Summary
Beyin kan damarlarının gelen yapışık inflamatuar lökositlerin izolasyonu için bir yöntem
Abstract
Biz P. beyin kan damarlarından yapışık inflamatuar hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu için bir yöntem tarif berghei ANKA-enfekte fareler. Deneysel serebral sıtma indüksiyon, bir nörolojik sendromu bu parazitin suşu sonuçlar duyarlı fare suşlarının enfeksiyonu insanlarda 1,2 Plasmodium falciparum aracılı şiddetli sıtma özetlediği bazı önemli yönleri olduğunu. Kan aşama sıtma Olgun formlar vasküler endotel hücreleri ile bağlamak sağlar enfekte eritrosit, yüzeyi üzerinde parazit proteinleri ifade eder. Bu süreç hipoksi ve kanamalar 3 sonuçlanan kan akımında engel indükler ve aynı zamanda parazit sekestrasyon sitesine inflamatuvar lökositlerin işe uyarır.
Diğer enfeksiyonlar, örneğin neutrotopic virüsler 4-6, sıtma-parazitlenmiş kırmızı kan hücreleri (pRBC) yanı sıra ilişkili yatkın aksine, hemekspirayon lökositlerin kan damarları içindeki yerine beyin parankimi infiltre daha münzevi kalır. Böylece non-inflamatuar dolaşan hücre, organ çıkarma ve doku işleme öncesi enfekte-farelerin geniş intracardial perfüzyon ile sekestre lökositlerin kirlenmesini önlemek için kan bölmesi çıkarmak için bu prosedürü gereklidir. Perfüzyon sonra, beyinleri hasat edilir ve küçük parçalar halinde disseke. Dokuların yapısı daha da oluşan beyin homojenat sonra miyelin ve diğer doku enkaz beyin sekestre lökositlerin ayrılması (BSL) sağlayan bir Percoll degrade üzerinde santrifüj edilir Kollajenaz D ve DNAz I. ile enzimatik tedavi ile bozulur. İzole hücreler daha sonra yıkanır, flow sitometri ile sonraki analiz için floresan antikorlar ile hemasitometre ve lekeli kullanılarak sayıldı.
Bu prosedür inflamatuvar lökositlerin kapsamlı fenotipik karakterizasyonu re beyin göç veriyorinme gibi viral veya paraziter enfeksiyonlar gibi çeşitli uyarılara yanıtı. Yöntemi de klinik öncesi hayvan modellerinde yeni anti-inflamatuvar tedaviler değerlendirilmesi için yararlı bir araç sağlar.
Protocol
1. P. ile Fare enfeksiyonu berghei-ANKA
- Defrost kriyoprezerve P. bir kısım berghei ANKA pRBC.
- Iki elli emniyet tekniği kullanılarak serebral sıtma dirençli BALB / c donör fare (8-12 hafta-eski) dizginlemek. Bir 1 ml insülin şırınga (28G iğne) kullanarak pRBC 100-200 ul fare enjekte. Rutin olarak, 1-2 verici farelere enjekte edilir.
- Enfeksiyon sonrası 4-5 gün hakkında (pi) kafes donör fare çıkarın ve bir iş istasyonu veya bir tek çalışma yüzeyi üzerine yerleştirin.
- Yavaşça kuyruk sonuna fare dizginlemek ve küçük makas kullanarak (yaklaşık 1 mm) kuyruk ucu kesilir. Alternatif olarak, 25 G iğne kullanılarak küçük bir kuyruk ponksiyon olabilir.
- Bir buzlu uç mikroskop lamı sonuna farenin kuyruk damarından kan bir damla yerleştirin.
- 45 ° açı ile ilgili ikinci bir slayt (yayıcı) yerleştirin ve kan damlasını içine geri. Kan kenarı boyunca yayılır sonra, serpme-slayt arifesinde itinkan yayması yapmak için mikroskop lamı üzerinde nly. Smear kurumaya bırakın.
- 10 dakika için taze hazırlanan Giemsa slaytlar leke sonra 30 sn için% 100 metanol kan smear Fix.
- 1 dakika boyunca su ile çalışan yaymada durulayın, hava-kuru izin ve mikroskop (100x, immersiyon yağı) altında slayt inceleyin. 1000 eritrositler içinde pRBC numaralandırmak ve yüzde parazitemi hesaplayabilirsiniz. Onlar deney hayvanı enfeksiyon için bled önce Donör farelerin 2.5-5% arası parazitemi düzeylerine ulaşmak gerekir.
