Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til sporing af endomembrane brud fremkaldt af de intracellulære bakterier
Abstract
Shigella flexneri er sygdomsfremkaldende bakterier, der invaderer værtsceller indgå en endocytisk vacuole. Efterfølgende brud på denne membran lukkede rum kan bakterierne bevæge sig inden for cytosolen, proliferere og yderligere invadere omkringliggende celler. Mycobacterium tuberculosis fagocyteret af immunceller, og har for nylig vist at sprænges phagosomal membran i makrofager. Vi udviklede en robust assay til sporing phagosomal membransprængning efter værtscelle indtastning af Shigella flexneri eller Mycobacterium tuberculosis. Den fremgangsmåde gør brug af CCF4, en FRET reporter følsom over for β-lactamase, der afbalanceres i cytosolen af værtsceller. Ved invasion af værtsceller ved bakterielle patogener, forbliver proben intakt, så længe bakterierne opholde sig i membran-lukkede rum. Efter afbrydelse af vakuolet, β-lactamase-aktivitet på overfladen af de intracellulære patogener spalter CCF4 straks føreING til et tab af FRET signal og skifte sin emission spektrum. Denne robuste ratiometrisk analyse giver præcise oplysninger om timingen af vacuolær brud induceret af de invaderende bakterier, og det kan kobles til automatiseret mikroskopi og billedbehandling af specialiserede algoritmer til påvisning af emissions signaler FRET donor og acceptor. Endvidere er det muligt at undersøge dynamikken i vacuolær forstyrrelser fremkaldt af intracellulære bakterier i realtid i enkelte celler. Endelig er det særdeles velegnet til high-throughput analyse med spatio-temporale opløsning end tidligere metoder. Her giver vi de eksperimentelle detaljer eksemplariske protokoller for CCF4 vakuolær brud assay på HeLa-celler og THP-1 makrofager til tidsforskudte eksperimenter eller slutpunkter eksperimenter ved hjælp af Shigella flexneri samt multiple mycobakterielle stammer, såsom Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, og Mycobacterium tuberculosis.
Introduction
Talrige bakterielle patogener internaliseres i membran-lukkede rum i eukaryote celler under deres forløb af infektion. Celleindtastning sker enten gennem fagocytose af specialiserede værtsceller, som det er tilfældet for Mycobacterium tuberculosis, der indtages af makrofager, eller patogener aktivt fremkalde deres optagelse i typisk ikke-fagocytiske celler. I tilfælde af induceret optagelse, for eksempel for Shigella flexneri patogenet tilfører effektor proteiner i værten cytosol der kapre blandt andre cellefunktioner den reguleres stramt endomembrane sortering maskiner resulterer i bakteriel lokalisering inden en endosomale rum 1,2. Efterfølgende Shigella forstyrrer den omsluttende membran fører til vakuolær briste og cytosol adgang af patogenet forstyrre host membran menneskehandel og friholde lysosomet. For nylig er fagolysosomale brud også fundet som infektion strategy brugt af Mycobacterium tuberculosis, et patogen, der var tænkt i lang tid ved udelukkende at blive lokaliseret i en membran-bundet rum 3,17.
For at undersøge dynamikken i subcellulær membran handel med invasive patogener, har store forbedringer er opnået, siden transmissions elektronmikroskopi (TEM) baseret undersøgelser af slutningen af 1980'erne 4,5. For eksempel, fluorescensmikroskopi baserede metoder ved hjælp farvestoffer antistoffer mod bakterielle overflade komponenter eller markører for co-lokalisering med subcellulære rum overtog 6,7. Men de stadig ikke give præcise Spatiotemporal opløsning og robusthed til at måle vakuolær brud ved bakterielle patogener kvantitativt.
