Summary
Vi beskriver en metod för att spåra endomembrane bristning som framkallas av de intracellulära bakterierna
Abstract
Shigella flexneri är patogena bakterier som invaderar värdceller ingå ett endocytic vacuole. Därefter låter bristning av detta membran-sluten avdelning bakterier att flytta inom cytosolen, föröka sig och dessutom invadera angränsande celler. Mycobacterium tuberculosis är fagocyteras av immunceller, och har nyligen visats att brista phagosomal membran i makrofager. Vi utvecklade en robust analys för att spåra phagosomal membransönderdelning efter värdcell inträde Shigella flexneri eller Mycobacterium tuberculosis. Metoden använder sig av CCF4, en FRET reporter känsliga för β-laktamas som jämvikt i cytosolen av värdceller. Efter invasion av värdceller av bakteriella patogener, förblir proben intakt så länge som bakterier bor i membran-slutna fack. Efter avbrott i vakuolen, β-laktamasaktivitet på ytan av de intracellulära patogener klyver CCF4 omedelbart ledaning till en förlust av FRET signal och byter dess emissionsspektrum. Denna robusta ratiometrisk analys ger korrekt information om tidpunkten för vakuolär bristning inducerad av de invaderande bakterier, och det kan kopplas till automatiserad mikroskopering och bildbehandling av specialiserade algoritmer för detektering av utsläpp signaler FRET givare och mottagare. Vidare medger det undersöker dynamiken i vakuolär störningar som framkallas av intracellulära bakterier i realtid i enstaka celler. Slutligen, är det perfekt för high-throughput analys med en spatio-tidsupplösning än tidigare metoder. Här ger vi de experimentella detaljer i exemplifierande protokoll för CCF4 vakuolär bristning analys på HeLa-celler och THP-1 makrofager för tidsförlopp experiment eller slutpunkter experiment med Shigella flexneri liksom flera mykobakteriestammar såsom Mycobacterium Marinum Mycobacterium bovis, och Mycobacterium tuberculosis.
Introduction
Många bakteriella patogener internaliseras i membran-slutna avdelningar av eukaryota celler under loppet av infektion. Cell inträde sker antingen genom fagocytos av specialiserade värdceller, vilket är fallet för Mycobacterium tuberculosis som intas av makrofager, eller patogenerna aktivt inducera deras upptagning i typiskt icke-fagocytiska celler. I fallet med inducerat upptag, exempelvis för Shigella flexneri, injicerar den patogen effektor proteiner i den mottagande cytosolen som kapa bland andra cellfunktioner den hårt reglerade endomembrane sortering maskiner resulterar i bakteriell lokalisering inom en endosomala utrymmet 1,2. Därefter Shigella stör omslutande membranet leder till vakuolär bristning och cytosolisk åtkomst av patogenen störa värd membran människohandel och undvika leverans till lysosomen. På senare tid har phagolysosomal bristning också funnit som infektion strategy används av Mycobacterium tuberculosis, en patogen som var tänkt för en lång tid att vara uteslutande lokaliserade inom en membranbundna fack 3,17.
För att undersöka dynamiken i subcellulära membran handel med invasiva patogener, har stora förbättringar uppnåtts sedan transmissionselektronmikroskopi (TEM) baserade studier av det sena 1980-talet 4,5. Till exempel, fluorescensmikroskopiska metoder använder färgämnen, tog antikroppar mot bakteriella ytkomponenter, eller markörer för samlokalisering med subcellulära fack över 6,7. Men de fortfarande inte ger exakt Spatiotemporal upplösning och robusthet för att mäta vakuolär bristning av bakteriella patogener kvantitativt.