- Bir heparinize mikro-hematokrit kapiller tüp kullanarak retroorbital kanama ile donör fare kan toplayın. Tüm deneyler Walter & Eliza Hall Institute Hayvan Etik Komitesi gereksinimleri ile uygun olarak gerçekleştirilir. Yerel Hayvan Etik Kurulu gereksinimlerine bağlı olarak diğer kanama prosedürler kullanılabilir. 1X10 pRBC/0.2 6 ml 'lik bir nihai konsantrasyon RPMI medyumu içinde kan gerekli miktarda eritilir. DüşününNormal bir fare hematokrit ~ 6x10 9 kırmızı kan hücrelerinin / 1 ml 'dir.
- Intraperitoneal (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml enjekte edilerek deneysel C57BL / 6 fareler (8-12 haftalık) Infect.
- Enfekte farelerde parazitemi düzeylerini izlemek için adımları 1.3-1.8 izleyin. Parazitemi günde 2 ya da 3 pi başlayarak 2-3 gün her bir tespit edilmesi gerekmektedir
- Fareler kambur görünümü olarak tezahür olabilir C57BL içinde / 6 şiddetli sıtma Onset, kürk ve düşük aktiviteli ruffed. Bazı fareler bu aşamada kurtarmak olabilir, ama kendini doğrulma refleksini kaybı ilerleme geri dönüşümsüz hastalık gösterir ve hayvan ötenazi gerekir.
2. Fareler ve Beyin Extraction Intracardial Perfüzyon
- Bir 60 cm kolon stand üst bağlı bir kolon için bir tutucu 500 ml rezervuar sabitleyerek bir kılavuz ağırlık perfüzyon sistemi birleştirin. Rezervuarın alt ucuna plastik boru bağlayın ve tampon akışını kontrol etmek için bir boru kelepçesi sabitleyin. Bir 23 G iğne hortumu takın. FilPBS (22 ° C'de tutulur) ile rezervuar l, kelepçe ve tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için tüp aracılığıyla çalıştırmak için tampon izin açın.
- Ötenazi P. CO 2 Solunması berghei ANKA-enfekte fare. Pedalı, orbital ve solunum tepkilerin yokluğu ölüm onaylayın.
- Dorsal bir plastik tepsi içinde bulunan bir styrofoam diseksiyon gemide arka ve ön pençeleri tarafından ötenazi fare Pin. Yerel Hayvan Etik Komitesi gereksinimleri anestezi bağlı intracardial pefusion önceden başlaması idare edilebileceği.
- % 70 etanol ile ventral tarafta silin.
- Göğüs boşluğu göstermek için orta hat boyunca cildi açmak için büyük bir makas ve forseps kullanın. Yanlarına Kıvrım ve pin cilt.
- Ince forseps ile sternumun tutun ve diyafram kesmek ve sternumun her iki yanında kaburga severing. Herhangi bir büyük kan damarlarına zarar vermemeye özen gösterin.
- Kafasına gevşek yanındaki sternum ile göğüs kafesi Pin.
- Ventriküller zekâ tutunh ince forseps ve ince makas ile dikkatlice kazımak sağ atrium.
- PBS çalışırken asendan aorta doğru sol ventrikül içine yerçekimi perfüzyon sistemine takılı 23G iğne takın. Iğne ucu sadece 0.5 cm yerleştirin.
- 5 dakika için ya da atık kadar fare serpmek açıktır.
- Ayır farenin ve karın üzerinde yatıyordu. % 70 etanol ile kafasını temizleyin.
- Büyük makas kullanarak, sadece servikal spinal kord alanı üzerinde bir kesim yapmak.
- Medyan kaudal-rostral kesim kafatası maruz uzak kafatası tabanında başlayan ve cilt soyma yapmak için ince makas kullanın.
- Başımı tutarak, her yörünge boşluğuna küçük bir makas bıçakları yerleştirin ve yörüngeleri arasında bir kesim yapmak.
- Sutur boyunca uzunlamasına kesilmiş olun ve dikkatlice dışarı doğru her beyin yarımkürede kafatası kabuğu.