Denne hurdle er blevet behandlet med et assay baseret på cephalosporin afledt CCF4-AM FRET reporter, der først blev anvendt til at undersøge genekspression 8.. Derefter blev det brugt i sammenhæng med inffdeling biologi til at undersøge effektor sekretion og følge optagelsen af Neisseria i værtsceller 9,10,11. Vi udviklede en analyse drage fordel af denne reporter for at studere vakuolær brud fremkaldt af Shigella flexneri 12 og Mycobacterium tuberculosis 17.. Princippet om vores fremgangsmåde er beskrevet i figur 1 under anvendelse af Shigella flexneri. Først værtsceller fyldt med FRET CCF4-AM substrat, der er fanget inde i cytoplasmaet efter fraspaltning AM estergrupper. Derefter blev celler inficeret med Shigella flexneri. β-lactamase til stede på overfladen af bakterierne er i stand til at spalte CCF4 substrat snarest vacuolær brud forekommer. Dette fører til et tab af FRET signal skifte emission top fra 535 nm til 450 nm ved excitation af sonden ved 405 nm. Den ratiometriske måling af de 450/535 nm intensiteter fremhæver vakuolær integritet: lave nøgletal afspejler membran-enlukkede eller ekstracellulære bakterier mens høje forhold afspejler kontakt mellem bakterier og værten cytosol. Vi rapporterer også en tilpasning af denne metode til at studere phagosomal brud fremkaldt af Mycobacterium tuberculosis i THP-1 makrofager. De eksperimentelle principper forbliver de samme, selv om rækkefølgen er omvendt, CCF4-AM loading kun anvendes efter bakteriel infektion.
Således ved kvantitative ratiometrisk fluorescens målinger på enkelt celle niveau, kan vakuolær brud på Shigella flexneri spores i realtid og i faste prøver fra forskellige celletyper 12,13,14. Desuden kan denne fremgangsmåde tilpasses til en række andre invasive patogener, som vist i denne undersøgelse med Mycobacterium bovis og Mycobacterium tuberculosis. Endelig miniaturisering af vores protokol til 96 godt (eller 384 brønde) formater tillader screening af en lang række forhold på high throughput.
Protocol
Analysen fungerer i forskellige formater, men vi anbefaler at reducere prøven for at spare reagenser, især CCF4-am. Derfor er følgende protokol beskrevet for faste HeLa-celler eller THP-1 makrofag-lignende celler i en 96 brønds format, så for levende HeLa-celler i 35 mm glasbund retter. Assayet kan tilpasses til andre patogener. Udover Shigella-infektion, beskriver vi analysen for THP-1 phagocytosing forskellige m y cobacterial stammer.
Vigtigere er det, efter CCF4-AM lastning, kræver, at alle reagenser og buffere, herunder vaskebuffere tilstedeværelsen af probenecid ved 1 mM. Probenecid er en anion kanal inhibitor, der fremmer cytosole tilbageholdelse af CCF4 gennem alle trin i protokollen. Faste prøver bør erhverves inden for et par timer efter eksperimentet siden CCF4 signalet ikke er stabil i lange tidsperioder.
1.. CCF4 analysen på faste prøver ved anvendelse af Shigella flexneri (96 brønde)
- Forberedelse bakterier til overnattende kulturer. Pode bakterielle præ-kulturer vildtype (M90T AfaI) og mutant (BS176 AfaI) stammer 1 dag inden infektion i 8 ml tryptisk kasein soja-bouillon (TCSB) suppleret med ampicillin (50 ug / ml) i et rysteapparat ved 37 ° C natten .
- Plating celler til infektion. Seed HeLa-celler i 96-brønds plader en dag før infektion med en tæthed på 5 x 10 3 celler per brønd i DMEM indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% penicillin-streptomycin i en 5% CO2-inkubator i en slutvolumen af 100 gl. I tilfælde af THP-1 makrofag-lignende celler, der celleudpladning gjort 2 dage før infektion med en tæthed på 5 x 10 4 celler / brønd, og de inkuberes med 30 nM phorbolmyristatacetat (PMA) i RPMI indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin og 0,05 mM 2-mercaptoethanol.