Detta hinder har behandlats med en analys baserad på cefalosporin härledda CCF4-AM FRET reporter som först användes för att studera genuttryck 8. Därefter användes det inom ramen för infvsnitt biologi att undersöka effek-sekretion och att följa upptaget av Neisseria i värdceller 9,10,11. Vi utvecklade en analys att dra nytta av detta reporter för att studera vakuolär bristning inducerad av Shigella flexneri 12 och Mycobacterium tuberculosis 17. Principen för vår metod beskrivs i figur 1 med användning av Shigella flexneri. Först värdceller laddas med FRET CCF4-AM substrat som är instängd i cytoplasman efter klyvning av AM-estergrupper. Därefter, celler infekterade med Shigella flexneri. β-laktamas närvarande på ytan av bakterierna är i stånd att klyva CCF4 substratet så snart som vakuolär detta skulle inträffa. Detta leder till en förlust av FRET signalen som kastar emissionstoppen från 535 nm till 450 nm vid excitering av sonden, vid 405 nm. Den ratiometrisk mätningen av 450/535 nm intensiteter belyser vakuolär integritet: låga förhållanden avspeglar membran-enslutna eller extracellulära bakterier medan höga förhållanden avspeglar kontakt mellan bakterier och värd cytosolen. Vi rapporterar också en anpassning av denna metod för att studera phagosomal bristning inducerad av Mycobacterium tuberculosis i THP-1 makrofager. De experimentella principer förblir desamma även om sekvensen är omvänd, CCF4-AM belastningen påförs endast efter bakterieinfektion.
Således, genom kvantitativa ratiometrisk fluorescensmätningar på enskild cellnivå, kan vakuolär bristning av Shigella flexneri spåras i realtid och i fasta prover från olika celltyper 12,13,14. Dessutom kan denna metod anpassas till ett antal andra invasiva patogener, såsom visas i denna studie med hjälp av Mycobacterium bovis och Mycobacterium tuberculosis. Slutligen tillåter miniatyrisering av våra protokoll till 96 väl (eller 384 väl) format screening av många förhållanden med hög genomströmning.
Protocol
Analysen fungerar i olika format, men vi rekommenderar att skala ner provets volym att spara reagenser, särskilt CCF4-AM. Därför skall följande protokoll som beskrivits för fasta HeLa celler eller THP-1 makrofag-liknande celler i en 96-brunnars format, sedan för levande HeLa-celler i 35 botten mm glasskålar. Analysen kan anpassas för andra patogener. Förutom Shigella infektion beskriver vi analysen för THP-1 phagocytosing olika m y cobacterial stammar.
Viktigt efter CCF4-AM lastning, alla reagenser och buffertar inklusive tvättbuffertar kräver närvaro av probenecid vid 1 mM. Probenecid är en anjon kanal inhibitor som främjar cytosolisk behålla CCF4 genom alla stegen i protokollet. Fasta prover bör förvärvas inom några timmar efter försöket eftersom CCF4 signalen inte är stabil under långa tidsperioder.
Ett. CCF4 analys på fasta prover med Shigella flexneri (96 brunnars plattor)
- Förbereda bakterier för övernattning kulturer. Inokulera de bakteriella pre-kulturer vildtyp (M90T AfaI) och mutant (BS176 AfaI) stammarna en dag före infektion i 8 ml tryptisk kasein sojabuljong (TCSB) kompletterad med ampicillin (50 | ig / ml) i en skakapparat vid 37 ° C över natten .
- Plating celler för infektion. Seed HeLa-celler i 96 brunnars plattor en dag före infektion vid en densitet av 5 x 10 3 celler per brunn i DMEM innehållande 10% fetalt kalvserum (FCS) och 1% penicillin-streptomycin i en 5% CO2 inkubator i en slutlig volym av 100 | il. I fallet med THP-1 makrofagliknande celler, är cell plätering gjort två dagar innan infektion vid en densitet av 5 x 10 4 celler / brunn, och de inkuberas med 30 nM forbolmyristatacetat (PMA) i RPMI innehållande 10% fetalt kalvserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin och 0,05 mM 2-merkaptoetanol.
- Förbereda bakterier för subkultur. Ympa natten bakteriekulturervid en 1/100 utspädning i TCSB kompletterat med 50 | ig / ml ampicillin, i en skakapparat vid 37 ° C under 2,5 h (OD600 = 0,3 till 0,4).
- Laddar celler med CCF4-AM. Förbered CCF4-AM lastning mix för en slutlig volym av 25 ul per brunn innehållande 1 mM probenecid (Sigma), 1,5 | iM CCF4-AM (6 uM i fallet med THP-1) och 1,25 pl av lastning lösning B (100 mg / ml Pluronic-F127-ytaktivt medel i DMSO/0.1% ättiksyra anordnad längs CCF4-AM LiveBlazer Laddar Kit av Invitrogen) i EM-buffert (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM glukos, 25 mM HEPES vid pH 7,3). Tvätta cellerna en gång med PBS och tillsätt 25 pl av CCF4-AM lastning mix per brunn vid rumstemperatur i mörker under 2,5 timmar.
