Summary
Un metodo per l'isolamento di aderenti leucociti infiammatori dai vasi sanguigni cerebrali dei
Abstract
Si descrive un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione di cellule infiammatorie aderenti da vasi sanguigni cerebrali di P. berghei ANKA topi infettati. L'infezione di ceppi sensibili del mouse con questo risultati di deformazione parassita nella induzione di sperimentale malaria cerebrale, una sindrome neurologica che riassume alcuni aspetti importanti del Plasmodium falciparum mediata da malaria grave in 1,2 esseri umani. Forme mature di sangue stadi malaria esprimere proteine parassite sulla superficie del eritrociti infetti, che consente loro di legarsi a cellule endoteliali vascolari. Questo processo induce ostruzioni del flusso sanguigno, causando ipossia e 3 emorragie e stimola anche il reclutamento di leucociti infiammatori al sito di sequestro parassita.
A differenza di altre infezioni, ad esempio virus neutrotopic 4-6, sia la malaria-parassitati globuli rossi (PRBC), così come associati inflammleucociti stre rimangono sequestrati all'interno dei vasi sanguigni e non infiltrante il parenchima cerebrale. Perciò, per evitare la contaminazione di leucociti sequestrati con cellule circolanti non-infiammatorie, ampia perfusione intracardial di topi infetti-prima dell'estrazione di organi e lavorazione dei tessuti è necessario in questa procedura per rimuovere il comparto sangue. Dopo la perfusione, i cervelli vengono raccolte e sezionati in piccoli pezzi. La struttura del tessuto è ulteriormente disturbato da trattamento enzimatico con collagenasi D e DNAsi I. L'omogenato cerebrale risultante viene poi centrifugato su un gradiente di Percoll che permette la separazione dei cervelli sequestrati leucociti (BSL) mielina e detriti da altri tessuti. Cellule isolate vengono quindi lavate, contati utilizzando un emocitometro e colorate con anticorpi fluorescenti per la successiva analisi mediante citometria a flusso.
Questa procedura consente una completa caratterizzazione fenotipica dei leucociti infiammatori migrazione al cervello in response a vari stimoli, compreso il colpo così come le infezioni virali o parassitarie. Il metodo prevede anche un utile strumento per la valutazione di nuovi trattamenti antinfiammatori in pre-clinici modelli animali.
Protocol
1. L'infezione di topi con P. berghei-ANKA
- Sbrinamento un'aliquota di crioconservati P. berghei ANKA PRBC.
- Trattenere una malaria cerebrale resistente topo BALB / c donatore (8-12 settimane di età) con la tecnica a due mani di ritenuta. Iniettare il mouse con 100-200 ml di PRBC utilizzando un insulina siringa da 1 ml (28G ago). Di routine, 1-2 topi donatori vengono iniettati.
- In 4-5 giorni post-infezione (pi) rimuovere topo donatore da gabbia e collocarla su una workstation o un tampone monouso di lavoro.
- Delicatamente frenare il mouse alla fine della coda e con le forbici piccole tagliare la punta della coda (circa 1 mm). In alternativa, una foratura piccola coda usando un ago 25 G può essere eseguita.
- Una goccia di sangue dalla vena della coda del topo in prossimità della fine di un frosted-end vetrino da microscopio.
- Posizionare una seconda slitta (spreader) su un angolo di 45 ° e sostenerlo nella goccia di sangue. Una volta che il sangue si estende lungo il bordo, premere il divaricatore-slide vigiliaolo attraverso il vetrino da microscopio per rendere la striscio di sangue. Lasciare lo striscio asciugare all'aria.
- Fissare strisci di sangue in metanolo 100% per 30 sec e poi colorare i vetrini in Giemsa appena preparato per 10 min.
- Sciacquare striscio di sangue con acqua corrente per 1 minuto, permette di asciugare vetrino ed esaminare al microscopio (100x, immersione in olio). Enumerare PRBC nel 1000 eritrociti e calcolare parassitemia per cento. Topi donatori dovrebbero raggiungere livelli parassitemia tra il 2,5-5% prima di poter essere sanguinato per infezione di animali da laboratorio.