- Forberedelse bakterier til subkultur. Podes natten bakteriekulturerved en 1/100 fortynding i TCSB suppleret med 50 ug / ml ampicillin i et rysteapparat ved 37 ° C i 2,5 timer (OD600 = 0,3-0,4).
- Henter celler med CCF4-AM. Forbered CCF4-AM loading mix til et endeligt volumen på 25 pi per brønd indeholdende 1 mM probenecid (Sigma), 1,5 uM CCF4-AM (6 uM i tilfælde af THP-1) og 1,25 pi lastning opløsning B (100 mg / ml Pluronic-F127 overfladeaktivt i DMSO/0.1% eddikesyre tilvejebragt langs CCF4-AM LiveBlazer Loading Kit af Invitrogen) i EM puffer (120 mM NaCl, 7 mM KCI, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM glucose, 25 mM HEPES ved pH 7,3). Vask cellerne en gang med PBS, og der tilsættes 25 ul af CCF4-AM loading mix per brønd ved stuetemperatur i mørke i 2,5 timer.
- Forberedelse bakterier for infektion. Spin 1 ml bakterielle subkulturer ved 9.000 rpm i 1 min. Vask en gang med 500 pi PBS, centrifugering ved 9.000 rpm i 1 min og resuspender i 500 pi PBS suppleret med 10 ug / ml poly-L-lysin (Sigma) og 40 ug / ml β-lactamase (Sigma). Efter 10 min inkubation på et roterende hjul ved stuetemperatur, vaskes en gang med 500 pi PBS og resuspender bakterier i 500 pi EM puffer / 1 mM probenecid.
- Celleinfektion og fiksering. Vask cellerne en gang med 150 ul PBS / 1 mM probenecid, forberede en blanding af 10 pi af bakterier resuspenderes i et endeligt volumen på 100 ul EM puffer / 1 mM probenecid og distribuere det til hver brønd. Efter 15 minutters inkubering i mørke ved stuetemperatur, pladen skifte til 37 ° C i 1 time (90 min i tilfælde af THP-1), vaskes med 150 pi PBS / 1 mM probenecid og fastgøres med 50 pi paraformaldehyd 4% / 1 mM probenecid i 10 minutter i mørke. Derefter vaskes med 150 gl PBS / 1 mM probenecid, inkuberes i 30 min med 30 pi 10 uM kerner farvestof DRAQ5 (Biostatus), vaskes med 150 gl PBS / 1 mM probenecid og efterlade prøver i 100 pi PBS / 1 mM probenecid.
- Erhvervelse indstillinger af faste prøver. Erhvervelse udføres enten ved hjælp af (i) en inverteret epifluorescens mikroerklare en 20x (0,5 Numerisk blænde (NA), 2,1 arbejdsafstand (WD)), eller 40x (0,75 NA, 0,72 WD) N-Plan luft objektiv eller (ii) ved hjælp af en konfokal mikroskop med en 10x målsætning. Fluorescensimagografi udføres med excitation ved 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) og emissionen registreres via 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) og 535 nm filtre (Semrock, FF01-520/35- 25) ved hjælp af eksponeringstider af 5 msek (transmitteret lys), 1,000 msek (535 nm) og 500 msek (450 nm). Confocal imaging udføres ved hjælp af følgende eksponeringstid: 240 msek (450 nm) og 360 msek (535 nm) for 405 nm laser (870 pW), 640 ms (DRAQ5) til 640 nm laser (2560 pW).
- Post-opkøb analyse. Efterfølgende er billeder analyseres af en computer algoritme, der tillader automatiseret scoring af fluorescenssignalet for hver individuelle celler. Software som Metamorph 7.1 eller Acapella kan bruges til at oprette et script til at måle forholdet mellem de 450 nm og 535nm emission signaler (kan rekvireres). Det skal bemærkes, tillader anvendelsen af et fokus kalibreringsenhed koblet til automatiseret mikroskopi under erhvervelse erhverve snesevis af forskellige positioner i flere brønde på samme tid.