- Bir spatula kullanarak, yavaşça beyin kaldırın ve RPMI medyumu içeren 10 ml santrifüj tüpüne yerleştirin.
3. Beyin-sekestre Lökosit izolasyonu (BSL)
- Bir güvenlik kabini içinde çalışarak, yerde taze RPMI doku kültür ortamı 3-5 ml içeren bir Petri kabındaki bir paslanmaz çelik hücre süzgecinden (40-60 mesh boyutu) üstüne beyin hasat.
- Küçük parçalar halinde beyin dokusu kesin.
- Bir kristal piston kullanarak hücre süzgecinden beyin dokusunun küçük parçalar bastırın.
- 4, 10 dakika boyunca 250 ° C'de xg'de 10 ml tüp ve santrifüj ile beyin Homojenat, transfer
- % 0.05 collagenase, D ve 2U/ml DNAz I içeren RPMI medyumu, 3 ml içinde çözülür pelet
- Oda sıcaklığında 30 dakika için karışım döndürün. Bir 70 mikron naylon hücre süzgecinden ve / ya da itme karışım 5 dakika süreyle buz üzerinde inkübe ederek hücre artıkları çıkarın.
- Oda sıcaklığında 20 dakika için 400 x g'da (herhangi bir fren) bir 7 ml% 30 Percoll yastık ve santrifüj üzerine beyin Homojenat yerleştirin.
- 5 dakika için buz üzerinde kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile inkübe 1 ml pelet yeniden süspanseintracardial perfüzyon beyin kaldırılır olamazdı yapışık pRBC, lyse.
- RPMI medyumu 9 mL, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 250 x g santrifüj ile hücreler yıkamak
- RPMI medyumu ile bir Eppendorf tüpü transfer hücre 50-100 ul içinde süspanse BSL içeren pelet.
- Yaşayabilir hücrelerin tanımlanması için Tripan mavi hücre örneği bir 5-10 ul alikot 1:02 seyreltin.
- Hemasitometre kullanarak mikroskop altında canlı hücreleri saymak. Günde 6 pi itibaren, P. Gönderen berghei ANKA-enfekte farelerde 20,000-100,000 BSLs telafi edilebilir, nörolojik belirtiler gösterir.
4. Multicolour akış sitometri yöntemi ile BSL immünofeotipleme
- 4, 10 dakika boyunca 250 ° C'de x g'de santrifüjleyin hücreleri, (PBS,% 1 dana fetus serumu (FCS), 2 mM EDTA) ile boyanarak 50 ul tampon içinde tekrar süspansiyon topak süpernatantı ve aspire.
- Anti-CD16/32 antikor (Fcblock) saflaştırılmış 1 ul ekle.
- 1 için hücreler inkübeBuz üzerinde 0 dk.
- Boyama Tampon 1 ml ile hücreleri yıkayın. 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin hücreleri ve süpernatan aspire.
- Gerekli floresan antikor önceden belirlenmiş en uygun seyreltmeler, yani anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR ve anti-NK1.1 ihtiva eden tampon Boyama 50 ul içinde süspanse hücreler.
- Buz üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin.
- Boyama Tampon 1 ml ile hücreleri yıkayın. 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin hücreleri ve süpernatan aspire.
- PBS içinde 100 ul hücre içinde yeniden süspanse edin.
- Bir akım sitometri plastik tüp hücreleri aktarın.
- Bir akış sitometresinin kullanarak, en az 5.000-10.000 olaylar kazanmak. Gerektiği gibi uygun boyanmamış hücre kontrolleri ve florokrom tazminat örnekleri dahil edilmelidir.
- Uygun akım sitometri yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil sonuçlanır. 2 gösteri yüzdeleri ve perfüze veya unperfused sıtma ile enfekte olmuş ve naif kontrol farelerin beyinleri kurtarıldı farklı BSL nüfus mutlak sayıları. Protokol metninde de belirtildiği gibi İzole BSL PE-anti-NK1.1 ve APC-anti-TCR-β antikorları ile boyandı. Önceki bulguları 7-9 ile uyumlu olarak, αβTCR + T hücreleri perfüze sıtma ile enfekte farelerde (günde 6 pi) ve beyinlerinde BSL havuzu yüksek oranda oluşur. Bu nüfusun önemli ölçüde (Şekil 2A-B) non-perfüze hayvanların beyinlerinde underrepresented olduğu ortaya çıktı. Bu hayvanlarda (Şekil 2A-B) non-perfüze beyin içinde T hücre frekansların bariz bir azalma önemli ölçüde daha yüksek oranda ve çift negatif hücrelerin toplam sayısı - (- NK1.1 αβTCR) ile ilişkilidir. Unperfused beyinleri double negatif hücreleri üzerinde yüksek oranda ve rakamlar değil, aynı zamanda na & iu sıtma ile enfekte farelerde yalnızca algılanan değildiml ve denetimler, bu hücreler intracardial perfüzyon yapılmadığı takdirde inflamatuar hücreler ile birlikte ele alan beyin kan damarlarındaki mevcut non-inflamatuar lökositlerin olduğunu düşündürmektedir.