- Förbereda bakterier för infektion. Spin 1 ml av bakteriella subkulturer vid 9000 rpm under 1 min. Tvätta en gång med 500 pl PBS, centrifugera vid 9000 rpm under 1 min och återsuspendera i 500 | il PBS kompletterad med 10 | ig / ml poly-L-lysin (Sigma) och 40 | ig / ml β-LACTAmase (Sigma). Efter 10 min av inkubation på ett roterande hjul vid rumstemperatur, tvätta en gång med 500 | il PBS och återsuspendera bakterier i 500 | il buffert EM / 1 mM probenecid.
- Cellinfektion och fixering. Tvätta cellerna en gång med 150 | il PBS / 1 mM probenecid, förbereda en blandning av 10 pl av bakterier återsuspenderades i en slutlig volym av 100 | il av EM buffert / 1 mM probenecid och distribuera den till varje brunn. Efter 15 min inkubation i mörker vid rumstemperatur, växla plattan till 37 ° C under 1 h (90 min i fallet med THP-1), tvätta med 150 pl PBS / 1 mM probenecid och fäst med 50 | il paraformaldehyd 4% / 1 mM probenecid under 10 min i mörker. Sedan, tvätta med 150 l PBS / 1 mM probenecid, inkubera i 30 minuter med 30 ^ 10 ^ M kärnor färgämne DRAQ5 (Biostatus), tvätta med 150 l PBS / 1 mM probenecid och lämna prover i 100 l PBS / 1 mM probenecid.
- Förvärv inställningar för fasta prover. Acquisition utförs antingen med användning av (i) en inverterad epifluorescence microsklara en 20x (0,5 numerisk bländare (NA), 2,1 Working Avstånd (WD)) eller 40x (0,75 NA, 0,72 WD) N-Plan luft objektiv eller (ii) använder en konfokalmikroskop med ett 10x objektiv. Fluorescens avbildning utförs med excitation vid 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) och utsläpp upptäcks via 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) och 535 nm filter (Semrock, FF01-520/35- 25) med användning av exponeringstider av 5 msec (transmitterat ljus), 1000 msek (535 nm) och 500 msek (450 nm). Konfokal imaging utförs med hjälp av följande exponeringstid: 240 msek (450 nm) och 360 msek (535 nm) för 405 nm laser (870 iW), 640 ms (DRAQ5) för 640 nm laser (2560 iW).
- Post-förvärvsanalys. Därefter bilderna analyseras av en dator algoritm som möjliggör automatiserad scoring av fluorescens signalen för varje enskilda celler. Programvara såsom metamorfa 7.1 eller Acapella kan användas för att skapa ett skript för att mäta förhållandet mellan 450 nm och 535nm utsläpp signaler (tillgänglig på begäran). Av notera, tillåter användning av ett fokus kalibrering anordning kopplad till automatiserad mikroskopering vid förvärvet förvärva dussintals olika positioner i flera brunnar samtidigt.
2. CCF4 analys på Live prover med Shigella flexneri (35 mm glas-bottom Format, MatTek)
- Förbereda bakterier för övernattning kulturer. Fortsätt som tidigare beskrivits.
- Plating celler för infektion. Seed HeLa-celler i 35 mm odlingsskålar glas botten rätter (MatTek 10 mm Microwell, MatTek Corporation) en dag före infektion vid en densitet av 2 x 10 5 celler / skål i en slutlig volym av 2 ml.
- Förbereda bakterier för subkultur. Fortsätt som tidigare beskrivits.
- Laddar celler med CCF4-AM. Förbered CCF-AM lastning mix som tidigare beskrivits för en slutlig volym av 2 ml per fat. Före lastning, tvätta cellerna en gång med PBS.
- Förbereda bakterier för infektion. Fortsätt som tidigare beskrivits.
- Acquisition inställningar av levande prover. Förvärvet sker i 60 min varje 90 sekunder med ett inverterat epifluorescensmikroskop med en 20x (0,5 NA 2,1 WD) eller en 40x (0,75 NA, 0,72 WD) N-Plan luft mål inne i en 37 ° C värmeskåpet. Fluorescens avbildning utförs med excitation vid 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) och utsläpp upptäcks via 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) och 535 nm filter (Semrock, FF01-520/35- 25) med användning av exponeringstider av 5 msec (transmitterat ljus), 200 ms (535 nm) och 100 ms (450 nm).