2.. CCF4 analysen på Live-prøver ved anvendelse af Shigella flexneri (35 mm Glas-bund Format, Mattek)
- Forberedelse bakterier til overnattende kulturer. Fortsætte som tidligere beskrevet.
- Plating celler til infektion. Seed HeLa-celler i 35 mm glasbund dyrkningsskåle (Mattek 10 mm Microwell, Mattek Corporation) 1 dag før infektion med en tæthed på 2 x 10 5 celler / skål i et slutvolumen på 2 ml.
- Forberedelse bakterier til subkultur. Fortsætte som tidligere beskrevet.
- Henter celler med CCF4-AM. Forbered CCF-AM loading blanding som tidligere beskrevet for et slutvolumen på 2 ml pr skål. Inden indlæsning vaskes cellerne en gang med PBS.
- Forberedelse bakterier for infektion. Fortsætte som tidligere beskrevet.
- Acquisition indstillinger af levende prøver. Erhvervelse udføres i 60 min hver 90 sek med et inverteret epifluorescensmikroskop med et 20x (0,5 NA, 2,1 WD) eller en 40x (0,75 NA, 0,72 WD) N-Plan luft mål inde i en 37 ° C varme kammer. Fluorescensimagografi udføres med excitation ved 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) og emissionen registreres via 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) og 535 nm filtre (Semrock, FF01-520/35- 25) ved hjælp af eksponeringstider af 5 msek (transmitteret lys), 200 ms (535 nm) og 100 msek (450 nm).
- Cell infektion og levende opkøb. Vask cellerne en gang med 2 ml PBS / 1 mM probenecid, tilsættes 2 ml EM / 1 mM probenecid, montere parabol på scenen af mikroskopet og start erhvervelsen. Efter 6 min (tid punkt 4), satte købet på hold, tilsættes 250 ul af bakterier resuspension på toppen af cellerne og genstart købet.
- Post-opkøb analyse. Film kan visualiseres ved hjælp Metamorph eller ImageJ. 450/535 nm intensitetsforholdene for hver individueldobbelt celle kan opnås ved anvendelse ImageJ. Som tidligere nævnt er anvendelsen af et fokus kalibreringsenhed koblet til automatiseret mikroskopi under erhvervelse tillader erhverve flere forskellige positioner afhængigt af time-lapse.
3.. CCF4 analysen på Faste Prøver Brug Mycobakterier (96 Well format)
- Forbereder bakterier. Grow mycobakterielle stammer til midt log-fase i 7H9 indeholdende albumin dextrose katalase (ADC) ved 30 ° C (for Mycobacterium marinum) eller 37 ° C (for Mycobacterium bovis BCG og Mycobacterium tuberculosis).
- Plating celler til infektion. Plate THP-1 makrofager 2 dage før infektion inkubere dem med 30 nM PMA i RPMI indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin og 0,05 mM 2-mercaptoethanol i en 5% CO2-inkubator i en slutvolumen på 100 pi ved en densitet på 5 x 10 4 celler / brønd.
- Forberedelse bakterier for infektion. Harvest kulturer, vaske og resuspender med PBS før sonikering og filtrering gennem en sprøjte for at undgå sammenklumpning. Bestem koncentrationen af hver stamme ved OD600 måling og inficere THP-1-celler ved en MOI på 1:1 ved 30 ° C (for Mycobacterium marinum) eller 37 ° C (for Mycobacterium bovis BCG og Mycobacterium tuberculosis) i RPMI-medium med 5% CO 2. Efter 2 timer fjernes mediet, vaskes 3 gange med PBS og tilføje fuldstændig frisk medium i 1 til 2 dage (i tilfælde af Mycobacterium marinum) eller 3 til 7 dage (i tilfælde af Mycobacterium bovis BCG og Mycobacterium tuberculosis).