BSL analiz iki başka örnekler Şekil 'de gösterilmiştir. 3 ve Şek. 4. Kısaca, C57BL / 6 fareler P. ile enfekte edildi berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Lökosit beyin işe alma ve nörolojik semptomların (günde 6-8 pi arasında) arasındaki zamansal dernekler P. ortaya konmuştur berghei ANKA fareler 7-9 etkilemiştir. Bu özel örnekte, sıtma ile enfekte olmuş fareler gün 6 pi üzerinde ötenazi edildi ve Protokol yazıda tarif edildiği gibi BSL saflaştırıldı. İzole BSL PE-anti-NK1.1, APC-anti-TCR-β, FITC-anti-CD4 ve PerCPCy5.5-anti-CD8α antikorları ile boyandı. Örnekleri Weasel 3.0.1 yazılımı kullanarak BD Biosciences FACSCalibur flowsitometri ve yapılan analizler kullanılarak elde edildi. Üzerindenble hücreleri ileri ve yan dağılım ile Geçitli vardı. NK hücreleri, T lenfositler ve NKT hücreleri (NK1.1 + TCR + hücreleri) yüzdeleri üst paneller (Şekil 3A) gösterilir naif ve sıtma ile enfekte farelerde (günde 6 pi) beyin birikir. Alt paneller CD4 yüzdeleri gösteriyor + ve Geçitli NK1.1 arasında CD8 + T lenfositleri - αβTCR + hücreler (Şekil 3A). Şek. 3B CD4 + ve CD8 + beyin sekestre T hücrelerinin mutlak sayılar P ile günde 6 pi hesaplanan edildiği bir örnek gösteriyor berghei ANKA. Genel olarak, 20,000-100,000 BSL P. beyninden elde edilebilir berghei ANKA enfekte fareler. Gibi zaman pi gibi birçok faktör, anti-inflamatuvar tedaviler fare zorlanma veya içerme duyarlılık hücre kurtarma etkileyebilir. Rutin, bir bireyin beyin antikor renklendirmeler 1 set için yeterli hücreleri içerir.
Fi verilen örnekteg. Beyin sekestre T lenfositleri 4 kemokin reseptörünün kullanımı analiz edildi. Fare P. ile enfekte edildi berghei ANKA ve BSL günde 6 pi Hücreler bir streptavidin-PerCPCy5.5 konjugat ile inkübasyonu takiben APC-anti-TCR-β, PE-anti-CXCR3 ve biyotinile anti-CCR5 antikorlar ile boyandı izole edildi. Örnekleri edinilen ve Şekil başı olarak analiz edildi. 3. Histogramlar sıtma ile enfekte olmuş ve naif kontrol farelerde toplam BSL arasında αβTCR + hücrelerin yüzdeleri temsil eder. Orta ve alt paneller kontur araziler CXCR3 yüzdeleri + ve CCR5 Geçitli αβTCR içinde + hücreleri + hücreleri gösterir.
BSL izolasyonu ve analiz prosedürü Şekil 1. Akış şemasıP. gelen berghei ANKA-enfekte fareler. P. (1) A cryopreseved alikot berghei ANKA pRBC çözüldü ve 1 ya da 2 verici fareler enfekte olmaktadır. (2) fare verici Dört gün sonra parsitemia seviyeleri verici fareler fare deneysel enfeksiyon için hazırlanmış kanatıldı ve kan dilüsyonları olarak hesaplanmaktadır. Bir sıtma enfeksiyonu ardından ağır sıtma duyarlı C57BL / 6 fareler kurulur. (3) gün 5-7 pi günü, fareler CO 2 inhalasyon tarafından ötenazi ve hemen intrakardiyak tüm dolaşımdaki yapışmaz hücreleri çıkarmak için perfüze edilir. (4) Brain sonra hasat edilir ve collagenase, D ve DNAz I BSL ile doku ile sindirimi yoluyla hazırlanmış bir beyin Homojenat daha sonra bir Percoll gradient ile miyelin ve hücre enkazları ayrılmıştır. (5) BSL sonra, yıkanmış floresan antikorlar ile boyanmış ve flow sitometri ile analiz hemasitometre kullanarak sayılır çöktürülmüş.