- Raccogliere il sangue dal topo donatore da retro-orbitale sanguinamento usando un micro-ematocrito eparinizzata tubo capillare. Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità con la Sala Walter & Eliza Istituto animali previste dal Comitato Etico. A seconda delle esigenze locali animali Ethic Comitatologia sanguinamento altre potrebbero essere utilizzate. Sciogliere quantità di sangue in mezzo RPMI ad una concentrazione finale di 1x10 6 pRBC/0.2 ml. Si consideri cheun ematocrito normale mouse è ~ 6x10 9 cellule rosse del sangue / 1 ml.
- Infect C57BL sperimentale / 6 topi (8-12 settimane) iniettando per via intraperitoneale (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml.
- Per monitorare i livelli di parassitemia di topi infettati seguire i passaggi 1,3-1,8. Parassitemia deve essere determinato ogni 2-3 giorni a partire dal giorno 2 o 3 pi
- Insorgenza di malaria grave in C57BL / 6 topi potrebbe manifestarsi come aspetto ingobbito, ruffed pelliccia e bassa attività. Alcuni topi possono recuperare in questa fase, ma la progressione della perdita di auto-raddrizzante riflesso indica malattia irreversibile e gli animali devono essere sottoposti a eutanasia.
2. Perfusione Intracardial di topi e di estrazione del cervello
- Assemblare un sistema manuale di perfusione gravità assicurando un serbatoio di 500 ml di una colonna di supporto fissato alla parte superiore di una colonna di supporto 60 cm. Collegare tubo di plastica per l'estremità inferiore del serbatoio e fissare un morsetto del tubo per controllare il flusso del buffer. Collegare il tubo di un ago 23 G. Fill il serbatoio con PBS (mantenuto a 22 ° C), aprire la fascetta e permettono di eseguire tampone attraverso il tubo per rimuovere tutte le bolle d'aria.
- Eutanasia P. berghei ANKA-infetto mouse CO 2 inalazione. Confermare la morte per mancanza di pedale, orbitale e le risposte respiratorie.
- Pin del mouse eutanasia dalle zampe posteriori e anteriori dorsalmente su una tavola di dissezione di polistirolo contenute in un vassoio di plastica. A seconda del locale Comitato di Etica degli animali anestesia requisiti possono essere somministrati prima di inizio pefusion intracardial.
- Pulire lato ventrale con il 70% di etanolo.
- Usare le forbici grandi e pinze per aprire la pelle lungo la linea mediana per esporre la cavità toracica. Piegare la pelle e il pin ai lati.
- Tenere sterno con pinza sottile e tagliare il diaframma e lungo i due lati dello sterno tranciamento delle costole. Fare attenzione a non danneggiare i grandi vasi sanguigni.
- Pin la gabbia toracica dalla sterno liberamente accanto alla testa.
- Tenere spirito ventricolih pinza sottile e accuratamente incise atrio destro con le forbici sottili.
- Inserire l'ago 23G collegato al sistema di perfusione gravità in ventricolo sinistro verso l'aorta ascendente, mentre è in esecuzione PBS. Inserire solo 0,5 cm dalla punta dell'ago.
- Perfusione del mouse per 5 minuti o fino a quando effluenti è chiara.
- Sblocca il mouse e lo posi sul suo addome. Pulire la testa con il 70% di etanolo.
- Utilizzando le forbici grandi, fare un taglio appena sopra la zona cervicale del midollo spinale.
- Utilizzare le forbici pregiati per fare una mediana caudale-rostrale taglio a partire dalla base del cranio e la pelle a buccia per scoprire l'cranio.
- Tenendo la testa, posizionare le lame di una forbice piccole in ciascuna cavità orbitale ed effettuare un taglio tra le orbite.
- Praticare un taglio longitudinale lungo la sutura sagittale e con attenzione buccia il teschio su ogni emisfero del cervello verso l'esterno.