- Cellinfektion och levande förvärvet. Tvätta cellerna en gång med 2 ml PBS / 1 mM probenecid, tillsätt 2 ml av EM / 1 mM probenecid, montera skålen på scenen av mikroskopet och starta förvärvet. Efter 6 min (tid punkt 4), satte förvärvet på is, tillsätt 250 l av bakterier resuspension på toppen av cellerna och starta förvärvet.
- Post-förvärvsanalys. Filmer kan visualiseras med hjälp av metamorfa eller ImageJ. 450/535 nm intensitetsförhållanden för varje enskilddubbla cell kan erhållas med ImageJ. Som tidigare nämnts, tillåter användning av ett fokus kalibrering anordning kopplad till automatiserad mikroskopering vid förvärvet förvärva flera olika positioner beroende på den tid som förflutit.
Tre. CCF4 analys på fasta prover med Mykobakterier (96 brunnsformat)
- Förberedelser bakterier. Grow mykobakteriestammar till mid-log-fas i 7H9 innehållande albumin dextros katalas (ADC) vid 30 ° C (för Mycobacterium Marinum) eller 37 ° C (för Mycobacterium bovis BCG och Mycobacterium tuberculosis).
- Plating celler för infektion. Plate THP-1 makrofager 2 dagar före infektion inkubera dem med 30 nM PMA i RPMI innehållande 10% fetalt kalvserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin och 0,05 mM 2-merkaptoetanol i en 5% CO2 inkubator i en slutlig volym av 100 | il vid en densitet av 5 x 10 4 celler / brunn.
- Förbereda bakterier för infektion. Harvest kulturer, tvätta och återsuspendera med PBS före sonikering och filtrering genom en spruta för att undvika klumpbildning. Bestäm koncentrationen av varje stam av OD600 mätning och infektera THP-1 celler vid ett MOI på 1:1 vid 30 ° C (för Mycobacterium Marinum) eller 37 ° C (för Mycobacterium bovis BCG och Mycobacterium tuberculosis) i RPMI-medium med 5% CO 2. Efter 2 timmar, ta bort medium, tvätta 3 gånger med PBS och tillsätt fullständigt färskt medium i 1 till 2 dagar (i fallet med Mycobacterium Marinum) eller 3 till 7 dagar (i fallet med Mycobacterium bovis BCG och Mycobacterium tuberculosis).
- Laddar celler med CCF4-AM och fixering. Tvätta cellerna en gång med PBS och förbereda CCF4-AM lastning mix som tidigare beskrivits för en slutlig volym av 25 ul per brunn med användning av en CCF4-AM slutlig koncentration av 6 uM. Loading sker vid rumstemperatur i mörker under 2 h före tvättning med 150 pl PBS / 1 mM probenecid och fixaation med användning av 50 | il paraformaldehyd vid 4% kompletterat With1 mM probenecid under 30 min i mörker. Sedan, tvätta med 150 l PBS / 1 mM probenecid och lämna prover i 100 l PBS / 1 mM probenecid.
- Förvärv inställningar och efter förvärvsanalys. Fortsätt som tidigare beskrivits i den första punkten med Shigella flexneri.
Supplemental protokoll
Fluorimetriska analyser utförs för att kontrollera β-laktamas aktivitet vid ytan av bakterier. Detta bör göras för varje bakteriestam avsedd att användas i den beskrivna analysen. För detta ändamål är tvättade bakterier i kontakt med 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 | ig / ml porcina esteras extrakt lever (Sigma) i 1 ml PBS under 1 h vid 37 ° C i mörker. Löslig laktamas 1 mg / ml (Invitrogen) kan användas som en positiv kontroll. Därefter ett utsläpp avsökning utförs vid 405 nm excitation med användning av en PTI Quantamaster fluorimeter och en 1 ml quartz kyvett. Förlusten av FRET vid 535 nm, och uppkomsten av en hög 450 nm topp visualiseras på bakterier utöver CCF4 sonden.