Şekil 2. Perfüze veya unperfused farelerin beyinlerinde BSL analizi. C57BL / 6 fareler P. ile enfekte edildi berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Brain perfüze veya unperfused hayvanlardan günde 6 pi hasat edilmiştir. BSL, izole anti-NK1.1 ve anti-TCR floresan antikorlar ile boyanmış ve akış sitometri ile analiz edildi. Sıtma ile enfekte ve naif kontrol fareler perfüze (üst panel) veya unperfused (alt panel) - TCR - (A) Nokta araziler NK hücreleri, T lenfositler, NK1.1 NK1.1 + TCR + hücreleri ve çift negatif hücrelerin yüzdeleri betimliyor . (B) Mutlak çift negatif hücreleri ve T lenfositlerin sayısını ve P. ile günde 6 pi hesaplandı berghei ANKA ve naif kontrol fareler. Her çubuk represeNTS 3 örneklerinin ortalama ± SEM, * p> 0.05.
Şekil 3. NK hücreleri ve T lenfositler P. beyinlerinde tespit edilebilir berghei ANKA enfekte fareler. C57BL / 6 fareler P. ile enfekte edildi berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Brain ötenazi hayvanların perfüzyon gün sonra 6 pi üzerine çıkarıldı. BSL anti-NK1.1, anti-TCR, anti-CD4 ve anti-CD8 floresan antikorlar ile boyanmış ve flow sitometri ile analiz, izole edildi. (A) Üst paneller NK hücreleri, T lenfositler ve sıtma ile enfekte ve naif kontrol farelerde NK1.1 + TCR + hücrelerin yüzdeleri betimliyor. Alt panel kapı αβTCR içerisinde CD4 + ve CD8 + T hücreleri + NK1.1 yüzdeleri göstermektedir - (B) beyin-sekestre CD4 mutlak sayısı + ve CD8 + T hücreleri P. ile günde 6 pi hesaplandı berghei ANKA ve naif kontrol fareler. Her çubuk 3 numune ± SEM ortalama temsil eder.
Şekil 4,. Ağır sıtma enfeksiyonuna yanıt olarak beyin göç T lenfositlerin çoğu kemokin reseptör CXCR3 ifade eder. C57BL / 6 fareler P. ile enfekte edildi berghei ANKA (1x10 6 pRBC). Brain ötenazi hayvanların geniş perfüzyon gün sonra 6 pi üzerine çıkarıldı. BSL, izole anti-TCR, anti-CXCR3 ve anti-CCR5 antikorları ile boyandı ve flow sitometri ile analiz edildi. Üst paneller α yüzdeleri betimliyorsıtma ile enfekte ve naif kontrol farelerde βT lenfositler. Kontur araziler CXCR3 + (orta panel) ve CCR5 + (alt panel) kapılanan αβTCR + lenfositlerin içindeki hücrelerin yüzdeleri göstermektedir.