- Lastning celler med CCF4-AM og fiksering. Vask cellerne en gang med PBS og forberede CCF4-AM loading blanding som tidligere beskrevet for et endeligt volumen på 25 ul pr brønd med en CCF4-AM slutkoncentration på 6 uM. Loading finder sted ved stuetemperatur i mørke i 2 timer før vask med 150 gl PBS / 1 mM probenecid og fastsættetion med 50 pi paraformaldehyd ved 4% suppleret with1 mM probenecid i 30 minutter i mørke. Derefter vaskes med 150 gl PBS / 1 mM probenecid og efterlade prøver i 100 pi PBS / 1 mM probenecid.
- Acquisition indstillinger og efter overtagelsen analyse. Fortsæt som tidligere beskrevet i første afsnit ved hjælp Shigella flexneri.
Supplerende protokol
Fluorimetrisk assays udført for at kontrollere β-lactamase-aktivitet på overfladen af bakterier. Dette bør ske for hver bakteriestamme skal anvendes i den beskrevne assay. Til dette formål er vaskede bakterier sat i kontakt med 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 ug / ml svin esterase lever ekstrakter (Sigma) i 1 ml PBS i 1 time ved 37 ° C i mørke. Opløseligt lactamase 1 mg / ml (Invitrogen) kan anvendes som en positiv kontrol. Derefter er en emission scanning udført ved 405 nm excitation ved hjælp af en PTI Quantamaster fluorimeter og en 1 ml kvartz kuvette. Tabet af FRET ved 535 nm, og fremkomsten af en høj 450 nm peak visualiseres ved bakterier over CCF4 sonde.
Representative Results
Den CCF4-AM/β-lactamase fremgangsmåde er en robust og følsom metode til sporing vacuolær brud af intracellulære patogener, såsom Shigella flexneri (figur 1). Shigella-stammer, der anvendes i denne undersøgelse betegnes M90T AfaI og BS176 AfaI. M90T AfaI er en Shigella flexneri stamme, der udtrykker adhesin AfaE, som er i stand til effektivt at binde CD55 på overfladen af epitelceller 15.. Derfor AfaE udtrykkende stammer udvise meget højere invasion evner sammenlignet med vildtype-M90T stammen i epitelceller. BS176 AfaI er en AfaE udtrykker mutant Shigella flexneri stamme blottet for Shigella virulensplasmid. Denne stamme er i stand til at invadere HeLa-celler. Alligevel denne stamme er i stand til at indtaste THP-1-celler, da optagelse i denne cellelinie stole udelukkende på klassisk fagocytose og kræver ikke en funktionel type 3 sekretion systemet. Begge stammer udtrykker β-lactamase, Og displayet β-lactamase-aktivitet på deres overflade på grund af tilstedeværelsen af AfaE koder plasmid. Ved HeLa celle infektion med non-invasiv BS176 AfaI stamme i 1 time FRET CCF4 proben forbliver intakt, som vist i figur 2A ved det grønne signal (535 nm). Tværtimod fører infektion med virulente M90T AfaI stamme i 1 time til en switch signal mod blå (450 nm), der fremhæver spaltning af proben i cytosolen. For at kvantificere denne har vi udviklet et script til Metamorph og Acapella software, der giver automatiseret påvisning af celler og måling af intensiteter i 535 og 450 nm kanaler til bestemmelse af ratiometriske signal. Som vist i figur 2B, kerner og cytosol celler segmenteres ved hjælp af DRAQ5 kanal. Derefter algoritmen er i stand til at detektere de 450 nm og 535 nm positive cellepopulationer til at beregne forholdet mellem de to intensiteter for hver enkelt celle, der errepræsenteret som et histogram i figur 2C. Lave nøgletal er opnået for mutantstammen versus høje forhold til den virulente stamme. Mens dette repræsentative infektion eksperiment blev erhvervet ved hjælp af konfokal mikroskopi, er epifluorescens mikroskopi også velegnet til denne opgave Figur 3 og 4 viser eksempler anvender 2 forskellige humane celletyper:. HeLa epitelceller og THP-1 makrofag-lignende celler. Efter infektion med virulente M90T AfaI Shigella stammen i 1 time og 90 min for HeLa-og THP-1 celler, en switch af signalet fra grøn (535 nm) til blå (450 nm) er observeret i forhold til BS176 AfaI inficerede celler (figur 3A og 4A). Scriptet vi udviklet på MetaMorph