Representative Results
Den CCF4-AM/β-lactamase tillvägagångssätt är en robust och känslig metod för att spåra vakuolär ruptur av intracellulära patogener såsom Shigella flexneri (Figur 1). De Shigella-stammar som används i denna studie betecknas M90T AfaI och BS176 AfaI. M90T AfaI är en Shigella flexneri stam som uttrycker adhesinet AfaE, som har förmåga att effektivt binda CD55 på ytan av epitelceller 15. Därför AfaE uttryckande stammar visar mycket högre invasion förmågor jämfört med vildtyp M90T stam i epitelceller. BS176 AfaI är en AfaE uttrycker mutant Shigella flexneri stam saknar den Shigella virulensplasmiden. Denna stam är oförmögen att invadera HeLa-celler. Trots denna stam kan komma in THP-1 celler eftersom upptag i denna cellinje förlita sig enbart på klassisk fagocytos och inte kräver en funktionell typ 3 sekretion systemet. Båda stammarna uttrycker β-laktamas, Och visa β-laktamasaktivitet på sin yta på grund av närvaron av AfaE kodande plasmid. Upon HeLa-cell-infektion med den icke-invasiv BS176 AfaI stam för en timme, den CCF4 FRET proben förblir intakt, såsom visas i fig. 2A av den gröna signalen (535 nm). Tvärtom leder infektion med den virulenta M90T AfaI stam för en timme till en omkopplare av signal mot blått (450 nm) belysa klyvningen av sonden i cytosolen. För att kvantifiera detta, utvecklade vi ett skript för Metamorph och Acapella programvara som möjliggör automatiserad detektion av celler och mätning av intensiteter i 535 och 450 nm kanaler för bestämning av ratiometrisk signalen. Såsom visas i figur 2B, kärnor och cytosolen hos celler segmenteras med hjälp av DRAQ5 kanalen. Sedan, är algoritmen kapabel att detektera de 450 nm och de 535 nm positiva cellpopulationer för beräkning av förhållandet mellan de två intensiteterna för varje enskild cell som ärrepresenteras som ett histogram i figur 2C. Låga förhållanden erhålls för mutantstammen kontra höga förhållanden för virulenta stammen. Även denna representativa infektion experiment förvärvades hjälp konfokalmikroskopi är epifluorescensmikroskopi även lämpad för denna uppgift Figurerna 3 och 4 visar exempel använder två olika humana celltyper:. HeLa epitelceller och THP-1-makrofag-liknande celler. Vid infektion med virulenta M90T AfaI Shigella-stam i 1 timme och 90 min för HeLa och THP-1-celler, en switch av signal från grönt (535 nm) till blått (450 nm) observeras jämfört med BS176 AfaI infekterade celler (Fig. 3A och 4A). Skriptet vi utvecklat på metamorfa programvara detekterar direkt CCF4 positiv population av celler och beräkna förhållandet mellan intensiteterna i 450 och 535 kanaler nm för varje enskilda celler. Då celler klassificeras som en funktion av deras graden med ett makro utvecklatped i Excel, vilket ger histogram som visar cellens distributionen. Eftersom det har varit fallet för andra script som utvecklats för Acapella, är BS176 AfaI infekterade celler kännetecknas av låga förhållanden, medan M90T AfaI infekterade celler visar höga förhållanden med hjälp av metamorfa algoritmen på HeLa-celler och THP-1 makrofager (figurerna 3B och 4B) . Slutligen, är en anpassning av denna metod för studier av mykobakterier som visas i figur 5. Mycobacterium bovis BCG bosatt i phagosome för hela kursen av experimentet, vilket framgår av den starka 535 nm detekteras under tidsförloppet av experimentet. Däremot framkallar Mycobacterium tuberculosis phagosomal membran bristning i THP-1 makrofager efter mer än 3 dagar av infektion som markeras med en 450 nm-signal vid 7 dagars infektion (Figur 5A och 5B). Med samma algoritm som för att studera vakuolär ruptur av Shigella Mycobacterium tuberculosis-infekterade celler visar högre 450/535 nm förhållanden än Mycobacterium bovis BCG efter 7 dagar av infektion (figur 5C och 5D).
Figur 1. Scheme representerar principen om CCF4-AM/β-lactamase analysen för att spåra Shigella flexneri vakuolär bristning. CCF4-AM fritt diffunderar genom plasmamembranet till cytoplasman där esterenheter klyvs bort av cytosoliska esteraser producerar CCF4 anjoner. Denna reaktion förhindrar CCF4 från att komma in varje membran inbäddade facket. Vid detta steg framkallar CCF4 FRET vid 535 nm vid excitering vid 405 nm. Sonden förblir intakt tills β-laktamasproducerande uttryckande bakterier rupturE det endocytic vacuole. Vid detta steg den FRET-signalen går förlorad eftersom CCF4 klyvs av β-laktamas utlöser en omkopplare i emission från 535 nm till 450 nm vid excitering vid 405 nm.