| Sorun | Sorun Giderme |
| Eksik perfüzyon |
|
| Yeterince BSL kurtarıldı değil |
|
Tablo 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BSL izolasyonu ve karakterize edilmesi ve analiz deneysel fare modellerinde doku hasarı ya da enfeksiyona yanıt olarak beyin göç inflamatuar hücrelerin miktarının sağlayan bir yöntem. Organ ekstraksiyonu ve bunu izleyen hücre izolasyonu önce kan bölmesinin çıkarılması için bir intracardial perfüzyon adım giriş non-inflamatuar dolaşımdaki lökositler ile inflamatuar hücrelerin kirlenmesini önlemek için yararlıdır. Bu inflamatuar hücreler beyin parankimi 5 nüfuz hangi tür kemirgen ensefalomyelit virüs gibi nörotropik enfeksiyonlar için temel bir gereklilik olabilir, ancak enfekte eritrositler ve inflamatuar lökositler kalır kan damarları içinde tecrit ziyade beyin dokusunda infiltre edildiği, kemirgen sıtma özellikle uygundur olmayabilir . Buna göre, sıtma ile enfekte farelerde intracardial perfüzyon sadece BSL analizi için tavsiye edilmemelidir hem de yararlı olabilirparazit doku sekestrasyon 10,11 değerlendirilmesi. Non-inflamatuar dolaşan lökositlerin benzer, sıtma parazitleri olgunlaşmamış formları vasküler endotele bağlı veremiyoruz ve perfüzyon yordam tarafından çıkarılmalıdır. Buna karşılık, yapışık pRBC (olgun schizontsun) beyin kan damarları içinde kalmaya devam ettiği görülmektedir. P. lusiferaz ifade berghei ANKA transgenik parazitler 12 oluşturulmuş ve analizler bu tip değerli bir kaynaktır edilmiştir. Lusiferaz-eksprese hatları ile enfeksiyondan sonra, parazit dokusunun-haciz bir IVIS sistem 10,11 ile enfekte olmuş hayvanlardan beyinler perfüze görüntüleme ile tespit edilebilir. Farelerin perfüze hayvanlar ve beyinlerinin beyinlerinde gün 6-7 pi üzerinde parazit-sekestrasyon doğrudan karşılaştırılması aşamasında özel muhabiri parazit ile enfekte (yani sadece schizont aşamasında lusiferaz ifade) bu yöntemi daha fazla doğrulama için yararlı olacaktır.
Birianalizi için geleneksel histolojik yaklaşımların önemli dezavantajı doku infiltre eden hücreler bu tekniklerin izin vermez ki bunların belirlenmesi için birden fazla hücre belirteci (yani NK1.1 + αβTCR + CD1d kısıtlı NKT veya CD4 tanınmasını gerektiren hücre popülasyonlarının değerlendirilmesi + Foxp3 + T regülatör hücreler). Histoloji aksine, inflamatuar lökositleri akım sitometri analizi hücresel infiltratlar 7,9,13 kapsamlı fenotipik karakterizasyonu için çok yararlı bir araç sağlayarak, çoklu antikor renklendirmeler için müsait. Buna ek olarak, bu yöntem, toplam damar içi, endojen hem de adoptif transfer hücreleri hem de antijen spesifik T hücrelerin sadece dahil olmak üzere, sızmak% 1-3 kadar düşük frekanslarda ortaya çıkan hücre popülasyonu tespit etmek için yeterince hassastır. S. OVA 14 MHC-I ve MHC II-kısıtlı epitoplar ifade berghei ANKA transgenik parazitler + C57BL / 6 PbTG ile enfekte olmuş fareler Ly5.2 arasında BSL arasında tespit edilebilir OT-I farelerden alınan Ly5.1 + CD8 + T hücreleri aktarılır, burada açıklanan sıtma yanıt parazit özgü 14 vardır.
BSL analiz klinik öncesi hayvan modellerinde yeni anti-enflamatuar tedavi potansiyelinin belirlenmesi için de yararlıdır. Örneğin, beyin damar içi girmesini engellemek ve ağır sıtma ile ilişkili hastalık belirtilerini hafifletmek için, CXCR3 kemokin IFN-γ-indüklenebilir protein 10 (IP-10) karşı, monoklonal antikorlara bağlanma kapasitesi başarılı bir şekilde bu kullanılarak kanıtlanmıştıryöntemi 11.
Bu yöntem sahip olabilir ki bir sınırlama bir tek beyin elde edilen hücrelerin toplam sayısı antikor boyamalar grubu için genellikle yeterli olmasıdır. Fazla 4-6 hücre belirteçleri analizi için gerekli olup olmadığını Böylece ayrı deneylerde gerekebilir. Genel olarak, işlem yapmak için kolaydır. Bazı başlangıç eğitimi gerektirebilir tek adım intracardial perfüzyon olduğunu. Olası sorunların üstesinden gelmek için yararlı olabilir birkaç ipucu Tablo 1'de listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar teknik yardım için Bayan Liana Mackiewicz teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapısını Destekleme ve Avustralya Hükümeti Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi IRIISS ve Proje Hibe 1031212 sayesinde mümkün oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