- Con una spatola, sollevare delicatamente il cervello e metterlo in una provetta da centrifuga da 10 ml contenente mezzo RPMI.
3. Isolamento di Brain-sequestrati leucociti (BSL)
- Lavorare in una cappa di sicurezza, posto appena prelevato cervello sopra un filtro in acciaio inossidabile cella (40-60 maglia) in una piastra Petri contenente 3-5 ml di mezzo di coltura RPMI tessuto.
- Tagliare il tessuto cerebrale in piccoli pezzi.
- Spingere piccoli pezzi di tessuto cerebrale attraverso il filtro cella utilizzando uno stantuffo cristallo.
- Trasferire omogenato cerebrale in una provetta da 10 ml e centrifugare a 250 xg per 10 min a 4 ° C.
- Sciogliere pellet in 3 ml di mezzo RPMI, contenente 0,05% Collagenase D e 2U/ml DNAsi I.
- Ruotare miscela per 30 min a temperatura ambiente. Rimuovere i detriti cellulari spingendo la miscela attraverso un filtro 70 micron cella nylon e / o mediante incubazione in ghiaccio per 5 min.
- Lay omogenato cerebrale su un cuscino 7 ml di Percoll 30% e centrifugare a 400 xg (senza freni) per 20 min a temperatura ambiente.
- Risospendere il pellet in 1 ml di tampone di lisi cellulare rosso sangue e incubare in ghiaccio per 5 min alisare PRBC aderente, che non può essere rimosso dal cervello mediante perfusione intracardial.
- Aggiungere 9 ml di terreno RPMI, lavare le cellule e centrifugare a 250 xg per 10 min a 4 ° C.
- Risospendere BSL contenenti pellet in 50-100 ml di mezzo RPMI e trasferire le cellule su un tubo Eppendorf.
- Diluire un'aliquota 5-10 microlitri del campione cellulare 1:2 in Trypan blu per l'identificazione di cellule vitali.
- Contare le cellule vitali al microscopio utilizzando un emocitometro. Dal giorno 6 in poi, quando pi P. berghei ANKA topi infettati mostrare segni neurologici, 20,000-100,000 BSLs possono essere recuperati.
4. Tipizzazione di BSL di Citometria a Flusso Multicolor
- Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C, aspirare il surnatante e risospendere pellet in 50 pl di tampone colorazione (PBS, 1% di siero fetale bovino (FCS), 2 mM EDTA).
- Aggiungere il 1 ml di anticorpo purificato anti-CD16/32 (Fcblock).
- Incubare le cellule per 10 min in ghiaccio.
- Lavare le cellule con 1 ml di tampone di colorazione. Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C e aspirare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 50 pl di tampone contenente colorazione diluizioni ottimali predeterminate di richieste anticorpi fluorescenti, ovvero anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR e anti-NK1.1.
- Incubare per 1 ora su ghiaccio.
- Lavare le cellule con 1 ml di tampone di colorazione. Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C e aspirare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS.
- Trasferire le cellule a un tubo di plastica di citometria a flusso.
- Utilizzando un citofluorimetro, acquisire almeno 5.000-10.000 eventi. Adeguati controlli e campioni di cellule non marcate con fluorocromi di compensazione dovrebbe essere incluso come richiesto.
- Analizzare i risultati utilizzando il software appropriato citometria a flusso.