Figur 2. Spårning Shigella flexneri vakuolär bristning hjälp konfokalmikroskopi. (A) Efter 2 tim 30 min av CCF4-AM lastning, är HeLa cell infekterad med β-laktamas uttrycker Shigella flexneri BS176 AfaI mutant stam eller M90T AfaI virulent stam under 1 timme och fasta användning av 4% paraformaldehyd under 10 min. Därefter kärnor färgas med DRAQ5 och celler avbildas med en konfokalmikroskop med ett 10x objektiv. Representativa bilder valdes med följande sammanslagna kanaler: den intakta CCF4 proben visas vid 535 nm (Green), visas den kluvna CCF4 sonden vid 450 nm (blå). (B) Exempel på bilder som belyser upptäckande av vårt automatiska algoritmen på Acapella programvaran. Segmentering av cellerna (kärnor + cytosolen) erhålls med hjälp av DRAQ5 kanalen. CCF4 positiva celler erhålls med hjälp av de 450 och 535 nm kanaler sammanförs. (C) Histogram som visar resultatet av vår automatiserad analys på Acapella med Shigella flexneri BS176 AfaI mutant stam eller M90T AfaI virulent stam. Genomsnittlig kvot representerar förhållandet mellan intensiteten i 450 och 535 nm kanaler. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Tracking Shigella flexneri vakuolär bristning i HeLa-celler med användning av epifluorescensmikroskopi. (A) Efter 2 h 30 min av CCF4-AM lastning, är HeLa-celler infekterade med β-laktamas uttryckande Shigella flexneri BS176 AfaI mutantstam eller M90T AfaI virulent stam under 1 h och fixeras med 4% paraformaldehyd under 10 min. Därefter, celler avbildas med ett epifluorescensmikroskop med en 20x objektiv. Representativa bilder valdes med följande kanaler:. CCF4 intakt prob 535 nm (grön) och CCF4 kluvna sond 450 nm (blått) (B) Histogram representerar resultatet av vår automatiserad analys på metamorfa programvara. De enskilda cellerna är fördelade i funktion av deras förhållande mellan intensiteterna i 450 och 535 nm kanaler.
> Figur 4. Spårning Shigella flexneri vakuolär bristning i THP-1 celler med epifluorescensmikroskopi. (A) Efter 2 tim 30 min av CCF4-AM lastning, THP-1 celler infekterade med β-laktamas uttrycker Shigella flexneri BS176 AfaI mutant stam eller M90T AfaI virulent stam för 1 tim 30 min och fixeras med 4% paraformaldehyd under 10 min. Därefter, celler avbildas med ett epifluorescensmikroskop med en 20x objektiv. Representativa bilder valdes med följande kanaler:. CCF4 intakt prob 535 nm (grön) och CCF4 kluvna sond 450 nm (blått) (B) Histogram representerar resultatet av vår automatiserad analys med hjälp av metamorfa programvara. De enskilda cellerna är fördelade i funktion av deras förhållande mellan intensiteterna i 450 och 535 nm kanaler.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg "/>
Figur 5. Tracking Mycobacterium bovis BCG och Mycobacterium tuberculosis phagosomal bristning i THP-1 makrofager med användning epifluorescensmikroskopi. (A, B) THP-1-celler infekteras med β-laktamas uttryckande Mycobacterium bovis BCG eller Mycobacterium tuberculosis under 2 timmar och odlades under 3 till 7 dagar . Efter tvättning celler laddade med CCF-4-AM för 2 timmar och fixeras med 4% paraformaldehyd under 30 min före avbildning med ett epifluorescensmikroskop med en 40x mål. Representativa bilder valdes med följande kanaler: intakt CCF4 probe, 535 nm (grön), kluvna CCF4, probe 450 nm (blått) (C, D) Histogram presentera resultatet av vår automatiserad analys med hjälp av metamorfa programvara.. Individuella celler är fördelade som funktion av förhållandet mellan intensiteten i 450 och 535 nm kanaler.
Discussion
Den CCF4-AM/β-lactamase-analysen är en enkel metod för att spåra vakuolär störningar som induceras av intracellulära Shigella flexneri och mykobakterier i olika celltyper. Den använder sig av en laktamas känslig cytoplasmatisk FRET reporter som klyvs av ett enzym aktivt på ytan av bakterierna.
