Summary
We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire bacteriën
Abstract
Shigella flexneri zijn pathogene bacteriën die gastheercellen aangaan van een endocytische vacuole binnenvallen. Vervolgens, de breuk van het membraan-omsloten ruimte laat bacteriën om binnen het cytosol, prolifereren en verdere naburig cellen. Mycobacterium tuberculosis wordt gefagocyteerd door immuuncellen, en is onlangs aangetoond breuk phagosomal membraan macrofagen. We ontwikkelden een stevige test voor het bijhouden phagosomal membraanverstoring na gastheercel binnenkomst van Shigella flexneri of Mycobacterium tuberculosis. De aanpak maakt gebruik van CCF4, een FRET reporter gevoelig β-lactamase dat evenwicht bereikt in het cytosol van gastheercellen. Bij invasie van gastheercellen door bacteriële pathogenen, de probe intact blijft zolang de bacteriën bevinden in membraan-omsloten compartimenten. Na onderbreking van de vacuole, β-lactamase activiteit op het oppervlak van het intracellulaire pathogeen splitst CCF4 direct leidenING een verlies van FRET signaal en schakelen haar emissiespectrum. Deze robuuste ratiometric assay levert nauwkeurige informatie over de timing in vacuolen breuk veroorzaakt door binnendringende bacteriën, en het kan worden gekoppeld met automatische microscopie en beeldverwerking door gespecialiseerde algoritmen voor de detectie van de emissiesignalen van de FRET donor en acceptor. Verder staat het onderzoeken van de dynamica in vacuolen onderbreking opgewekt door intracellulaire bacteriën in real time in enkele cellen. Ten slotte is het uitermate geschikt voor high-throughput analyse met een ruimtelijke resolutie dan eerdere methodes. Hier bieden wij de experimentele gegevens van voorbeeldige protocollen voor de CCF4 vacuole breuk assay op HeLa-cellen en THP-1 macrofagen voor time-lapse experimenten of eindpunten experimenten met Shigella flexneri evenals meerdere mycobacteriële stammen zoals Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, en Mycobacterium tuberculosis.
Introduction
Tal van bacteriële pathogenen worden geïnternaliseerd in de membraan-ingesloten compartimenten van eukaryote cellen tijdens hun verloop van de infectie. Celinvoer wordt hetzij via fagocytose door gespecialiseerde gastheercellen, zoals het geval is voor Mycobacterium tuberculosis die worden opgenomen door macrofagen, of pathogenen actief hun opname induceren in het algemeen niet-fagocytische cellen. Bij geïnduceerde opname, bijvoorbeeld Shigella flexneri, het pathogeen injecteert effector eiwitten in de gastheer cytosol dat kapen onder andere celfuncties het strikt gereguleerde endomembraan sortering machines resulteert in bacteriële binding met een endosomale compartiment 1,2. Vervolgens, Shigella verstoort de omsluitende membraan leidt tot vacuole scheuren en cytosole toegang van het pathogeen bemoeien met gastheer membraan mensenhandel en het vermijden van levering aan het lysosoom. Meer recent heeft phagolysosomal breuk ook gevonden als infectie strategie gebruikt door Mycobacterium tuberculosis, een pathogeen die is dacht lange tijd uitsluitend gelokaliseerd in een membraangebonden compartimenten 3,17.
Om dynamische subcellulaire membraantransport van invasieve pathogenen te onderzoeken, hebben grote verbeteringen bereikt, aangezien de transmissie elektronenmicroscopie (TEM) studies op basis van de late jaren 1980 4,5. Bijvoorbeeld, fluorescentie microscopie gebaseerde methoden met behulp van kleurstoffen, antilichamen tegen bacteriële oppervlakte-onderdelen, of markers voor co-localisatie met subcellulaire compartimenten overnam 6,7. Echter, ze nog steeds niet toegeven precieze tijd-ruimtelijke resolutie en de robuustheid te vacuolaire breuk kwantitatief te meten door bacteriële pathogenen.