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Representative Results
I risultati in Fig. 2 percentuali di spettacoli e di numeri assoluti delle diverse popolazioni BSL recuperati da cervelli di perfusi o unperfused topi di controllo della malaria-infettati e ingenuo. Isolato BSL sono state colorate con PE-anti-NK1.1 e APC-anti-TCR β-anticorpi, come indicato nel testo del protocollo. In linea con i risultati precedenti 7-9, αβTCR + cellule T comprende una percentuale elevata della piscina BSL nel cervello di perfusi malaria topi infettati (giorno 6 pi). Questa popolazione sembra essere significativamente sottorappresentate nel cervello di non perfusi animali (Fig. 2A-B). La riduzione apparente delle frequenze di cellule T nel non-cervelli perfusi era associato ad una percentuale notevolmente più elevata e il numero totale di cellule negative doppie (αβTCR - NK1.1 -) in questi animali (Fig. 2A-B). Alta percentuale e numeri a doppia cellule negative nel cervello unperfused non sono stati rilevati solo in topi infettati con la malaria, ma anche in na & iuml; controlli ve, suggerendo che queste cellule sono leucociti presenti in vasi sanguigni cerebrali che vengono recuperati con cellule infiammatorie perfusione intracardial se non viene eseguita non-infiammatorie.
Due ulteriori esempi di analisi BSL sono mostrati in fig. 3 e Fig. 4. Brevemente, topi C57BL / 6 sono stati infettati con P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Associazioni temporali tra reclutamento dei leucociti al cervello e l'insorgenza di sintomi neurologici (tra i giorni 6-8 pi) sono stati dimostrati in P. berghei ANKA infettato topi 7-9. In questo particolare esempio, la malaria-infettati topi sono stati sacrificati al giorno 6 pi, e la BSL sono state purificate come descritto nel testo protocollo. Isolato BSL sono state colorate con PE-anti-NK1.1, APC-anti-TCR-β, FITC-anti-CD4 e anti-PerCPCy5.5 CD8α anticorpi. I campioni sono stati acquisiti utilizzando un BD Biosciences citofluorimetro FACSCalibur e l'analisi effettuata con il software 3.0.1 Weasel. Viacellule bili sono stati gated da scatter in avanti e laterale. Le percentuali di cellule NK, linfociti T e cellule NKT (NK1.1 + TCR + cellule) sequestrati nel cervello di topi naive e malaria infetta (giorno 6 pi) sono indicati nei pannelli superiori (Fig. 3A). I pannelli inferiori mostrano percentuali di CD4 + e CD8 + linfociti T tra gated NK1.1 - αβTCR + cellule (Fig. 3A). Fig. 3B illustra un esempio in cui sono stati calcolati numero assoluto di CD4 + e CD8 + cervello sequestrati cellule T il giorno 6 pi con P. berghei ANKA. In generale, 20,000-100,000 BSL può essere recuperato da cervelli di P. berghei ANKA topi infetti. Diversi fattori quali pi tempo, sensibilità del ceppo di topo o inclusione di trattamenti antinfiammatori potrebbero influenzare il recupero delle cellule. Di routine, un cervello individuale fornisce abbastanza cellule per 1 set di colorazioni anticorpi.
Nell'esempio fornito in Fig. 4 l'uso recettore della chemochina di cervelli sequestrati linfociti T è stata analizzata. I topi sono stati infettati con P. berghei ANKA BSL e sono stati isolati su giorno 6 cellule sono state colorate con pi APC-anti-TCR-β, PE-anti-CXCR3 e-biotinilato anti-CCR5 anticorpi, seguita da incubazione con un coniugato streptavidina-PerCPCy5.5. Campioni sono stati acquisiti ed analizzati come da Fig. 3. Gli istogrammi rappresentano percentuali di cellule + αβTCR tra BSL totale in topi di controllo della malaria-infettati e ingenuo. I grafici di contorno al centro e pannelli in basso mostrano le percentuali delle CXCR3 + e + CCR5 delle cellule all'interno αβTCR gated + cellule.