Förlust av CCF4-AM substrat kan lätt undvikas genom att lägga probenecid till alla lösningar efter laddning av substratet. Såsom visats, kan analysen anpassas till flera celltyper (epitelceller, fagocytiska celler) och format (96 väl, 35 mm glas botten rätter, 6/12/24 brunnar). För användning av den 6/12/24 brunnar används sterila täckglasen fördelade på botten av varje brunn innan sådd av cellerna. Vid slutet av experimentet, är täckglasen överfördes på bilderna i monteringsmedium, såsom Förläng Gold antifade reagens (Invitrogen). Detta sätt att signalen är stabil under längre tidsperioder efter analysenjämfört med 96 brunnar format där prover bevaras i PBS efter fixering. Den höga kostnaden för den CCF4-AM substrat bör beaktas innan bestämning av prowolymen. Det är därför vi rekommenderar att skala ner dem. Experiment är dyrare i 6/12/24 väl format, men signalerna är stabila i flera dagar. Tvärtom experiment är billigare i 96 brunnsformat, men prover måste undersökas på den dagen för experimentet. Det är anmärkningsvärt att levande experiment även kan utföras vid 96 bra eller 384 bra format. Detta låter utföra levande experiment med dussintals villkor samtidigt (muterade bakterier, MOI, plasmid eller siRNA transfektion, kemikalier etc.) med antalet positioner per brunn. Även lämpad för Shigella flexneri, markerar vi att "true" realtid eller tidsförlopp experiment är inte möjligt för mykobakterier studier eftersom infektionen cykeln överskrider mätbara koncentrationer av CCF4 som kan behållas i cytosolen. Fördenna anledning är det CCF4-AM substrat appliceras på celler endast efter invasion uppnås.
I fallet metamorfa programvara används för insamling och analys, rekommenderar vi att du använder modulen "skärm förvärv" som gör att förvärva en hel 96/384 brunnar med ett visst antal bilder per brunn. Vidare modulen "Granskningsskärmen uppgifter" gör (i) att visualisera sydda bilden mosaik av varje brunn för varje kanal samtidigt på en stor "affisch" och (ii) looping en specialiserad algoritm för att mäta intensiteten i 535 och de 450 nm kanaler. Även om, har vi kunnat mäta vakuolär bristning av enskilda bakterier med tidsförlopp mikroskopi, vill vi varna för att den enzymatiska aktiviteten på ytan av enskilda bakterier varierar vilket gör det svårt att exakt korrelera antal intracellulära bakterier och effektivitet vakuolär bristning.
Med tanke på robustheten i analysen, är det lämpligt för high genomströmning närmar på 96 eller 384 och format. Vi har också framgångsrikt anpassat detta protokoll för FACS-analys för att studera infektion av celler i suspension 16. Analysen kan även användas för undersökning av andra bakterier eller bärare presenterar laktamas på sin yta, vilket leder till ett brett spektrum av applikationer. Till exempel, kan detta tillvägagångssätt användas för att studera vakuolär bristning inducerad av andra patogener som β-laktamas uttryckande Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes eller Salmonella typhimurium 12. Eftersom Listeria monocytogenes har en kort infektionscykel jämförbar med Shigella flexneri, tidsförlopp experiment är möjliga. Däremot eftersom Legionella pneumophila och Salmonella typhimurium display långa cykler infektion, föreslår vi att utföra experiment slutpunkt.
Mångfalden av möjliga tillämpningar gör CCF4-AM/β-lactamase analysen enintressant fluorometrisk metod för att spåra vakuolär bristning induceras av intracellulära patogener i fasta prover eller i realtid.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Agence Nationale pour la Recherche och av Europeiska forskningsrådet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in - 80 ° aliquots |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
| μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecid | Sigma | P8761 | |
| β-lactamase | Sigma | P0389 |
References
- van der Goot, F. G., Gruenberg, J. Intra-endosomal membrane traffic. Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).
- Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation. Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).
- van der Wel, N., et al. M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell. 129, 1287-1298 (2007).
- Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51, 461-469 (1986).
- Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).
- Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).
- Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles. Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).
- Zlokarnik, G., et al. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science. 279, 84-88 (1998).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).
- Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability. Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).
- Ray, K., et al. Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time. Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).
- Blocker, A., et al. The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes. J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).
- Mounier, J., et al. The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells. PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).
- Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).
- Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry. Virulence. 2, 54-57 (2011).
- Simeone, R., et al. Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).