softwaren registrerer direkte CCF4 positive population af celler og beregne forholdet mellem intensiteterne i 450 og 535 nm kanaler for hver enkelte celler. Så celler er klassificeret som en funktion af deres forhold ved hjælp af en makro udvikped i Excel, hvilket således giver histogrammer viser cellen fordeling. Som det har været tilfældet for de andre script udviklet til Acapella er BS176 AfaI inficerede celler kendetegnet ved lave nøgletal, mens M90T AfaI inficerede celler vise høje forhold ved hjælp af MetaMorph algoritme på HeLa-celler og THP-1 makrofager (figur 3B og 4B) . Endelig er en tilpasning af denne fremgangsmåde til undersøgelse af mykobakterier vist i fig. 5. Mycobacterium bovis BCG bor i fagosomet for hele eksperimentets forløb, som afspejles af den stærke 535 nm signal detekteres hele tidsforløbet af forsøget. I modsætning hertil fremkalder Mycobacterium tuberculosis phagosomal membran brud i THP-1 makrofager efter mere end 3 dages infektion fremhævet af en 450 nm signal ved 7 dages infektion (figur 5A og 5B). Brug af samme algoritme som til at studere vacuolær brud af Shigella Mycobacterium tuberculosis-inficerede celler vise højere 450/535 nm forhold end Mycobacterium bovis BCG efter 7 dages infektion (figur 5C og 5D).
Figur 1. Ordning, der repræsenterer princippet om CCF4-AM/β-lactamase assay til sporing Shigella flexneri vakuolær brud. CCF4-AM frit diffunderer gennem plasmamembranen til cytoplasmaet, hvor esterdele spaltes fra ved cytosole esteraser producerer CCF4 anioner. Denne reaktion forhindrer CCF4 komme ind nogen membran indlejret rum. På dette trin, fremkalder CCF4 FRET ved 535 nm ved excitation ved 405 nm. Sonden forbliver intakt, indtil β-lactamase udtrykkende bakterier eksplodererE endocytiske vacuole. På dette trin, FRET signalet går tabt, fordi CCF4 spaltes af β-lactamase udløser et skift i emissionen fra 535 nm til 450 nm ved excitation ved 405 nm.
Figur 2. Sporing Shigella flexneri vakuolær brud hjælp af konfokal mikroskopi. (A) Efter 2 timer 30 min af CCF4-AM lastning, er HeLa celle inficeret med β-lactamase udtrykker Shigella flexneri BS176 AfaI mutant stamme eller M90T AfaI virulente stamme i 1 time og faste anvendelse af 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Derefter er kerner farves med DRAQ5 og celler afbildes med et konfokalt mikroskop med en 10x objektiv. Repræsentative billeder blev valgt med følgende sammenlagte kanaler: den intakte CCF4 sonden vises 535 nm (green), den spaltede CCF4 proben vises ved 450 nm (blå). (B) Eksempler på billeder fremhæver detektionssystem af vores automatiserede algoritme på Acapella softwaren. Segmentering af cellerne (kerner + cytosol) opnås ved hjælp af DRAQ5 kanalen. CCF4 positive celler opnås ved hjælp af de 450 og 535 nm kanaler lagt sammen. (C) Histogram viser resultatet af vores automatiserede analyse på Acapella hjælp Shigella flexneri BS176 AfaI mutant stamme eller M90T AfaI virulent stamme. Det gennemsnitlige forhold repræsenterer forholdet mellem intensiteten i de 450 og 535 nm-kanaler. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Sporing Shigella flexneri vakuolær brud i HeLa-celler ved hjælp af epifluorescens mikroskopi. (A) Efter 2 timer 30 min af CCF4-AM lastning, er HeLa-celler inficeret med β-lactamase udtrykker Shigella flexneri BS176 AfaI mutant stamme eller M90T AfaI virulente stamme i 1 time og fastgøres ved hjælp af 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Derefter bliver cellerne afbildet med et epifluorescensmikroskop med et 20x objektiv. Repræsentative billeder blev valgt med følgende kanaler:. CCF4 intakt sonde 535 nm (grøn) og CCF4 spaltede probe 450 nm (blå) (B) Histogram repræsenterer resultatet af vores automatiserede analyse på MetaMorph software. De enkelte celler er fordelt i funktion af deres forholdet mellem intensiteterne i de 450 og 535 nm kanaler.