Figura 1. Diagramma di flusso della procedura di isolamento e analisi di BSLda P. berghei ANKA topi infettati. (1) Una aliquota cryopreseved di P. berghei ANKA PRBC viene scongelato e 1 o 2 topi donatori sono infetti. (2) i livelli Quattro giorni più tardi parsitemia di topi donatori sono calcolati, topi donatori sono diluizioni dissanguati e sangue preparati per l'infezione di topi sperimentali. Una infezione della malaria viene poi istituito in grave malaria sensibili topi C57BL / 6. (3) Il pi 5-7 giorni, i topi vengono sacrificati da CO 2 inalazione e immediatamente intracardiaca perfusi per rimuovere tutte circolanti cellule non aderenti. (4) I cervelli sono poi raccolte ed un omogenato cerebrale preparato mediante digestione del tessuto con collagenasi D e DNasi I. BSL vengono separati dai mielina e detriti cellulari da un gradiente Percoll. (5) Precipitati BSL vengono quindi lavate, contati utilizzando un emocitometro, colorate con anticorpi fluorescenti ed analizzate al citofluorimetro.
Figura 2. Analisi BSL nel cervello di topi perfusi o unperfused. Topi C57BL / 6 sono stati infettati con P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). I cervelli sono state raccolte il giorno 6 pi da animali perfusi o unperfused. La BSL stati isolati, colorate con anticorpi anti-NK1.1 e anti-TCR fluorescente e analizzate mediante citometria a flusso. (A) dot plots rappresentano percentuali di cellule NK, linfociti T, NK1.1 + TCR + celle e doppie cellule negative NK1.1 - TCR - in perfuso (pannelli superiori) o unperfused (pannelli inferiori) topi di controllo della malaria-infettati e ingenuo . (B) Il numero assoluto di cellule negative doppie e linfociti T ed è stato calcolato il giorno 6 pi con P. berghei ANKA e topi di controllo naïve. Ogni barra representi la media di 3 campioni ± SEM, * p> 0.05.
Figura 3. Cellule NK e linfociti T può essere rilevata nel cervello di P. berghei ANKA topi infetti. Topi C57BL / 6 sono stati infettati con P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). I cervelli sono stati estratti il giorno 6 pi dopo perfusione degli animali eutanasia. La BSL stati isolati, colorate con anticorpi anti-NK1.1, anti-TCR, anti-CD4 e anticorpi fluorescenti anti-CD8 e analizzate mediante citometria a flusso. (A) Pannello superiore rappresentano percentuali di cellule NK, linfociti T e NK1.1 + TCR + cellule in topi di controllo della malaria-infettati e ingenuo. I pannelli inferiori illustrano percentuali di CD4 + e CD8 + cellule T all'interno αβTCR gated + NK1.1 - (B) Il numero assoluto di cervelli sequestrati CD4 + e CD8 + cellule T è stato calcolato il giorno 6 pi con P. berghei ANKA e topi di controllo naïve. Ogni barra rappresenta la media di tre campioni ± SEM.
Figura 4. La maggioranza dei linfociti T migrano al cervello in risposta a infezione da malaria grave esprimono il recettore della chemochina CXCR3. Topi C57BL / 6 sono stati infettati con P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). I cervelli sono stati estratti il giorno 6 pi dopo perfusione estesa degli animali eutanasia. La BSL stati isolati, colorate con anticorpi anti-TCR, anti-CXCR3 e anticorpi anti-CCR5 e analizzate mediante citometria a flusso. Pannello superiore rappresentano percentuali di αlinfociti βT nei topi di controllo della malaria-infettati e ingenuo. I grafici di contorno mostrano percentuali di CXCR3 + (pannelli centrali) e CCR5 + (pannello inferiore), le cellule all'interno di linfociti gated + αβTCR.
| Problema | Risoluzione dei problemi |
| Perfusione incompleta |
|
| Non abbastanza BSL recuperato |
|
Tabella 1.