Deze hindernis is aangepakt met een test gebaseerd op de verkregen cefalosporine CCF4-AM FRET reporter die werd gebruikt om genexpressie te bestuderen 8. Vervolgens werd in het kader van infeel biologie tot effector secretie onderzoeken en om de opname van Neisseria volgen in gastheercellen 9,10,11. We ontwikkelden een test te maken van deze reporter voor het bestuderen vacuole breuk veroorzaakt door Shigella flexneri 12 en Mycobacterium tuberculosis 17. Het principe van onze werkwijze is beschreven in figuur 1 met Shigella flexneri. Eerst worden gastheercellen geladen met de FRET CCF4-AM substraat dat wordt gevangen in het cytoplasma na het afsplitsen van de AM esterresten. Vervolgens worden cellen geïnfecteerd met Shigella flexneri. β-lactamase op het oppervlak van de bacteriën kan splitsen de CCF4 substraat zodra vacuolaire breuk optreedt. Dit leidt tot een verlies aan FRET signaalschakeling de emissie piek van 535 nm tot 450 nm na excitatie van de probe bij 405 nm. De ratiometrische meting van de 450/535 nm intensiteiten belicht vacuole integriteit: lage ratio's weerspiegelen membraan-engesloten of extracellulaire bacteriën terwijl hoge verhoudingen weerspiegelen contact tussen bacteriën en de gastheer cytosol. Wij rapporteren tevens een aanpassing van deze methode voor het bestuderen phagosomal breuk veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis in THP-1 macrofagen. De experimentele principes blijven hetzelfde maar de volgorde omgekeerd, CCF4-AM belasting wordt aangebracht na bacteriële infectie.
Dus door kwantitatieve ratiometric fluorescentiemetingen op enkele cel niveau, de vacuolaire breuk van Shigella flexneri kan worden gevolgd in real time en vaste monsters afkomstig van verschillende celtypen 12,13,14. Bovendien kan deze methode worden aangepast om een aantal andere invasieve pathogenen in deze studie met Mycobacterium bovis en Mycobacterium tuberculosis. Ten slotte is de miniaturisering van ons protocol tot 96 goed (of 384 goed) formaat maakt screening van tal van omstandigheden bij hoge doorvoer.
Protocol
De test werkt in verschillende formaten, maar we raden afbouw van het monstervolume naar reagentia, met name CCF4-AM slaan. Daarom wordt het volgende protocol beschreven voor vaste HeLa cellen of THP-1 macrofaag-achtige cellen in een 96 putjes, vervolgens voor levende HeLa-cellen in 35 mm met glazen bodem gerechten. De test kan worden aangepast voor andere pathogenen. Naast Shigella infectie, beschrijven we de test voor THP-1 fagocytose verschillende m y cobacterial stammen.
Belangrijk na CCF4-AM loading, alle reagentia en buffers zoals wasbuffers vereisen de aanwezigheid van 1 mM probenecide op. Probenecide is een anion kanaal remmer die cytosole behoud van CCF4 promoot in alle stappen van het protocol. Vaste monsters worden verkregen binnen een paar uur na het experiment omdat het CCF4 signaal niet stabiel gedurende lange perioden.
1. CCF4 Assay op vaste monsters met behulp van Shigella flexneri (96 Well Plates)
- Voorbereiding bacteriën voor overnachting culturen. Inoculeer de bacteriële pre-cultures wildtype (M90T Afai) en mutant (BS176 Afai) stammen 1 dag vóór infectie in 8 ml tryptische soja bouillon caseïne (TCSB) gesupplementeerd met ampicilline (50 ug / ml) in een schudder bij 37 ° C gedurende de nacht .
- Plating cellen voor infectie. Zaad HeLa-cellen in 96 putjes 1 dag vóór infectie bij een dichtheid van 5 x 10 3 cellen per putje in DMEM met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 1% penicilline-streptomycine in 5% CO2 incubator in een eindvolume van 100 pl. In het geval van THP-1 macrofaag-achtige cellen, de plating 2 dagen vóór infectie uitgevoerd bij een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / putje, en worden geïncubeerd met 30 nM forbolmyristaatacetaat (PMA) in RPMI bevattende 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1% penicilline-streptomycine en 0,05 mM 2-mercaptoethanol.