> Figur 4. Sporing Shigella flexneri vacuolær brud i THP-1-celler ved hjælp af epifluorescens-mikroskopi. (A) Efter 2 timer 30 min på CCF4-AM loading, THP-1-celler inficeret med β-lactamase-ekspression Shigella flexneri BS176 AfaI mutantstamme eller M90T AfaI virulent stamme i 1 time 30 minutter og fast anvendelse af 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Derefter bliver cellerne afbildet med et epifluorescensmikroskop med et 20x objektiv. Repræsentative billeder blev valgt med følgende kanaler:. CCF4 intakt sonde 535 nm (grøn) og CCF4 spaltede probe 450 nm (blå) (B) Histogram repræsenterer resultatet af vores automatiseret analyse vha. MetaMorph software. De enkelte celler er fordelt i funktion af deres forholdet mellem intensiteterne i de 450 og 535 nm kanaler.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg "/>
Figur 5. Sporing Mycobacterium bovis BCG og Mycobacterium tuberculosis phagosomal brud i THP-1 makrofager hjælp epifluorescens mikroskopi. (A, B) THP-1-celler inficeret med β-lactamase udtrykker Mycobacterium bovis BCG eller Mycobacterium tuberculosis i 2 timer og dyrket i 3 til 7 dage . Efter vask celler fyldt med CCF-4-AM i 2 timer og fast anvendelse af 4% paraformaldehyd i 30 minutter før billeddannelse med et epifluorescensmikroskop med et 40x objektiv. Repræsentative billeder blev valgt med følgende kanaler: intakt CCF4 sonde, 535 nm (grøn), spaltet CCF4, probe 450 nm (blå) (C, D) histogrammer præsenterer resultatet af vores automatiserede analyse ved hjælp MetaMorph software.. Individuelle celler er fordelt som funktion af forholdet mellem intensiteten i de 450 og 535 nm kanaler.
Discussion
Den CCF4-AM/β-lactamase assayet er en enkel metode til at spore vacuolær forstyrrelser fremkaldt af intracellulær Shigella flexneri og mycobakterier i forskellige celletyper. Det gør brug af en lactamase følsom cytoplasmatisk FRET reporter, der spaltes af et enzym aktiv på overfladen af bakterierne.