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Discussion
L'isolamento e l'analisi di BSL è un metodo che permette la caratterizzazione e la quantificazione delle cellule infiammatorie migrazione al cervello in risposta al danno tissutale o infezione in modelli murini sperimentali. L'introduzione di una fase di perfusione intracardial per la rimozione del comparto sangue prima dell'estrazione organi e isolamento cellulare successiva è utile per prevenire la contaminazione di cellule infiammatorie con leucociti circolanti non-infiammatorie. Questo potrebbe non essere un requisito essenziale nelle infezioni neurotropici come encefalomielite murina virus in cellule infiammatorie quali penetrano nel parenchima cerebrale 5, ma è particolarmente rilevante in malaria roditore, in cui eritrociti infetti e leucociti infiammatori rimangono sequestrati all'interno dei vasi sanguigni, anziché infiltrarsi tessuto cerebrale . Di conseguenza, la perfusione intracardial della malaria topi infettati non dovrebbe essere raccomandato per l'analisi di BSL, ma potrebbe essere utile anche pervalutazione dei parassiti dei tessuti sequestro 10,11. Simile a leucociti circolanti non-infiammatorie, forme immature di parassiti della malaria sono in grado di aderire all'endotelio vascolare e deve essere rimosso dalla procedura di perfusione. Al contrario, aderente PRBC (schizonti maturi) sembrano rimanere all'interno dei vasi sanguigni del cervello. P. berghei ANKA parassiti transgeniche esprimenti luciferasi sono stati generati e 12 sono una risorsa preziosa per questo tipo di analisi. Dopo infezione con luciferasi-esprimenti linee, parassita tessuto-sequestro può essere determinata da imaging di cervelli perfusi da animali infetti utilizzando un sistema IVIS 10,11. Un confronto diretto di parassita-sequestro nei giorni 6-7 pi nel cervello di animali perfusi e cervelli di topi infettati con fase-specifici parassiti giornalista (cioè esprimere luciferasi solo in fase schizonte) sarebbe utile per un'ulteriore conferma di questo metodo.
Unoimportante inconveniente dei tradizionali approcci istologici per analisi del tessuto infiltrante cellule è che queste tecniche non consentono la valutazione delle popolazioni cellulari che richiedono il riconoscimento di più di un marcatore per l'identificazione (cioè NK1.1 + + αβTCR CD1d NKT-ristretta o CD4 + Foxp3 + T cellule regolatorie). A differenza di istologia, citometria a flusso di leucociti infiammatori è suscettibile di colorazioni anticorpi multipli, fornendo uno strumento molto utile per la completa caratterizzazione fenotipica di infiltrati cellulari 7,9,13. Inoltre, questo metodo è abbastanza sensibile per rilevare popolazioni cellulari che si verificano a frequenze partire da 1-3% del totale infiltrato intravascolare, compresi non solo endogena, ma anche cellule adoptively trasferite nonché cellule T antigene specifici. P. berghei ANKA parassiti transgenici che esprimono MHC I e MHC II-ristrette epitopi da OVA 14 + CD8 + cellule T da OT-I topi è stato possibile rilevare, tra BSL di Ly5.2 + C57BL / 6 PbTG topi infettati, fornire la prova che le cellule T infiammatorie migrazione verso il cervello in risposta alla malaria sono parassiti specifici 14.
L'analisi di BSL è anche utile per valutare il potenziale di nuovi trattamenti antinfiammatori in pre-clinici modelli animali. Per esempio, la capacità di anticorpi monoclonali contro la chemochina CXCR3 IFN-γ-inducibile proteina 10 (IP-10) per impedire l'infiltrazione intravascolare cervello e alleviare i sintomi della malattia associati con malaria grave è stata dimostrata con successo utilizzando questoMetodo 11.
Una limitazione che questo metodo può avere è che il numero totale di cellule recuperate da un cervello individuale è generalmente sufficiente per una serie di colorazioni anticorpali. Così esperimenti separati, è necessaria se più di 4-6 marcatori cellulari sono necessari per l'analisi. In generale, la procedura è facile da eseguire. L'unico passo che potrebbe richiedere un po 'di formazione iniziale è la perfusione intracardial. Alcuni suggerimenti che potrebbero essere utili per superare problemi potenziali sono elencate nella Tabella 1.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare la signorina Liana Mackiewicz per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato reso possibile grazie vittoriana sostegno governativo Infrastrutture Stato operativo e del governo australiano National Health and Medical Research Council IRIISS e Progetto di sovvenzione 1.031.212.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
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