- Voorbereiding bacteriën voor subcultuur. Inoculeren overnight bacterieculturenbij een 1/100 verdunning in TCSB aangevuld met 50 ug / ml ampicilline in een schudinrichting bij 37 ° C gedurende 2,5 uur (OD600 = 0,3-0,4).
- Laden cellen met CCF4-AM. Bereid de CCF4-AM loading mix voor een eindvolume van 25 ul per putje met 1 mM probenecide (Sigma), 1,5 pM CCF4-AM (6 uM in het geval van THP-1) en 1,25 gl geladen oplossing B (100 mg / ml Pluronic-F127 surfactant in DMSO/0.1% azijnzuur, evenals CCF4-AM LiveBlazer Laden met Kit van Invitrogen) in EM buffer (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM glucose, 25 mM HEPES bij pH 7,3). Was de cellen eenmaal met PBS en voeg 25 ul van CCF4-AM loading mix per put bij kamertemperatuur in het donker gedurende 2,5 uur.
- Voorbereiding bacteriën voor besmetting. Draai 1 ml bacteriële subcultuur bij 9.000 rpm gedurende 1 minuut. Was eenmaal met 500 ui PBS, centrifugeren op 9000 rpm gedurende 1 min en resuspendeer in 500 ul PBS gesupplementeerd met 10 ug / ml poly-L-lysine (Sigma) en 40 ug / ml β-lactatiemase (Sigma). Na 10 min incubatie op een roterend wiel bij kamertemperatuur, was eenmaal met 500 pi PBS en resuspendeer bacteriën in 500 ul buffer EM / 1 mM probenecide.
- Cel infectie en fixatie. Was de cellen eenmaal met 150 ul PBS / 1 mM probenecide, bereidt een mengsel van 10 gl bacteriën geresuspendeerd in een eindvolume van 100 ui buffer EM / 1 mM probenecide en te verspreiden naar elk putje. Na 15 minuten incubatie in het donker bij kamertemperatuur, schakelt de plaat tot 37 ° C gedurende 1 uur (90 min in het geval van THP-1), wassen met 150 ul PBS / 1 mM probenecide en bevestig met 50 pi 4% paraformaldehyde / 1 mM probenecid gedurende 10 min in het donker. Vervolgens wassen met 150 ul PBS / 1 mM probenecide, incubeer 30 min met 30 ui 10 uM kernen kleurstof Draq5 (Biostatus), wassen met 150 ul PBS / 1 mM probenecide en laat monsters in 100 ul PBS / 1 mM probenecide.
- Acquisitie instellingen van vaste monsters. Acquisitie wordt uitgevoerd hetzij met behulp van (i) een omgekeerde epifluorescente microsomgaan met een 20x (0.5 Numerieke opening (NA), 2.1 werkafstand (WD)) of 40x (0,75 NA, 0,72 WD) N-Plan lucht objectieve of (ii) met behulp van een confocale microscoop met een 10x objectief. Fluorescentie beeldvorming wordt uitgevoerd met excitatie bij 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) en emissie via 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) en 535 nm filters (Semrock, ontdekt FF01-520/35- 25) met belichtingstijden van 5 msec (uitgezonden licht), 1000 msec (535 nm) en 500 msec (450 nm). Confocale beeldvorming wordt uitgevoerd met de volgende belichtingstijd: 240 msec (450 nm) en 360 msec (535 nm) van de 405 nm laser (870 μW), 640 msec (Draq5) voor de 640 nm laser (2560 μW).
- Post-acquisitie-analyse. Vervolgens worden de beelden geanalyseerd door een computeralgoritme dat de geautomatiseerde scoring van het fluorescentiesignaal voor elke afzonderlijke cellen mogelijk maakt. Software zoals Metamorph 7.1 of Acapella kunnen worden gebruikt om een script voor het meten van de verhouding tussen de 450 nm en 535 nm emissie signalen (op aanvraag). Opmerkelijk, het gebruik van een focus kalibreerinrichting gekoppeld met geautomatiseerde microscopie met de verkoop kan verwerven tientallen verschillende posities in meerdere putjes tegelijk.