Tab af CCF4-AM substrat kan let undgås ved at tilføje probenecid til alle løsninger efter lastning af underlaget. Som påvist, kan analysen tilpasses til flere celletyper (epitelceller, fagocytiske celler) og formater (96 brønde, 35 mm glasbund retter, 6/12/24 brøndsplader). Til brug for den 6/12/24 brønds plade, er sterile dækglas fordelt i bunden af hver brønd, før podning af cellerne. Ved afslutningen af forsøget, er dækglas overføres på objektglas ved montering medium, såsom Forlæng Guld antiblegemiddel Reagent (Invitrogen). Denne måde signalet er stabilt i længere tidsperioder efter assayetsammenlignet med 96 brønde format, hvor prøver opbevares i PBS efter fiksering. Den høje pris på den CCF4-AM substrat bør tages i betragtning, før bestemmelsen af prøvevolumenet. Det er derfor, vi anbefaler, opskalere dem ned. Eksperimenter er dyrere i 6/12/24 godt format, men signalerne er stabile i dagevis. Tværtimod er eksperimenter billigere i 96 brønds format, men prøver skal analyseres på dagen for eksperimentet. Det er bemærkelsesværdigt, at levende eksperimenter kan også udføres ved 96 brønd eller 384 brønde format. Dette gør det muligt at udføre levende eksperiment med snesevis af forholdene på samme tid (mutant bakterier, MOI, plasmid eller siRNA transfektion, kemikalier osv.) med antallet af positioner per brønd. Selvom velegnet til Shigella flexneri, vi understrege, at "sande" realtid eller time-lapse forsøg, der ikke er muligt for mykobakterier studier da infektionen cyklus overstiger målbare koncentrationer af CCF4 der kan tilbageholdes i cytosolen. Fordenne grund er det CCF4-AM substrat anvendt på celler efter invasionen er opnået.
I tilfælde MetaMorph software bruges til indsamling og analyse, anbefaler vi at bruge modulet "skærm køb", som giver erhverve en hel 96/384 brønde med et bestemt antal billeder per godt. Endvidere modulet "anmeldelse skærmdata" giver (i) at visualisere syet billede mosaik af hver brønd for enhver kanal på samme tid på en stor "plakat", og (ii), looping en specialiseret algoritme til at måle intensiteten i 535 og de 450 nm kanaler. Selv om vi har været i stand til at måle vakuolær brud med enkelte bakterier ved time-lapse mikroskopi, vil vi gerne advare om, at den enzymatiske aktivitet på overfladen af de enkelte bakterier varierer gør det vanskeligt præcist at korrelere antallet af intracellulære bakterier og effektiviteten af vacuolær brud.
Givet robustheden af assayet er det velegnet til hIGH gennemløb nærmer i 96 eller 384 vel formater. Vi har også med held tilpasset denne protokol for FACS-analyse til at studere infektion af celler i suspension 16. Assayet kan også anvendes til undersøgelse af andre bakterier eller bærere præsenterer lactamase på deres overflade, hvilket fører til en lang række applikationer. For eksempel kan denne fremgangsmåde anvendes til at studere vacuolær brud fremkaldt af andre patogener, såsom β-lactamase udtrykker Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes eller Salmonella typhimurium 12. Da Listeria monocytogenes har en kort infektion cyklus kan sammenlignes med Shigella flexneri, time-lapse eksperimenter er mulige. I modsætning hertil Legionella pneumophila og Salmonella typhimurium display lange infektion cyklusser, fordi vi foreslår at udføre slutpunkt eksperimenter.
De mange forskellige mulige anvendelser gør CCF4-AM/β-lactamase assay eninteressant fluorometrisk metode til sporing vakuolær brud fremkaldt af intracellulære patogener i faste prøver, eller i realtid.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Agence Nationale pour la Recherche og Det Europæiske Forskningsråd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in - 80 ° aliquots |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
| μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecid | Sigma | P8761 | |
| β-lactamase | Sigma | P0389 |
References
- van der Goot, F. G., Gruenberg, J. Intra-endosomal membrane traffic. Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).
- Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation. Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).
- van der Wel, N., et al. M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell. 129, 1287-1298 (2007).
- Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51, 461-469 (1986).
- Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).
- Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).
- Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles. Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).
- Zlokarnik, G., et al. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science. 279, 84-88 (1998).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).
- Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability. Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).
- Ray, K., et al. Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time. Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).
- Blocker, A., et al. The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes. J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).
- Mounier, J., et al. The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells. PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).
- Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).
- Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry. Virulence. 2, 54-57 (2011).
- Simeone, R., et al. Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).
