubles négatifs NK1.1 - TCR - en perfusion (panneaux supérieurs) ou unperfused (panneaux inférieurs) souris témoins infectées par la malaria et naïf . (B) Le nombre absolu de cellules doublement négatives et les lymphocytes T et a été calculé au jour 6 pi avec P. berghei ANKA et les souris témoins naïfs. Chaque barre represents de la moyenne de 3 échantillons ± SEM, * p <0,05.
Figure 3. Cellules NK et les lymphocytes T peuvent être détectés dans le cerveau de P. berghei ANKA souris infectées. Souris C57BL / 6 ont été infectées avec P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Les cerveaux ont été extraites au jour 6 pi après la perfusion des animaux euthanasiés. Le BSL ont été isolés, colorées avec des anticorps anti-NK1.1, anti-TCR, anti-CD4 et anti-CD8 anticorps fluorescents et analysées par cytométrie en flux. (A) des panneaux Top représentent les pourcentages des cellules NK, des lymphocytes T et NK1.1 + + TCR des cellules dans des souris témoins infectées par la malaria et naïf. Panneaux inférieurs illustrent les pourcentages de CD4 + et CD8 + T dans αβTCR fermée + NK1.1 - (B) Le nombre absolu de cerveau séquestrés CD4 + et CD8 + a été calculé au jour 6 pi avec P. berghei ANKA et les souris témoins naïfs. Chaque barre représente la moyenne de 3 échantillons ± SEM.
Figure 4. La majorité des lymphocytes T migrent vers le cerveau en réponse à l'infection par le paludisme grave expriment le récepteur de chimiokine CXCR3. Souris C57BL / 6 ont été infectées avec P. berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Les cerveaux ont été extraites au jour 6 pi après la perfusion approfondie des animaux euthanasiés. Le BSL ont été isolés, colorées avec des anticorps anti-TCR, anti-CXCR3 et anti-CCR5 anticorps et analysées par cytométrie en flux. Panneaux supérieurs représentent des pourcentages de αlymphocytes βT dans les souris témoins infectées par la malaria et naïf. Les tracés de contour illustrer pourcentages de CXCR3 + (au milieu) et le CCR5 + (panneau inférieur) au sein de cellules lymphocytes gated + αβTCR.
| Problème | Dépannage |
| Perfusion incomplète |
|
| Pas assez BSL récupéré |
|
Tableau 1.
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Discussion
L'isolement et l'analyse de BSL est une méthode qui permet la caractérisation et la quantification des cellules inflammatoires qui migrent vers le cerveau en réponse à une lésion tissulaire ou d'une infection chez des souris modèles expérimentaux. L'introduction d'une étape de perfusion intracardiaque pour le retrait du compartiment sanguin avant l'extraction d'organes et de l'isolement cellulaire ultérieur est utile pour prévenir la contamination de cellules inflammatoires avec des non-inflammatoires leucocytes circulants. Cela pourrait ne pas être une condition essentielle des infections neurotropes tels que virus de l'encéphalomyélite murine dans les cellules inflammatoires qui pénètrent dans le parenchyme cérébral 5, mais il est particulièrement pertinent dans le paludisme des rongeurs, dans laquelle les érythrocytes et les leucocytes infectés inflammatoires restent séquestrés dans les vaisseaux sanguins plutôt que de s'infiltrer dans le tissu cérébral . En conséquence, la perfusion intracardiaque de souris infectées par le paludisme ne doit pas être recommandée pour l'analyse de BSL mais pourrait être également utile pourévaluation de la séquestration du parasite des tissus 10,11. Similaire à la non-inflammatoires leucocytes circulants, les formes immatures des parasites du paludisme sont incapables d'adhérer à l'endothélium vasculaire et doivent être éliminés par la technique de perfusion. En revanche, adhérent pRBC (schizontes matures) semblent rester dans les vaisseaux sanguins du cerveau. P. berghei ANKA parasites transgéniques exprimant la luciférase ont été générés 12 et sont une ressource précieuse pour ce type d'analyse. Après l'infection avec la luciférase exprimant lignes, parasite tissu piégeage peut être déterminée par formation d'image de cerveaux perfusés provenant d'animaux infectés à l'aide d'un système IVIS 10,11. Une comparaison directe des parasites sur la séquestration 6-7 jours pi dans le cerveau des animaux perfusés et les cerveaux de souris infectées par des parasites reporter spécifiques au stade (c'est à dire exprimant la luciférase uniquement durant stade schizonte) serait utile pour une validation plus poussée de cette méthode.
Uninconvénient important des approches traditionnelles d'analyse histologique du tissu infiltrant les cellules, c'est que ces techniques ne permettent pas une évaluation des populations de cellules qui nécessitent une reconnaissance de plus d'un marqueur de cellules pour leur identification (c.-à NK1.1 + + αβTCR CD1d-restreint NKT CD4 ou + Foxp3 + cellules T régulatrices). Contrairement à l'histologie, la cytométrie en flux des leucocytes inflammatoires se prête à de multiples colorations anticorps, fournissant un outil très utile pour la caractérisation phénotypique complète des infiltrats cellulaires 7,9,13. En outre, cette méthode est assez sensible pour détecter des populations cellulaires qui se produisent à des fréquences aussi basses que 1-3% du total de s'infiltrer intravasculaire, y compris non seulement endogène, mais également les cellules adoptive transférés ainsi que des cellules T spécifiques d'antigènes. P. berghei ANKA parasites transgéniques exprimant le CMH I et CMH II-épitopes restreints d'OVA 14 + cellules T CD8 + de souris OT-I n'a pu être détectée entre BSL Ly5.2 + C57BL / 6 infectées par PbTG souris, ce qui prouve que les cellules T inflammatoires de migrer vers le cerveau réponse au paludisme sont spécifique au parasite 14.
L'analyse de BSL est également utile pour évaluer le potentiel de nouveaux traitements anti-inflammatoires dans des modèles animaux précliniques. Par exemple, la capacité des anticorps monoclonaux dirigés contre la chimiokine CXCR3 IFN-γ-protéine inductible 10 (IP-10) pour empêcher l'infiltration cerveau intravasculaire et soulager les symptômes des maladies associées au paludisme grave a été démontré avec succès l'utilisation de ceméthode 11.
Une limitation que cette méthode pourrait avoir est que le nombre total de cellules récupérées d'un cerveau individuel est généralement suffisant pour une série de colorations anticorps. Ainsi expériences distinctes pourraient être nécessaires si plus de 4-6 marqueurs cellulaires sont nécessaires pour l'analyse. En général, la procédure est facile à réaliser. La seule étape qui pourrait nécessiter une formation initiale est la perfusion intracardiaque. Quelques conseils qui pourraient être utiles pour surmonter les problèmes potentiels sont énumérés dans le tableau 1.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Mlle Liana Mackiewicz de l'assistance technique. Ce travail a été rendu possible grâce au soutien du gouvernement l'État de Victoria infrastructure opérationnelle et du gouvernement australien Santé nationale et du Conseil de recherches médicales IRIISS et de subvention de projet 1,031,212.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