2. CCF4 Assay op Live Monsters gebruik Shigella flexneri (35 mm Glas-bottom-formaat, MatTek)
- Voorbereiding bacteriën voor overnachting culturen. Ga als eerder beschreven.
- Plating cellen voor infectie. Zaad HeLa-cellen in 35 mm met glazen bodem kweekschalen (MatTek 10 mm Microwell, MatTek corporation) 1 dag voor infectie bij een dichtheid van 2 x 10 5 cellen / schaal in een eindvolume van 2 ml.
- Voorbereiding bacteriën voor subcultuur. Ga als eerder beschreven.
- Laden cellen met CCF4-AM. Bereid de CCF-AM loading mix zoals eerder beschreven voor een eindvolume van 2 ml per schaal. Voor het laden, was de cellen eenmaal met PBS.
- Voorbereiding bacteriën voor besmetting. Ga als eerder beschreven.
- Acquisition instellingen van levende monsters. Acquisitie wordt uitgevoerd gedurende 60 min om de 90 sec met een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop behulp van een 20x (0.5 NA, 2.1 WD) of 40x (0,75 NA, 0,72 WD) N-Plan lucht doelstelling in een 37 ° C verwarmen kamer. Fluorescentie beeldvorming wordt uitgevoerd met excitatie bij 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) en emissie via 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) en 535 nm filters (Semrock, ontdekt FF01-520/35- 25) met belichtingstijden van 5 msec (uitgezonden licht), 200 msec (535 nm) en 100 msec (450 nm).
- Cel infectie en live acquisitie. Was de cellen eenmaal met 2 ml PBS / 1 mM probenecide, voeg 2 ml EM / 1 mM probenecide, monteer de schotel op het podium van de microscoop en start de acquisitie. Na 6 min (tijd punt 4), zet de overname in de wacht, voeg 250 ul van bacteriën resuspensie op de top van de cellen en herstart de overname.
- Post-acquisitie-analyse. Films kunnen worden gevisualiseerd met behulp van Metamorph of ImageJ. 450/535 nm intensiteitsverhoudingen voor elke individueledual cel kan worden verkregen met behulp van ImageJ. Zoals eerder vermeld, het gebruik van een focus kalibreerinrichting gekoppeld met geautomatiseerde microscopie met de verkoop kan verwerven meerdere verschillende posities afhankelijk van de time-lapse.
3. CCF4 Assay op vaste monsters met behulp van Mycobacteriën (96 Well Format)
- Voorbereiden van bacteriën. Groeien mycobacteriële stammen tot mid-log fase 7H9 albumine bevattende dextrose catalase (ADC) bij 30 ° C (voor Mycobacterium marinum) of 37 ° C (voor Mycobacterium bovis BCG en Mycobacterium tuberculosis).
- Plating cellen voor infectie. Plaat THP-1 macrofagen 2 dagen vóór infectie te incuberen met 30 nM PMA in RPMI bevattende 10% foetaal kalfsserum (FCS), 1% penicilline-streptomycine en 0,05 mM 2-mercaptoethanol in een 5% CO2 incubator in een eindvolume van 100 pl bij een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / putje.
- Voorbereiding bacteriën voor besmetting. Harvest culturen, wassen en resuspendeer met PBS voordat sonicatie en filtratie door een spuit om klonteren voorkomen. Bepaal de concentratie van elke stam door OD600 metingen en infecteren THP-1 cellen bij een MOI van 1:01 bij 30 ° C (voor Mycobacterium marinum) of 37 ° C (voor Mycobacterium bovis BCG en Mycobacterium tuberculosis) in RPMI medium met 5% CO 2. Na 2 uur werd medium verwijderd, was 3 maal met PBS en voeg vers compleet medium gedurende 1-2 dagen (bij Mycobacterium marinum) of 3-7 dagen (bij Mycobacterium bovis BCG en Mycobacterium tuberculosis).
- Laden cellen met CCF4-AM en fixatie. Was de cellen eenmaal met PBS en voorbereiden CCF4-AM loading mix zoals eerder beschreven voor een eindvolume van 25 ul per putje met behulp van een AM-CCF4 eindconcentratie van 6 uM. Loading plaatsvindt bij kamertemperatuur in het donker gedurende 2 uur daarna wassen met 150 ul PBS / 1 mM probenecide en oplossenatie met 50 gl paraformaldehyde bij 4% aangevuld with1 mM probenecid gedurende 30 min in het donker. Daarna wassen met 150 ul PBS / 1 mM probenecide en laat monsters in 100 ul PBS / 1 mM probenecide.
- Acquisitie instellingen en post-acquisitie-analyse. Ga te werk zoals eerder in de eerste paragraaf met Shigella flexneri beschreven.
Aanvullend protocol
Fluorimetrische testen worden uitgevoerd om β-lactamase activiteit controleren op het oppervlak van bacteriën. Dit moet voor elke bacteriële stam bedoeld voor gebruik in de test beschreven. Daartoe worden gewassen bacteriën in contact gebracht met 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 ug / ml varkens esterase lever extracten (sigma) in 1 ml PBS gedurende 1 uur bij 37 ° C in het donker. Oplosbare lactamase 1 mg / ml (Invitrogen) kan als een positieve controle. Vervolgens wordt een emissie-scan uitgevoerd bij 405 nm excitatie met behulp van een PTI Quantamaster fluorimeter en een 1 ml quartz cuvet. Het verlies van FRET bij 535 nm en de verschijning van een hoge 450 nm piek gevisualiseerd op bacteriën naast de CCF4 probe.
Representative Results
De CCF4-AM/β-lactamase benadering is een robuuste en gevoelige methode voor het volgen vacuolaire breuk van intracellulaire pathogenen zoals Shigella flexneri (figuur 1). De Shigella stammen die worden gebruikt in deze studie worden genoemd M90T Afai en BS176 Afai. M90T Afai een Shigella flexneri stam die het adhesine AfaE, die efficiënt kunnen binden CD55 op het oppervlak van epitheelcellen 15 wijst. Daarom AfaE expressie stammen weer veel hoger invasie vermogen vergeleken met het wildtype stam M90T in epitheelcellen. BS176 AFAI is een AfaE uiten mutant Shigella flexneri stam verstoken van de Shigella virulentie plasmide. Deze soort is niet in staat om HeLa-cellen binnen te dringen. Desondanks deze stam is in staat om THP-1 cellen binnen te dringen omdat opname in deze cellijn alleen vertrouwen op de klassieke fagocytose en heeft een functionele type 3 secretie systeem niet nodig. Beide stammen expressie β-lactamaseEn weergave β-lactamase-activiteit op hun oppervlak door de aanwezigheid van de AfaE coderende plasmide. Bij HeLa cel infectie met de niet-invasieve stam BS176 Afai gedurende 1 uur werd het CCF4 FRET probe intact blijft, zoals weergegeven in figuur 2A door het groene licht (535 nm). Integendeel, de infectie met het virulente M90T AFAI stam gedurende 1 uur leidt tot een switch van signaal naar blauw (450 nm) aandacht voor de splitsing van de sonde in de cytosol. Om dit te kwantificeren, hebben we een script ontwikkeld voor Metamorph en Acapella software die geautomatiseerde detectie van cellen en de meting van de intensiteiten in de 535 en 450 nm kanalen voor de bepaling van de ratiometrische signaal mogelijk maakt. Zoals getoond in figuur 2B, kernen en cytosol van cellen zijn gesegmenteerd met de Draq5 kanaal. Vervolgens het algoritme is in staat om de 450 nm en 535 nm positieve celpopulaties detecteren van berekening van de verhouding tussen de twee intensiteiten voor elke cel die isweergegeven als een histogram in figuur 2C. Lage verhoudingen worden verkregen voor de mutante stam versus hoge ratio's voor de virulente stam. Hoewel deze representatieve infectie experiment werd verkregen middels confocale microscopie, wordt epifluorescentie microscopie ook geschikt voor deze taak figuren 3 en 4 tonen voorbeelden met 2 verschillende humane celtypes:. HeLa epitheelcellen en THP-1 macrofaag-achtige cellen. Na infectie met het virulente M90T AFAI Shigella stam gedurende 1 uur en 90 min voor HeLa-en THP-1-cellen, een switch van het signaal van groen (535 nm) naar blauw (450 nm) wordt waargenomen vergeleken met BS176 AFAI geïnfecteerde cellen (Figuren 3A en 4A). Het script ontwikkelen we MetaMorph detecteert rechtstreeks het CCF4 positieve populatie cellen en bereken de verhouding tussen de intensiteiten van 450 en 535 nm kanalen voor elke individuele cellen. Dan cellen worden geclassificeerd als een functie van hun verhouding met behulp van een macro ontwikped in Excel, waardoor dus histogrammen tonen de cel distributie. Zoals het geval was voor de andere script ontwikkeld voor Acapella is geweest, worden BS176 AFAI geïnfecteerde cellen gekenmerkt door een lage ratio's, terwijl M90T AFAI geïnfecteerde cellen vertonen een hoge ratio's met de MetaMorph algoritme op HeLa-cellen en THP-1 macrofagen (Figuren 3B en 4B) . Tenslotte, een aanpassing van deze werkwijze voor de studie van mycobacteriën wordt getoond in figuur 5. Mycobacterium bovis BCG verblijft in phagosome het hele verloop van het experiment, zoals blijkt uit de sterke 535 nm gedetecteerd gedurende het tijdsverloop van het experiment. In tegenstelling, Mycobacterium tuberculosis ontlokt phagosomal membraan breuk in THP-1 macrofagen na meer dan 3 dagen van infectie zoals benadrukt door een 450 nm signaal op 7 dagen van de infectie (figuur 5A en 5B). Met dezelfde algoritme als voor het bestuderen van de vacuole breuk door Shigella Mycobacterium tuberculosis geïnfecteerde cellen weer hoger 450/535 nm verhoudingen dan Mycobacterium bovis BCG na 7 dagen na infectie (figuur 5C en 5D).
Figuur 1. Regeling die het principe van de test voor het volgen CCF4-AM/β-lactamase Shigella flexneri vacuolaire scheuren. CCF4-AM vrij diffundeert door het plasmamembraan in het cytoplasma waar estergroepen worden afgesplitst door cytosolische esterasen produceren CCF4 anionen. Deze reactie voorkomt CCF4 uit het invoeren van een membraan ingesloten compartiment. Bij deze stap CCF4 ontlokt FRET bij 535 nm na excitatie bij 405 nm. De sonde blijft intact totdat β-lactamase uitdrukken bacteriën rupturue de endocytische vacuole. Bij deze stap, de FRET signaal verloren omdat CCF4 wordt gesplitst door β-lactamase waarvan een schakelaar emissie van 535 nm tot 450 nm na excitatie bij 405 nm.
Figuur 2. Tracking Shigella flexneri vacuole breuk met confocale microscopie. (A) na 2 uur en 30 min van CCF4-AM laden, worden HeLa-cellen geïnfecteerd met de β-lactamase uiten Shigella flexneri BS176 AFAI gemuteerde stam of de M90T AFAI virulente stam gedurende 1 uur en vaste met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten. Vervolgens worden kernen gekleurd met Draq5 en cellen worden afgebeeld met behulp van een confocale microscoop met een 10x objectief. Representatieve foto's werden gekozen met de volgende samengevoegde kanalen: het intact CCF4 sonde verschijnt bij 535 nm (green), wordt de gesplitste CCF4 sonde bij 450 nm (blauw). (B) Voorbeelden van foto's benadrukken het detectiesysteem van onze geautomatiseerde algoritme op de Acapella software. Segmentatie van de cellen (kernen + cytosol) wordt verkregen met behulp van de Draq5 kanaal. CCF4 positieve cellen worden verkregen met behulp van de 450 en 535 nm kanalen samengevoegd. (C) Histogram toont het resultaat van onze geautomatiseerde analyse op Acapella met Shigella flexneri BS176 AFAI gemuteerde stam of M90T AFAI virulente stam. De gemiddelde verhouding is de verhouding tussen de intensiteit van de 450 en 535 nm kanalen. hier grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Tracking Shigella flexneri vacuolair breuk in HeLa-cellen met behulp van epifluorescentiemicroscopie. (A) na 2 uur en 30 min van CCF4-AM laden, HeLa cellen worden geïnfecteerd met de β-lactamase uiten Shigella flexneri BS176 AFAI gemuteerde stam of de M90T AFAI virulente stam gedurende 1 uur en gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten. Vervolgens worden cellen afgebeeld met een epifluorescentie microscoop met een 20x objectief. Representatieve foto's werden gekozen met de volgende kanalen:. CCF4 intacte sonde 535 nm (groen) en CCF4 gesplitste probe 450 nm (blauw) (B) Histogram vertegenwoordigt het resultaat van onze geautomatiseerde analyse op MetaMorph software. De afzonderlijke cellen zijn verdeeld in functie van de verhouding van de intensiteiten in de 450 en 535 nm kanalen.
> Figuur 4. Tracking Shigella flexneri vacuole breuk in THP-1-cellen met behulp van epifluorescentiemicroscopie. (A) na 2 uur en 30 min van CCF4-AM laden, THP-1 cellen worden geïnfecteerd met de β-lactamase uiten Shigella flexneri BS176 AFAI gemuteerde stam of de M90T AFAI virulente stam gedurende 1 uur 30 min en vast met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten. Vervolgens worden cellen afgebeeld met een epifluorescentie microscoop met een 20x objectief. Representatieve foto's werden gekozen met de volgende kanalen:. CCF4 intacte sonde 535 nm (groen) en CCF4 gesplitste probe 450 nm (blauw) (B) Histogram vertegenwoordigt het resultaat van onze geautomatiseerde analyse met behulp van de MetaMorph software. De afzonderlijke cellen zijn verdeeld in functie van de verhouding van de intensiteiten in de 450 en 535 nm kanalen.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg "/>
Figuur 5. Tracking Mycobacterium bovis BCG en Mycobacterium tuberculosis phagosomal breuk in THP-1 macrofagen met epifluorescentie microscopie. (A, B) THP-1 cellen geïnfecteerd met β-lactamase tot expressie Mycobacterium bovis BCG of Mycobacterium tuberculosis gedurende 2 uur en gedurende 3 tot 7 dagen . Na wassen worden de cellen geladen met CCF-4-uur 2 uur en vaste met 4% paraformaldehyde gedurende 30 min voor beeldvorming met een epifluorescentie microscoop met een 40x objectief. Representatieve foto's werden gekozen met de volgende kanalen: intact CCF4 sonde, 535 nm (groen); gekloofd CCF4, sonde 450 nm (blauw) (C, D) Histogrammen presentatie van de uitkomsten van onze geautomatiseerde analyse met behulp MetaMorph software.. Individuele cellen worden gedistribueerd als functie van de verhouding tussen de intensiteit van de 450 en 535 nm kanalen.
Discussion
De CCF4-AM/β-lactamase assay is een eenvoudige methode om vacuole verstoring veroorzaakt door intracellulaire Shigella flexneri en mycobacteriën in verschillende celtypen volgen. Het maakt gebruik van een cytoplasmatisch lactamase gevoelige FRET reporter die wordt gekliefd door een enzym actief op het oppervlak van de bacteriën.
Verlies van de CCF4-AM substraat gemakkelijk worden vermeden door toevoeging probenecid alle oplossingen na het laden van het substraat. Zoals aangetoond, kan de test worden aangepast aan meerdere celtypen (epitheelcellen, fagocytcellen) en formaten (96 goed, 35 mm glazen bodem gerechten, 6/12/24 putjes). Voor het gebruik van de 6/12/24 putjesplaat worden steriele dekglaasjes verdeeld onderaan elk putje voor het zaaien van de cellen. Aan het einde van het experiment worden dekglaasjes overgebracht objectglaasjes in fixeermiddel zoals verlengt Gold Antifade Reagent (Invitrogen). Zo het signaal stabiel langere perioden na de assayvergeleken met de 96 wells formaat waar monsters worden bewaard in PBS na fixatie. De hoge kosten van de CCF4-AM substraten dienen voor de bepaling van het monstervolume in aanmerking genomen. Daarom raden wij schaalvergroting ze naar beneden. Experimenten zijn duurder in 6/12/24 goed formaat, maar de signalen zijn stabiel gedurende dagen. Integendeel, experimenten goedkoper in de 96 putjes, maar monsters worden geanalyseerd op de dag van het experiment. Het is opmerkelijk dat live-experimenten ook bij de 96 goed of 384 goed formaat kan worden uitgevoerd. Dit maakt het uitvoeren levend experiment met tientallen condities tegelijkertijd (mutante bacteriën, MOI, plasmide of siRNA transfectie, chemicaliën etc.) met aantal posities per putje. Hoewel geschikt voor Shigella flexneri, we benadrukken dat "echte" real time of time-lapse experimenten zijn niet haalbaar voor mycobacteriën studies sinds de infectie cyclus overschrijdt meetbare concentraties van CCF4 die in het cytosol kan worden vastgehouden. VoorDaarom wordt het CCF4-AM substraat aangebracht op cellen na invasie bereikt.
In het geval MetaMorph software wordt gebruikt voor het verzamelen en analyseren, adviseren wij het gebruik van de module "scherm overname" die het mogelijk maakt het verwerven van een volledige 96/384 wells plaat met een gespecificeerde aantal beelden per put. Verder is de module "review screen data" maakt (i) het visualiseren van de gestikte beeld mozaïek van elk goed voor elk kanaal op hetzelfde moment op een grote "poster" en (ii) een lus een gespecialiseerde algoritme voor het meten van de intensiteiten in de 535 en de 450 nm kanalen. Ook al hebben we in staat om vacuole scheuren te meten door enkele bacteriën met behulp van time-lapse microscopie geweest, zouden we graag waarschuwen dat de enzymatische activiteit op het oppervlak van de individuele bacteriën varieert waardoor het moeilijk om precies aantal intracellulaire bacteriën en de effectiviteit van de vacuole correleren breuk.
Gezien de robuustheid van de test, is het geschikt voor hoge throughput benadert in 96 of 384 goed formats. We hebben ook met succes aangepast dit protocol voor FACS-analyse om de infectie van cellen te bestuderen in suspensie 16. De test kan ook worden gebruikt voor de behandeling van andere bacteriën of dragers lactamase presenteren op hun oppervlak, waardoor een breed scala van toepassingen. Bijvoorbeeld kan deze benadering worden gebruikt om vacuole scheuren veroorzaakt door andere pathogenen zoals β-lactamase tot expressie Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes of Salmonella typhimurium 12 bestuderen. Sinds Listeria monocytogenes heeft een korte infectiecyclus vergelijkbaar met Shigella flexneri, time-lapse experimenten mogelijk zijn. In tegenstelling, omdat Legionella pneumophila en Salmonella typhimurium beeldscherm lang infectie cycli, raden wij u aan het eindpunt experimenten uit te voeren.
De verscheidenheid aan mogelijke toepassingen maakt het CCF4-AM/β-lactamase assay eeninteressant fluorimetrische wijze van volgen vacuole breuk veroorzaakt door intracellulaire pathogenen in vaste monsters of in real time.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Agence Nationale pour la Recherche en door de European Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in - 80 ° aliquots |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
| μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecid | Sigma | P8761 | |
| β-lactamase | Sigma | P0389 |
References
- van der Goot, F. G., Gruenberg, J. Intra-endosomal membrane traffic. Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).
- Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation. Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).
- van der Wel, N., et al. M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell. 129, 1287-1298 (2007).
- Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51, 461-469 (1986).
- Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).
- Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).
- Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles. Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).
- Zlokarnik, G., et al. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science. 279, 84-88 (1998).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).
- Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability. Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).
- Ray, K., et al. Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time. Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).
- Blocker, A., et al. The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes. J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).
- Mounier, J., et al. The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells. PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).
- Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).
- Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry. Virulence. 2, 54-57 (2011).
- Simeone, R., et al. Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).
